專利名稱：擬南芥基因myb73在植物抗核盤病方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種擬南芥基因MYB73在抗核盤病方面的應用，尤其涉及該基因MYB73在抗核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)方面的應用，同時還涉及該基因MYB73在培育抗核盤菌轉基因植物品種方面的應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
長期以來，病原菌的侵染是造成作物產(chǎn)量巨大損失的主要原因。而植物不是被動的等待病原菌的侵染，而會產(chǎn)生一系列的抗病防御反應，如合成植物保衛(wèi)素、產(chǎn)生水解酶及ー些抗菌蛋白來抵抗病原菌的侵入。利用分子生物學理論和技術從分子水平上研究植物和病原菌的相互作用機制為病害防治開辟了新的途徑和廣闊的領域，利用基因工程技術了解植物抗病的分子機制對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康均具有重要的意義。水楊酸、茉莉酸和こ烯等信號轉導系統(tǒng)在植物細胞中廣泛存在，它們參與植物的抗病脅迫反應。在細菌/活體型病原菌侵染植物時，激發(fā)植物體內(nèi)水楊酸信號途徑，誘導植物體內(nèi)水楊酸信號途徑標記基因PRl的表達；在死體型病原菌侵染植物時，激發(fā)植物體內(nèi)茉莉酸信號途徑，誘導植物體內(nèi)茉莉酸信號途徑標記基因roFl. 2的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在MYB家族中，MYB30是擬南芥抗細菌的正調(diào)控因子，與植物磷脂酶相互作用(Froidure et al，2010) ；MYB72是擬南芥根部關鍵的調(diào)節(jié)因子，根際有益的細菌誘導MYB72表達，激發(fā)擬南芥產(chǎn)生抗病性(Segarra et al，2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，MYB73是擬南芥抗細菌的負調(diào)控因子，同時與抗病相關基因PRl和I3DFl. 2的表達呈負相關關系，隨著抗病突變體的篩選和分離，為人們認識植物抗病反應機制提供新的研究思路?，F(xiàn)有研究表明，誘導植物體內(nèi)的胼胝質(zhì)沉積可以激發(fā)植物體內(nèi)的基礎抗病反應(Clay et al，2009)，MYB73基因是植物體內(nèi)MYB轉錄因子家族的成員之一，在myb73突變體受到Pst DC3000侵染時，胼胝質(zhì)的產(chǎn)量明顯高于野生型，表明MYB73可以調(diào)控植物體內(nèi)的胼胝質(zhì)產(chǎn)生，但其詳細機理還未見報道，因此，分析MYB73基因的功能，并研究其與抗病的關系，具有重要的理論依據(jù)和實際應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
I.本發(fā)明的目的在于提供了擬南芥基因At4g37260在植物抗核盤菌方面的應用，以拓展基因的應用范圍。2.本發(fā)明提供了ー種擬南芥基因At4g37260在培養(yǎng)抗核盤菌轉基因植物方面的應用。3.為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了擬南芥基因At4g37260的T-DNA插入突變體，研究該基因在核盤菌刺激下對抗病基因表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)，該基因在植物抗核盤菌方面作用顯著。4.所述的基因At4g37260編碼的⑶S全長為960bp，編碼320個氨基酸的蛋白，該蛋白為MYB家族的一個轉錄因子。
5.所述的At4g37260基因編碼的蛋白在細胞內(nèi)的定位未知。6.所述的At4g37260基因的突變體從擬南芥資源中心(ABRC，Ohio StateUniversity)獲得。7.本發(fā)明的技術方案涉及擬南芥基因At4g37260在培育抗核盤菌轉基因植物方面的應用。8.將At4g37260基因超表達獲得了抗核盤菌脅迫的轉基因植物。9.本發(fā)明利用從擬南芥資源中心獲得At4g37260的T-DNA插入突變體，研究發(fā)現(xiàn)該基因?qū)吮P菌脅迫敏感10.本發(fā)明編號為At4g37260的基因編碼MYB家族的一個轉錄因子，該基因的超表達突變體對核盤菌不敏感，表現(xiàn)出顯著的抗病現(xiàn)象。
11.本發(fā)明利用real time PCR技術檢測4周齡的擬南芥(Wt)和突變體(myb73)在接種核盤菌0，12，24，36，48小時后，抗病相關基因I3DFl. 2和NPRl基因的表達變化。12.本發(fā)明通過對At4g37260基因功能的分析鑒定，確立了 At4g37260在植物抗核盤菌中的作用和調(diào)節(jié)機制，為培育抗核盤菌的轉基因作物新品種奠定了理論和生產(chǎn)實踐基礎。13.本發(fā)明從擬南芥At4g37260的T-DNA插入突變體中明確該基因為抗核盤菌的相關基因，并通過超表達獲得抗核盤菌的突變體，為獲得抗病作物新品系提供了遺傳學材料和基礎。


圖I為擬南芥(Wt)和突變體(myb73)接種Pst DC3000葉片發(fā)病情況。圖2為Wt和myb73接種Pst DC3000葉片病菌數(shù)量變化。圖3 為 Wt 和 myb73 接種 Pst DC3000 葉片的 Trypan Blue 染色。圖4為Wt和myb73接種Pst DC3000葉片DAB染色。圖5為MYB73基因的表達檢測圖6為Wt接種Pst DC3000不同時間后MYB73基因表達變化。圖7為Wt接種Pst DC3000不同時間后I3DFl. 2基因表達變化。圖8為Wt接種Pst DC3000不同時間后PRl基因表達變化。圖9為Wt、myb73和超表達突變體OE接種Pst DC3000植株發(fā)病情況。圖10為Wt、myb73和超表達突變體OE接種核盤菌植株發(fā)病情況。
圖11為Wt、myb73和超表達突變體OE接種核盤菌不同時間I3DFl. 2表達情況。
具體實施例方式實施例一擬南芥抗病突變體的篩選及抗病性分析為獲得抗病突變體，通過對4周齡的擬南芥接丁香假單胞桿菌(Pst DC3000) I. 5h后，利用基因芯片技術分析表達變化的基因，并在擬南芥ABRC庫中獲得相應基因的純合突變體，發(fā)明人對這些純合突變體接Pst DC3000后，發(fā)現(xiàn)明顯抗病突變體myb73 (圖I)，接菌4天后，野生型擬南芥的病菌數(shù)量為突變體的100倍(圖2)，利用Trypan Blue染色法，發(fā)現(xiàn)接菌2天后野生型上出現(xiàn)大面積壞死的病斑，而突變體葉片的壞死面積明顯少于野生型(圖3)，利用DAB染色法，發(fā)現(xiàn)突變體的葉片上產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)，且明顯高于野生型(圖4)。利用RT-PCR分析表明myb73突變體中T-DNA插入導致MYB73基因的表達量明顯下調(diào)
(5)。實施例ニ抗病相關基因的表達分析將Pst DC3000 接野生型擬南芥 0、0. 5、1. 5、4、12h 后，利用 Real time-PCR 技術分析發(fā)現(xiàn)，接菌后MYB73基因的表達量明顯下調(diào)(圖6)，且在I. 5h時降至最低，這說明MYB73基因在擬南芥抗Pst DC3000過程中起負調(diào)控作用，同時發(fā)明人分析了抗病相關基因PRl和PDF1. 2的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)roFl. 2基因在接菌I. 5h時表達量達到最大(圖7)，PRl基因在接菌0. 5h時表達明顯增加，I. 5h時也維持在ー個相當高的水平(圖8)，這說明MYB73
基因與抗病相關基因PRl和I3DFl. 2的表達呈負相關關系。實施例三MYB73基因超表達突變體的表型分析MYB73基因的⑶S區(qū)首先被克隆經(jīng)pMD-19 simple載體上，然后利用Xba I和BamHI將MYB73基因的CDS區(qū)切出，并應用Xba I和BamH I將MYB73基因的CDS區(qū)連接連接至載體PCAMBIA1300的Xba I和BamH I酶切位點之間。該載體含有CaMV 35S啟動子，可驅(qū)動目的基因過量表達。含有MYB73基因的⑶S區(qū)的pCAMBIA1300載體利用農(nóng)桿菌蘸花的方法轉入擬南芥。將過量表達的myb73株系、突變體和野生型擬南芥在長日照下培養(yǎng)4周，用去針頭的注射器接Pst DC3000菌株3天，觀察其發(fā)病情況，結果如圖9所示，野生型擬南芥和過表達突變體接菌的葉片均表現(xiàn)為明顯的枯黃、萎蔫癥狀，而突變體只有輕微的黃化癥狀，這表明MYB73基因為抗病相關基因。實施例四MYB73基因的過表達突變體對核盤菌的抗病性分析如圖10所示，在光/暗周期為16/8h，溫度22°C，相対濕度為60%，光照強度為UOuEnT2S-1Cl的條件下生長4周后，分別對Wt、myb73和超表達突變體(OE)接種直徑為5mm的核盤菌菌盤，黑暗保濕24h，2天后觀察植株發(fā)病情況。試驗結果顯示，MYB73基因功能缺失,導致擬南芥對核盤菌更加敏感,而其超表達突變體對核盤菌抗性明顯增強,這些試驗結果表明MYB73是擬南芥抗核盤菌的重要基因，將MYB73超表達后，擬南芥對核盤菌的抗性增強。實施例五調(diào)節(jié)抗病相關基因表達當核盤菌侵入野生型擬南芥時誘導抗病相關基因roFl. 2表達逐漸増加，這說明死體型病原菌的侵入會誘導植物的茉莉酸信號轉導途徑，發(fā)病初期myb73突變體中TOF1. 2基因的表達量明顯高于野生型，到48h后myb73中TOF1. 2基因的表達變?yōu)榈陀谝吧?圖11)，這說明MYB73基因的功能缺失使擬南芥降低了對核盤菌的抗性，接菌48h后擬南芥野生型被核盤菌侵入且激發(fā)抗病信號途徑中I3DFl. 2基因表達迅速増加，在MYB73基因的超表達突變體中接菌48h也沒有激發(fā)roFl. 2基因表達明顯增加，這些結果表明MYB73基因的功能缺失導致擬南芥對核盤菌更加敏感，MYB73基因為擬南芥抗核盤菌的抗病基因。
權利要求
1.ー種擬南芥基因MYB73在植物抗核盤病方面的應用
2.根據(jù)權利要求I所述擬南芥基因MYB73在植物抗核盤病方面的應用，其特征在于所述的基因MYB73為編碼一種擬南芥轉錄因子MYB家族的基因，該基因的CDS長度為960bp，編碼320個氨基酸的蛋白。
3.根據(jù)權利要求I或2所述擬南芥基因MYB73在植物抗核盤病方面的應用，其特征在于所述的MYB73基因編碼ー個擬南芥轉錄因子，目前該基因在細胞內(nèi)的定位未知。
4.根據(jù)權利要求3所述擬南芥基因MYB73在植物抗核盤病方面的應用，其特征在于所述的MYB73基因從擬南芥資源中心(ABRC, Ohio State University)獲得。
5.ー種擬南芥基因MYB73在培育抗核盤病轉基因植株方面的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的擬南芥基因MYB73在培養(yǎng)抗病轉基因植物方面的應用，其特征在于將MYB73基因沉默獲得抗丁香假單胞桿菌/細菌的轉基因植物，將MYB73基因超表達獲得抗核盤菌/死體型病原真菌的轉基因植物。
全文摘要
菌核病是大豆、油菜等經(jīng)濟作物的重要病害，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)甚至絕收，引發(fā)嚴重的經(jīng)濟損失。本發(fā)明篩選獲得了對十字花科植物病害的核盤菌敏感突變體myb73，構建了MYB73基因(基因編號為AT4G37260)的超表達載體，通過農(nóng)桿菌轉化獲得了該基因的超表達突變體。實驗表明MYB73基因受病原菌誘導表達，負調(diào)控植物體內(nèi)抗病基因的表達，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)胼胝質(zhì)的產(chǎn)生，MYB73基因功能的分析和鑒定為獲得抗核盤菌轉基因植物新品種奠定了理論和生產(chǎn)實踐基礎。
文檔編號A01H5/00GK102864169SQ20111019076
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權日2011年7月8日
發(fā)明者賈嬌, 董金皋, 邢繼紅, 閆淑娟 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學