專利名稱：紅花玉蘭變種愈傷組織誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種組織培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)的方法，更具體的說涉及一種紅花玉蘭變種的愈傷組織誘導(dǎo)的方法。2.技術(shù)背景紅花玉蘭變種是木蘭科木蘭屬玉蘭亞屬中的一新發(fā)現(xiàn)樹種，系屬湖北省五峰縣紅花玉蘭變種野生類群之一，主要分布在五峰土家族自治縣境內(nèi)，分布區(qū)域較為狹窄。紅花玉蘭變種樹種的性狀較為獨(dú)特，與一般的玉蘭屬樹種相比，它的樹形高大，多為15-20m的高大喬木，花瓣為9瓣，內(nèi)外均為紅色，色彩純正艷麗，無論是遠(yuǎn)觀還是近看都極具觀賞價值。紅花玉蘭變種的發(fā)現(xiàn)對整個木蘭科植物的區(qū)系分類和系統(tǒng)發(fā)育等問題具有一定的學(xué)術(shù)意義，為研究生物多樣性提供了佐證，并且以極高的觀賞價值為依托，在道路和城市綠化方面具有極大的開發(fā)和應(yīng)用價值。紅花玉蘭變種是鄂西南特有樹種，數(shù)量稀缺，分布范圍狹窄，目前僅發(fā)現(xiàn)在湖北五峰中西部一片狹域的地帶，種群面臨滅絕危險，此外，由 于當(dāng)?shù)厝鄙儆行У馁Y源管理與保護(hù)措施以及人們對珍惜資源保護(hù)意識的淡薄，在利益的驅(qū)動下，一部分的紅花玉蘭大樹已被砍伐和倒賣，種質(zhì)資源流失嚴(yán)重。自然狀態(tài)下紅花玉蘭變種林下幼苗稀少，更新困難，種子發(fā)芽率和保存率都較低。因此，對紅花玉蘭變種無性繁殖的研究不僅可以進(jìn)行工廠化的生產(chǎn)育苗，提高紅花玉蘭變種的繁殖效率，降低生產(chǎn)成本，而且還可以篩選出有優(yōu)良性狀的無性系，滿足生產(chǎn)、觀賞所需，對紅花玉蘭變種科研、應(yīng)用價值的開發(fā)具有重要意義。3.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅花玉蘭變種愈傷組織誘導(dǎo)的方法。分別以紅花玉蘭變種的種子、腋芽、帶腋芽莖段和葉片為外植體供試材料接種于MS培養(yǎng)基上，選擇出最優(yōu)的外植體類型和取材時間，再以此類型為外植體篩選出其最優(yōu)滅菌消毒體系、最佳基本培養(yǎng)基和碳源，最優(yōu)初代培養(yǎng)基、抑制褐化體系和誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。本發(fā)明提出的紅花玉蘭變種愈傷組織誘導(dǎo)方法包括下述步驟(I)最優(yōu)外植體的選擇分別將剝?nèi)ネ夥N皮的種子、腋芽、帶腋芽莖段和葉片用清水和毛刷進(jìn)行外部清沽,然后再用20%的滴露消毒液浸泡30min后,置于流動水中沖洗Ih,完成初步滅菌工作。再將上述材料置于超凈工作臺中進(jìn)行進(jìn)一步的消毒處理(75%酒精30S，10% NaClO IOmin)和剪切處理，種子一般保留全部體積1/3左右的帶胚部分，腋芽和帶芽莖段重新切口，葉片一般取自帶中脈的的正方形部分，將處理后的實驗材料接種于MS+lmg · Ll-BA+lmg · T1NAA基本培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)。(2)外植體最優(yōu)取材時間的選擇2009年5月-10月的各月中旬，選擇晴朗無風(fēng)的天氣，于正午12點(diǎn)- 13點(diǎn)獲取最佳的外植體類型，接種于上述(I)培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)。(3)最優(yōu)滅菌體系的建立取健壯的帶芽莖段30個置于流動水中沖洗O. 5h，然后將其浸泡在20% “滴露”消毒液中15min，再用流動水沖洗lh，然后在超凈工作臺中用75%酒精進(jìn)行30S的初步滅菌，分別以似(10濃度5%、10%、15%、20%和滅菌時間lOmin，、20min，、30min進(jìn)行12完全隨機(jī)組合處理。最后將外植體接種于上述(I)MS基本培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)。(4)基本培養(yǎng)基及其碳源的選擇將經(jīng)過(3)步驟滅菌后的無菌外植體接種到一個1^(34)培養(yǎng)基實驗設(shè)計中正常培養(yǎng)，3個因素分別為基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、WPM)，碳源種類(果糖、鹿糖、白砂糖)，碳源濃度(15g、30g、40g)。(5)抑制褐化體系建立對紅花玉蘭變種的外植體進(jìn)行冷處理和浸泡聚乙烯吡咯烷銅(PVP)溶液處理，具體方法如下①將采回的嫩枝用濕沙布包好外植體的切口部分放在4°C下冷藏2h、4h后，切成莖段進(jìn)行滅菌處理。②將帶芽莖段在滅菌前放在lg/Lg -L-I的聚乙烯吡咯烷銅(PVP)溶液中浸泡lh、2h。③滅菌后的帶芽莖段在上述PVP的溶液中切割，接種。將紅花玉蘭變種外植體接種在添加了二硫蘇糖醇(O.Smg·!/1)、抗壞血酸 Vc (5mg · Γ1)和活性炭(2g · Γ1)的培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)，通過改變培養(yǎng)條件，控制外植體的褐變，具體方式如下①遮光處理。在25°C下暗培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。②低溫遮光處理。在15°C條件下遮光15天后轉(zhuǎn)入25°C的全光照下培養(yǎng)。(6)初代培養(yǎng)體系的建立將經(jīng)過前期外植體處理和滅菌后的帶芽莖段接種到添加了植物生長調(diào)節(jié)劑(細(xì)胞分裂素6-BA，生長素萘乙酸NAA)、吸附劑(AC)和抑制劑(Vc)的MS初代培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)。(7)愈傷組織的誘導(dǎo)將經(jīng)過初代培養(yǎng)的組培苗接種到不同含量的植物生長調(diào)節(jié)劑(細(xì)胞分裂素6-BA，KT,生長素NAA)誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)。上述步驟中正常培養(yǎng)的條件為室溫25±2°C，空氣相對濕度60%左右，光照強(qiáng)度為2000-30001x，光周期為光培養(yǎng)16h、暗培養(yǎng)8h。


圖I不同時間取材對帶芽莖段褐化率和成活率的影響
5.
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I.最佳外植體的選擇將滅菌的紅花玉蘭變種種胚、葉片、葉芽和帶芽莖段外植體分別接種于上MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)(表I)，帶芽莖段的成活率和萌動率較高，分別為80. 3^^75.6%,葉片、種胚、腋芽的成活率和萌動率均較低，分別為2 %，3 %，10. 6 %和O %，I. 3 %，5. 3 %。方差分析可知，帶芽莖段與其他三種外植體類型差異顯著，是紅花玉蘭變種組織培養(yǎng)外植體最佳類型。通過對帶芽莖段采集時間與褐化率關(guān)系分析可知，秋季9、10月份采集，外植體褐化現(xiàn)象減弱，通過成活率比較可知，9月份取材的成活率要高于10月份取材10%左右，因此，9月份取材可作為紅花玉蘭外植體最佳的取材時間。表I不同種外植體的生長情況比較)
權(quán)利要求
1.一種紅花玉蘭變種愈傷組織誘導(dǎo)的方法，其特征在于包括以下步驟分別以紅花玉蘭變種的種子、腋芽、帶腋芽莖段和葉片為外植體供試材料接種于MS培養(yǎng)基上，選擇出最優(yōu)的外植體類型和取材時間，再以此類型為外植體篩選出其最優(yōu)滅菌消毒體系、最佳基本培養(yǎng)基和碳源，最優(yōu)初代培養(yǎng)基、抑制褐化體系和誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述紅花玉蘭變種愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體為帶芽莖段，最優(yōu)取材時間為9月份。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述紅花玉蘭變種最優(yōu)消毒滅菌體系為以帶芽莖段為外植體，用75%酒精浸泡外植體30s后無菌水沖洗3-4次，然后以10% NaClO液浸泡IOmin再以無菌水沖洗4次。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述紅花玉蘭變種最佳基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,最佳碳源為30g. L—1的鹿糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，以下三種方法均可有效地抑制紅花玉蘭變種褐化 (1)在接種前將枝條浸在PVP溶液中切割或冷藏枝條4h； (2)向培養(yǎng)基中添加5mg.Γ1的抗壞血酸或2g. Γ1的活性炭； (3)在15°C條件下遮光培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)入25°C的全光照下培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述紅花玉蘭變種組織培養(yǎng)最優(yōu)初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2. Omg. L_1+NAA I. 5mg. L_1+VC 5mg. L_1L+AC 3mg. L'
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述紅花玉蘭變種組織培養(yǎng)最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 12mg. L_1+KT 5mg. L_1+NAA 2. 5mg. T10 6-BA 與 KT兩種植物調(diào)節(jié)劑結(jié)合使用誘導(dǎo)效果明顯高于單獨(dú)使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于，培養(yǎng)基均添加7g.L—1瓊脂，PH為5. 8-6. 0，高壓滅菌121°C 20min，培養(yǎng)條件為室溫25±2°C，空氣相對濕度60%左右，光照強(qiáng)度為2000-30001X，光周期為光培養(yǎng)16h和暗培養(yǎng)8h。
全文摘要
本發(fā)明涉及紅花玉蘭組織培養(yǎng)快速繁殖方法，提供一種紅花玉蘭變種愈傷組織誘導(dǎo)的方法。選取紅花玉蘭變種帶芽莖段作為最佳外植體，建立其最優(yōu)滅菌消毒體系和培養(yǎng)基，篩選出最優(yōu)的初代培養(yǎng)基和抑制褐化體系，誘導(dǎo)出紅花玉蘭變種的愈傷組織，為紅花玉蘭變種無性繁殖體系的建立奠定了基礎(chǔ)，對其科研、綠化和觀賞等應(yīng)用價值的開發(fā)具有重要意義。
文檔編號A01H4/00GK102860255SQ201110190088
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者馬履一, 懷慧明, 賈忠奎 申請人:北京林業(yè)大學(xué)