專利名稱：冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌種分離方法，更具體的說涉及一種從蝙蝠蛾幼蟲活體上分離冬蟲夏草菌的方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，與天然人參、鹿茸并列為三大滋補(bǔ)品。其藥性溫和，一年四季均可食用，老、少、病、弱、虛者皆宜，比其他種類的滋補(bǔ)品有更廣泛的藥用價(jià)值.國內(nèi)外需求與日俱增。冬蟲夏草是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段 (無性型)和子囊孢子階段(有性型)。在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的冬蟲夏草菌種均為無性階段，其菌種的正確鑒定至關(guān)重要，故而其無性型問題特別引人關(guān)注。目前， 已報(bào)道的冬蟲夏草無性型菌種有22個(gè)學(xué)名，涉及13個(gè)屬。文中按國際植物命名法的規(guī)定， 分為兩類合格發(fā)表的新種名稱(6種)和不合格發(fā)表或作為異名的名稱(9種);文中按作者的謹(jǐn)慎判斷，又分為四類不可能是冬蟲夏草無性型的名稱(3種)、可能不是冬蟲夏草無性型的名稱(2種)、與冬蟲夏草的關(guān)系有待驗(yàn)證的名稱(12種)、目前可以確認(rèn)為冬蟲夏草無性型的名稱(6種)。近年來分子生物學(xué)方法多次被應(yīng)用于驗(yàn)證冬蟲夏草的無性型，在菌種驗(yàn)證方法上，全世界公認(rèn)的、最可靠的是按照柯赫法則(Koch’ s postulate)，分離的菌株經(jīng)過人工培養(yǎng)或接種昆蟲后能夠形成冬蟲夏草有性型子實(shí)體，產(chǎn)生子囊孢子，才可以確定其是冬蟲夏草的正確無性型。沈南英分離的菌株在人工培養(yǎng)基上，唯一能夠形成冬蟲夏草有性型子座，產(chǎn)生子囊孢子，并獲得專利(專利號(hào)ZL85101971)而可以確認(rèn)無疑是冬蟲夏草的正確無性型菌種，后來該菌種被確名為中國被毛孢菌。中國被毛孢與冬蟲夏草DNA指紋圖譜相似率高達(dá)96 %，而通過rDNA的ITS區(qū)段序列比較分析，多個(gè)獨(dú)立研究結(jié)果都支持該菌為冬蟲夏草的無性階段。另外，通過微循環(huán)產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)也支持中國被毛孢為冬蟲夏草的無性型。傳統(tǒng)的方法是孢子分離法和組織分離法，但這兩種方法都有一定的缺陷。孢子分離法要在野外獲得子囊孢子剛成熟的子實(shí)體很不容易，且收集程序繁雜、在其過程中極易污染，要獲得單個(gè)孢子更是困難。因此用該是方法分離培養(yǎng)很難獲得冬蟲夏草的純菌株。組織分離法不僅生長速度慢，且在分離過程中雜菌種類多、污染率極高，不易獲得冬蟲夏草的純菌株，正因如此，八十年代以來國內(nèi)多家單位各自分離出的菌株名稱不一、形態(tài)各異，但都認(rèn)為自已分離的是真正的冬蟲夏草菌株，真實(shí)情況卻是大多數(shù)報(bào)道的均非真正的冬蟲夏草菌，一時(shí)間，形成了嚴(yán)重的對(duì)冬蟲夏草菌無性階段菌種認(rèn)識(shí)的混亂局面。

發(fā)明內(nèi)容
通過研究發(fā)現(xiàn)，中國被毛孢菌生長緩慢，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落堅(jiān)硬，通過培養(yǎng)， 已多次在固體培養(yǎng)基上形成子座，光照處理后在子座上形成子囊孢子，這些人工培養(yǎng)產(chǎn)生的子囊果、子囊孢子被認(rèn)為與冬蟲夏草天然的子囊果、子囊孢子形態(tài)特征完全一樣。因此基本可以確認(rèn)中國被毛孢為冬蟲夏草的無性型。本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法，即從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌無性階段菌種。所述從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲，活體中分離中國被毛孢菌的具體步驟為
1)篩選感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體，體表消毒；
2)微創(chuàng)蝙蝠蛾幼蟲體表，將體表滲透出的體液置于平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
3)在8 18°C條件下培養(yǎng)9 16天，期間，汰除雜菌，留下蟲草菌繼續(xù)培養(yǎng)，得到中國被毛孢菌。所述步驟2)所述的平板培養(yǎng)基的配方為水1000毫升中、鮮馬鈴薯塊200g、葡萄糖200g、瓊脂20 g、蛋白胨15 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀0.5g、酵母粉5g，其中平板培養(yǎng)基的PH為6. 5 7。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌，一頭感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體，可多次用于分離培養(yǎng)冬蟲夏草菌的無性階段菌種。相對(duì)孢子分離法和組織分離法操作更加簡單，雜菌污染率低，節(jié)約生物材料，被提取過體液的蝙蝠蛾幼蟲通過繼續(xù)飼養(yǎng)，還可長出冬蟲夏草。實(shí)現(xiàn)了冬蟲夏草培育過程中生物繁殖材料的循環(huán)利用。


圖1 本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)的蝙蝠蛾幼蟲的出土 20天的蟲草； 圖2 野生感菌幼蟲出土 20天的蟲草；
圖3 本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)的蝙蝠蛾幼蟲的的子囊殼發(fā)育成熟的蟲草； 圖4 野生感菌幼蟲子囊殼發(fā)育成熟的蟲草。
具體實(shí)施例方式稱取鮮馬鈴薯塊200g、葡萄糖200g、瓊脂20 g、蛋白胨15 g、硫酸鎂0. 5 g、磷酸二氫鉀0. 5g、酵母粉5g ；先將馬鈴署切塊、加水煮熟過濾、取其濾液放人錐形瓶中，補(bǔ)足水至 1000毫升，再加入其他配料、搖勻，并加熱煮沸至瓊脂粉充分溶化后，分裝于三角瓶中，用棉塞和牛皮紙封口后，放入蒸汽消毒器中，在100 Ua壓強(qiáng)下，115°C高溫滅菌30 min，待降至室溫后取出，在超靜工作臺(tái)上、無菌條件下分裝至直徑為90mm的無菌玻璃空平皿中，蓋上蓋子，自然冷卻使其凝固后，得到平板培養(yǎng)基，于4°C冰箱保存待用。從海拔3800 4300多米的四川康定、石渠等地的冬蟲夏草人工培育基地，采集已經(jīng)感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾活幼蟲，作為供試材料。從已感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的背部中央，用75%的乙醇脫脂棉球局部消毒后，用銀針(中醫(yī)針炙用)輕輕刺破表皮，體液即滲出，將滲出的體液用接種針粘上在無菌條件下涂抹(即接種)于平板培養(yǎng)基上。將涂抹了帶菌活幼蟲體液的平板培養(yǎng)基置于8 18恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。3天后，每天觀察一次，及時(shí)汰除雜菌，10-16天后方在平板培養(yǎng)基的接種處形成深灰、繼而轉(zhuǎn)變成棕黃乃至黑色的中國被毛孢菌落。將分離出來的中國被毛孢菌，從平培養(yǎng)基板上轉(zhuǎn)入盛有與平板培養(yǎng)基配方及制作方法相同的培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)(三角瓶均為1000毫升)，置18°C條件下培養(yǎng)，移殖后2星期，始見接種體逐漸膨大且漸漸變黑，其上有極不發(fā)達(dá)短而稀疏的菌絲體。2個(gè)月后以接種體為中心形成直徑6-10mm的圓形、淺褐色菌落，并有深褐色色素滲入培養(yǎng)基內(nèi)。3個(gè)多月后，菌落直徑達(dá)1.8cm左右。此時(shí)，接種體中心呈黃褐色、菌落堅(jiān)硬，有稀疏平貼的纖細(xì)菌絲，進(jìn)而形成冬蟲夏草菌的分生孢子。用無菌水將其孢子洗下，配制成孢子懸浮液，將該菌液噴撒于剛進(jìn)入三齡期(即剛脫皮)幼蟲的體表，連續(xù)噴撒2次(中間間隔2 3小時(shí))后，將幼蟲放入養(yǎng)蟲盒中飼養(yǎng)；接種后再飼養(yǎng)一年左右，幼蟲即可發(fā)病僵化，形成僵蟲，接著萌生出幼芽，成長為子實(shí)體。將本發(fā)明分離的菌種接種蝙蝠蛾幼蟲，感菌、僵化、萌芽后出土 20天的蟲草與野生感菌幼蟲出土 20天的蟲草相對(duì)比，如圖1、2 ；將本發(fā)明分離的菌種接種蝙蝠蛾幼蟲，感菌、僵化、萌芽后長出子囊殼發(fā)育成熟的蟲草與野生感菌幼蟲長出子囊殼發(fā)育成熟的蟲草相對(duì)比，如圖3、4。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明得到的菌種接種、染菌蝙蝠蛾幼蟲獲得的冬蟲夏草與野生冬蟲夏草的形態(tài)特征及其子囊果、子囊孢子形態(tài)特征完全一樣。由此可以確認(rèn)本發(fā)明分離到的菌種為冬蟲夏草的無性階段中國被毛孢。分別稱取5000條/公斤級(jí)的本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)冬蟲夏草與野生冬蟲夏草10g，分別粉碎，檢測(cè)本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)冬蟲夏草的腺苷、17種氨基酸、甘
露醇和麥角留醇的含量。具體結(jié)果如表1所示。本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)冬蟲夏草和野生冬蟲夏草中的腺苷含量基本相同，甘露醇和麥角留醇的含量略低于野生蟲草，但是本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)冬蟲夏草中17中種氨基酸的均高于野生冬蟲夏草。
表1本發(fā)明篩選出的菌種染菌培養(yǎng)冬蟲夏草和野生冬蟲夏草樣品的有效成分及含量(g / mg)
權(quán)利要求
1.冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法，其特征在于從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌無性階段菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法，其特征在于所述從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體中分離中國被毛孢菌的具體步驟為1)篩選感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體，體表消毒；2)微創(chuàng)蝙蝠蛾幼蟲體表，將體表滲透出的體液置于平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；3)在8 18°C條件下培養(yǎng)10 16天，期間，汰除雜菌，留下蟲草菌繼續(xù)培養(yǎng)，得到中國被毛孢菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的冬蟲夏草菌無性階段菌種分離的方法，其特征在于所述步驟2)所述的平板培養(yǎng)基的配方為水1000毫升、馬鈴薯200g、葡萄糖200g、瓊脂20 g、蛋白胨15 g、硫酸鎂0. 5 g、磷酸二氫鉀0. 5 g、酵母粉5 g，其中平板培養(yǎng)基的PH為6. 5 7。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌無性階段菌種的方法；從感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體的體液中分離中國被毛孢菌，一頭感染中國被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體，可多次用于分離培養(yǎng)冬蟲夏草菌的無性階段菌種。相對(duì)孢子分離法和組織分離法操作更加簡單，雜菌污染率低，節(jié)約生物材料，被提取過體液的蝙蝠蛾幼蟲通過繼續(xù)飼養(yǎng)，還可長出冬蟲夏草。實(shí)現(xiàn)了冬蟲夏草培育過程中生物繁殖材料的循環(huán)利用。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102283022SQ20111020631
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者劉飛, 尹定華, 張德利, 曾緯, 李黎, 涂永勤, 羅慶明, 錢敏, 陳仕江, 馬開森 申請(qǐng)人:重慶市中藥研究院