專利名稱：一種北冬蟲夏草菌種的選育制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及北冬蟲夏草人工栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種選育和制作北冬蟲夏草高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的方法。
背景技術(shù)：
北冬蟲夏草(Cordyceps militaris)，又名蛹蟲草，在真菌分類學(xué)上屬子囊菌亞門，核菌綱，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬，與冬蟲夏草(Cordycepssinensis)同為蟲草屬真菌的一種。蟲草屬真菌是寄生于昆蟲、蜘蛛或大團(tuán)囊屬植物的地下子實(shí)體上形成的一類蟲菌復(fù)合物的統(tǒng)稱。北冬蟲夏草是蟲草屬真菌的模式種，在野外主要寄主于鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的一些昆蟲的幼蟲和蛹上，中醫(yī)典籍記載它的功效為“味甘、性平，有益肺腎，補(bǔ)精髓，止血化痰”，與冬蟲夏草的功能一致。近年來，大量的研究也表明其所含的蟲草素是一種具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的物質(zhì)。因此北冬蟲夏草是一種極具開發(fā)前景的藥食兩用真菌。過去，由于北冬蟲夏草在野外產(chǎn)量稀少，其開發(fā)利用并沒有被人們所重視。但自上世紀(jì)九十年代末，其大規(guī)模人工培養(yǎng)獲得成功以來，其開發(fā)利用價值便越來越被人們認(rèn)識，所開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，市場需求也越來越大。北冬蟲夏草子實(shí)體人工高產(chǎn)栽培正日益成為具有重要經(jīng)濟(jì)價值的新興產(chǎn)業(yè)。目前，北冬蟲夏草子實(shí)體人工高產(chǎn)栽培的相關(guān)技術(shù)，仍處于發(fā)展創(chuàng)新階段，國家還沒有統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，對于該領(lǐng)域的生產(chǎn)單位來說，技術(shù)的進(jìn)步將直接影響到其經(jīng)濟(jì)效益和市場競爭能力。所以，北冬蟲夏草子實(shí)體人工高產(chǎn)栽培的相關(guān)技術(shù)的創(chuàng)新，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
北冬蟲夏草子實(shí)體人工高產(chǎn)栽培所涉及的技術(shù)領(lǐng)域的創(chuàng)新，目前主要包括種質(zhì)資源的創(chuàng)新，菌種選育、菌種保存和菌種制作方法的創(chuàng)新，栽培容器和栽培模式的創(chuàng)新，工廠化栽培和自動化栽培的設(shè)備創(chuàng)新等。其中，由于北冬蟲夏草屬于子囊菌，與大多數(shù)食用菌屬于擔(dān)子菌不同，它的能夠形成子實(shí)體的異核體菌絲具有更容易分解為同核體，從而不產(chǎn)子實(shí)體的特性，因此，北冬蟲夏草的菌種具有更容易退化的特點(diǎn)，有些菌種數(shù)代以后退化不能產(chǎn)子實(shí)體，而有些菌種甚至一代以后就退化不能產(chǎn)子實(shí)體了，而且這種退化，常常是從外觀上難以預(yù)測的，往往等到栽培以后才發(fā)現(xiàn)，給規(guī)?；a(chǎn)帶來極大的損失。目前，多數(shù)的生產(chǎn)企業(yè)只能憑有限的經(jīng)驗(yàn)，盡量減少損失。在北冬蟲夏草人工高產(chǎn)栽培的菌種技術(shù)方面，目前還沒有最有效解決問題的方法。
針對以上所述北冬蟲夏草人工高產(chǎn)栽培中的菌種技術(shù)難題，現(xiàn)有的技術(shù)主要分為三種第一種，菌種復(fù)壯法。其原理主要是將菌種回接到寄主上(如蠶蛹上)培養(yǎng)或在培養(yǎng)基中添加與寄主營養(yǎng)相類似的成分以盡量模擬野外培養(yǎng)條件培養(yǎng)北冬蟲夏草，然后再從中分離菌種，以期達(dá)到復(fù)壯菌種性狀的目的。這是最通常想到的方法，但這種方法對北冬蟲夏草菌種性狀的恢復(fù)實(shí)際上是很有限的，因?yàn)榈侥壳盀橹梗€未見報道有一種培養(yǎng)基或靠回接寄主就能有效阻止北冬蟲夏草菌種退化。
第二種，菌種保藏法。目前公認(rèn)最可靠的長久保存微生物菌種使之優(yōu)良性狀得以維持的方法是低溫液氮保存法，但這面臨的問題是，一方面一般生產(chǎn)單位并沒有液氮保存的條件和設(shè)備，另一方面液氮保存的菌種，以及液體石蠟等方法保藏的菌種，經(jīng)長期保藏后，在用于生產(chǎn)前，心須要有一個轉(zhuǎn)接活化、復(fù)壯的過程，該操作過程對于雙孢菇、平菇等大多數(shù)食用菌菌種而言，只是個時間問題，但對北蟲草而言，就是一個嚴(yán)肅的“轉(zhuǎn)接代數(shù)”問題，這本身也容易帶來菌種的退化。
第三種，野外不斷分離篩選新的菌種。大量的野外分離菌種的實(shí)踐表明，真正性狀優(yōu)良的菌種常常是可遇而不可求的，野外分離菌種只是不斷探求以獲得更好的菌種資源的途徑，而不是真正保持已得到的菌株的優(yōu)良性狀并將之穩(wěn)定而有效地運(yùn)用于生產(chǎn)的方法。
因此，現(xiàn)有技術(shù)雖能在一定程度上幫助減少生產(chǎn)過程中因菌種退化問題而帶來的生產(chǎn)損失，但對于北冬蟲夏草菌種退化的根本原因，即異核體分解，同核體積累的問題，并沒有找到有效的解決辦法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)不能有效解決北冬蟲夏草菌種中異核體分解，同核體積累而導(dǎo)致菌種退化不長子實(shí)體及菌種在培養(yǎng)過程中優(yōu)良性狀變異與丟失的問題而提供的一種有效篩選并優(yōu)化菌種優(yōu)良性狀、以及將之用于生產(chǎn)實(shí)踐，制作出穩(wěn)定可靠的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)北冬蟲夏草菌種的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種北冬蟲夏草菌種的選育制作方法，它包括以下步驟i選育從北冬蟲夏草子實(shí)體中分離子囊孢子單孢，進(jìn)行純培養(yǎng)，得子囊孢子單孢菌株，然后對得到的子囊孢子單孢菌株培養(yǎng)后對其結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行標(biāo)記編號、配對混合并培養(yǎng)使之產(chǎn)子實(shí)體，對不同配對培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)子實(shí)體產(chǎn)量與質(zhì)量的考察，從中選出最佳配對組合，即為所選育的菌株組合。
ii制作將上述選出的菌株組合分別擴(kuò)繁，然后按比例混合，即得菌種。
所述子囊孢子單孢菌株進(jìn)行配對時，必須選擇其無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分別為頭孢霉型和擬青霉型的菌株進(jìn)行配對。
在菌種制作過程中，混合時擬青霉型菌株的比例占30～90％。
本發(fā)明首先從北冬蟲夏草子實(shí)體中分離子囊孢子單孢，在適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)并擴(kuò)繁多管備用，此處所用的北冬蟲夏草子實(shí)體應(yīng)選用已知性狀優(yōu)良的子實(shí)體，從而從源頭上保證優(yōu)良性狀得以被采用，所用的菌株必須是子囊孢子單孢，即經(jīng)歷了有性生殖過程中的減數(shù)分裂而形成的單倍體孢子萌發(fā)形成的菌株；由于在減數(shù)分裂過程中，配對染色體上的基因要經(jīng)過重組，該過程也是生物物種性狀修復(fù)的一種途徑。
其次，在顯微鏡下觀察所得到的子囊孢子單孢菌株的無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，將無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分別為頭孢霉型的和擬青霉型的進(jìn)行標(biāo)記并編號，將所標(biāo)記的菌株分別取樣，配對混合后接種于米飯培養(yǎng)基或其它用來培養(yǎng)北冬蟲夏草子實(shí)體的培養(yǎng)基上，進(jìn)行北冬蟲夏草子實(shí)體的人工培養(yǎng)；配對的原則是頭孢霉型的子囊孢子單孢菌株必須與擬青霉型的子囊孢子單孢菌株配對；經(jīng)過40～60天的培養(yǎng)后，對不同配對培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)子實(shí)體的產(chǎn)量和質(zhì)量的考察，從中選出具有最佳子實(shí)體產(chǎn)量和質(zhì)量的配對組合，即為所選育得到的子囊孢子單孢菌株組合。
然后，將所得到的最佳配對的菌株組合分別擴(kuò)繁及保存，作為制作生產(chǎn)菌種的母種；每次制作生產(chǎn)菌種時，先將子囊孢子單孢菌株分別擴(kuò)繁(根據(jù)需要，在固體或液體培養(yǎng)基上擴(kuò)繁)，在接種到米飯培養(yǎng)基或其它培植子實(shí)體的培養(yǎng)基上之前，按適當(dāng)比例混合后運(yùn)用；兩種菌株的混合比例具有其個性，總體的規(guī)律是其中擬青霉型菌株所占的比例應(yīng)在30～90％。
本發(fā)明將代表不同核的兩種子囊孢子單孢菌株單獨(dú)培養(yǎng)，避免了培養(yǎng)過程帶來的同核體積累的問題，在制作生產(chǎn)菌種時，再將兩種子囊孢子單孢菌株混合，有效控制兩者的比例與平衡，從而保證生產(chǎn)菌種的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將野外采集或人工培養(yǎng)的具有成熟子囊殼的北冬蟲夏草子實(shí)體進(jìn)行表面消毒后，置于無菌的PDA培養(yǎng)平板的上方，放到溫度為20～25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待子囊孢子彈射到PDA培養(yǎng)基表面并萌發(fā)長成肉眼可見的微小菌落時，分別挑取單孢菌落轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)平板或試管中培養(yǎng)備用；此過程可通過顯微鏡輔助觀察，以觀察子囊孢子萌發(fā)的過程，并確保所挑取的為子囊孢子單孢菌落。
將所得到的子囊孢子單孢菌株，分別在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)并擴(kuò)繁后，取樣在顯微鏡下觀察各菌株的無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征，將無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分別為頭孢霉型的和擬青霉型的進(jìn)行標(biāo)記并編號，再將所標(biāo)記的菌株分別取樣，配對混合后接種于米飯培養(yǎng)基上，米飯培養(yǎng)基的配方為25克大米，35克水，高溫滅菌后備用。米飯培養(yǎng)基接種北冬蟲夏草菌種后，置于溫度為20～25℃的培養(yǎng)室中先避光培養(yǎng)3-5天，待菌絲初步長起來后，置于溫度為20～25℃的培養(yǎng)室中見光培養(yǎng)。培養(yǎng)40～60天后，對不同配對培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)子實(shí)體的產(chǎn)量和質(zhì)量的考察，從中選出具有最佳子實(shí)體產(chǎn)量和質(zhì)量配對組合，即為所選育得到的菌種的菌株組合。
將所得到的菌株組合分別在PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)繁及保存，作為制作高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)菌種的母種。每次制作生產(chǎn)菌種時，先將菌株組合分別擴(kuò)繁(可根據(jù)需要，在固體或液體培養(yǎng)基上擴(kuò)繁)，在接種到米飯培養(yǎng)基或其它培植子實(shí)體的培養(yǎng)基上之前，將兩者按照擬青霉型菌株占30％的比例混合后，即為所需要的菌種了。
實(shí)施例2將野外采集或人工培養(yǎng)的具有成熟子囊殼的北冬蟲夏草子實(shí)體進(jìn)行表面消毒后，置于無菌的倒有PDA改良培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板的上方，放到溫度為20～25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待子囊孢子彈射到PDA改良培養(yǎng)基表面并萌發(fā)長成肉眼可見的微小菌落時，分別挑取單孢菌落轉(zhuǎn)接到新的PDA改良培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板或試管中培養(yǎng)備用；此過程可通過顯微鏡輔助觀察，以觀察子囊孢子萌發(fā)的過程，并確保所挑取的為子囊孢子單孢菌落。所用的PDA改良培養(yǎng)基配方為200克馬鈴薯，20克蔗糖，3克蛋白胨，3克磷酸二氫鉀，1.5克硫酸鎂，10毫克維生素B1，1000毫升水。固體培養(yǎng)基另加20克瓊脂。
將得到的子囊孢子單孢菌株，分別在PDA改良培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)并擴(kuò)繁后，取樣在顯微鏡下觀察各菌株的無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征，將無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分別為頭孢霉型的和擬青霉型的進(jìn)行標(biāo)記并編號。再將所標(biāo)記的菌株分別取樣，配對混合后接種于米飯改良培養(yǎng)基上，米飯改良培養(yǎng)基的配方為25克大米，1克蠶蛹粉，0.5克酵母粉，1克土豆粉，38克水，高溫滅菌后備用。米飯改良培養(yǎng)基接種北冬蟲夏草菌種后，置于溫度為20～25℃的培養(yǎng)室中先避光培養(yǎng)3-5天，待菌絲初步長起來后，置于溫度為20～25℃的培養(yǎng)室中見光培養(yǎng)。培養(yǎng)40～60天后，對不同配對培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)子實(shí)體的產(chǎn)量和質(zhì)量的考察，從中選出具有最佳子實(shí)體產(chǎn)量和質(zhì)量的配對組合，即為所選育得到的菌種的菌株組合。
將所得到的菌株組合分別在PDA改良培養(yǎng)基上擴(kuò)繁及保存，作為制作生產(chǎn)菌種的母種；每次制作生產(chǎn)菌種時，先將菌株組合分別擴(kuò)繁(可根據(jù)需要，在固體或液體培養(yǎng)基上擴(kuò)繁)，在接種到米飯改良培養(yǎng)基或其它培植子實(shí)體的培養(yǎng)基上之前，將兩者按照擬青霉型菌株占90％的比例混合后，即為所需要的菌種了。
權(quán)利要求
1.一種北冬蟲夏草菌種的選育制作方法，其特征在于它包括以下步驟i選育從北冬蟲夏草子實(shí)體中分離子囊孢子單孢，進(jìn)行純培養(yǎng)，得子囊孢子單孢菌株，然后對得到的子囊孢子單孢菌株培養(yǎng)后對其結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行標(biāo)記編號、配對混合并培養(yǎng)使之產(chǎn)子實(shí)體，對不同配對培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)子實(shí)體產(chǎn)量與質(zhì)量的考察，從中選出最佳配對組合，即為所選育的菌株組合；ii制作將上述選出的菌株組合分別擴(kuò)繁，然后按比例混合，即得菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北冬蟲夏草菌種的選育制作方法，其特征在于所述子囊孢子單孢菌株進(jìn)行配對時，必須選擇其無性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分別為頭孢霉型和擬青霉型的菌株進(jìn)行配對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北冬蟲夏草菌種的選育制作方法，其特征在于菌種制作過程中，混合時擬青霉型菌株的比例占30～90％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種北冬蟲夏草菌種的選育制作方法，它首先從北冬蟲夏草子實(shí)體中分離子囊孢子單孢，進(jìn)行純培養(yǎng)，得子囊孢子單孢菌株，然后對得到的子囊孢子單孢菌株培養(yǎng)后對其結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行標(biāo)記編號、配對混合并培養(yǎng)北冬蟲夏草子實(shí)體，對不同配對培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)子實(shí)體產(chǎn)量與質(zhì)量的考察，從中選出最佳配對菌株組合；再將菌株組合分別擴(kuò)繁，按比例混合，即得菌種。本發(fā)明將代表不同核的兩種子囊孢子單孢菌株單獨(dú)培養(yǎng)，避免了培養(yǎng)過程帶來的同核體積累的問題，在制作生產(chǎn)菌種時，再將兩種子囊孢子單孢菌株混合，有效控制兩者的比例與平衡，從而保證生產(chǎn)菌種的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定。
文檔編號C12N1/14GK1995321SQ20061014833
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者高新華, 吳畏, 沈明, 陳偉, 張紅霞 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院