專利名稱：玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMIT1及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因 ZmMITl及其編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人口增長和工業(yè)化的發(fā)展，廢渣廢水的排放及礦山廢棄地的增加，加之各種化學(xué)物質(zhì)的廣泛使用，重金屬污染對人類健康和農(nóng)作物生產(chǎn)造成的危害日益突出。錳作為一種分布極其廣泛的重金屬，是植物生長發(fā)育必需的微量元素，直接參與植物光合作用中電子傳遞系統(tǒng)的氧化還原過程，但過量的錳會污染土壤，對植物生長發(fā)育造成脅迫和毒害。 目前，錳毒已成為酸性土壤中作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要限制因子。國內(nèi)外學(xué)者對植物耐受錳毒機制進行了大量研究，歸納起來主要有以下三個方面第一，有機化合物螯合作用(Plant Soil，1996，180 :57-66)。根系分泌的有機酸等有機物通過螯合重金屬或酸化根際來促進土壤重金屬的溶解和根系的吸收。其中，有機物對金屬的螯合作用一般通過兩種方式實現(xiàn)，一種是外部解毒即有機化合物進入根際后能與金屬形成穩(wěn)定的復(fù)合體，阻止錳進入共質(zhì)體，達到體外解除錳毒的目的；另一種屬于內(nèi)部解毒即有機物與金屬在植物體內(nèi)結(jié)合形成更為穩(wěn)定的絡(luò)合物，消除錳對植物的毒害。第二， 氧化、外排與積累(Plant Mol Biol, 1998,49 643-668 ；Plant Cell Environ, 1998,11 383-394)。植物在錳毒害時，有時通過將錳氧化成非有效態(tài)而限制過量錳的吸收和運輸， 這在一些漬水條件下生長的植物上表現(xiàn)尤為明顯。一些植物抗性品種的錳通常在體內(nèi)均勻分布，并積累在非代謝區(qū)域如液泡中。液泡隔離一直是植物耐重金屬毒性的重要機制之一。錳除了被積累外，還可能被轉(zhuǎn)化成其他形態(tài)貯存在植物體內(nèi)，通過衰老機制排出體外。 第三，金屬轉(zhuǎn)運蛋白和金屬結(jié)合蛋白參與對錳毒害的解除作用。擬南芥ZIP(ZinCRegUlated Protein/Iron Regulated Protein, ZRT/IRT)基因家族中的IRTl編碼金屬轉(zhuǎn)運蛋白，能夠轉(zhuǎn)運錳離子來增強對錳毒的耐性(Plant Mol Biol, 1999,40 37-44) 0在細胞膜上還存在一類與金屬轉(zhuǎn)運有關(guān)的Nramp基因家方矣(Natural resistance associated macrophage proteins)，其中SMFl能跨膜轉(zhuǎn)運錳離子，從而減輕錳毒害。在液泡膜上也存在一類轉(zhuǎn)運蛋白CDF(Cation diffuse facilitator)，通過將錳離子轉(zhuǎn)運到液泡中積累來增強耐性 (Plant Cell,2003,15 :1131_1142)。另外，金屬結(jié)合蛋白如金屬硫蛋白和植物螯合肽在增強植物對重金屬抗性方面發(fā)揮著重要作用。bHLH (basic helix-loop-helix, bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子是一段具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。它由一個能與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域(Basic region)和兩個α螺旋組成的結(jié)構(gòu)，在生物的生長發(fā)育及適應(yīng)環(huán)境等過程中起著重要的調(diào)控作用(Proc Natl Acad Sci USA, 1997，94 :5172_5176)。目前已知擬南芥和水稻基因組中bHLH基因家族分別有147個和167個成員(Plant Cell，2003，15 1749-1770) 0已有的研究表明bHLH類轉(zhuǎn)錄因子能提高植物對低溫、干旱、高鹽和氧化脅迫的抗性及低鐵脅迫的適應(yīng)性。水稻OsbHLHl基因編碼 bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，受低溫誘導(dǎo)表達。將OsbHLHl導(dǎo)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)2_4度條件下處理2周后，雖然二者的生長發(fā)育較正常生長條件下均明顯延緩，但是與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株抽苔時間較早、生長快，基葉衰老速度明顯低于對照。這表明過量表達OsbHLHl能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫和抗氧化脅迫能力(高技術(shù)通訊，2004，14:35-38)。擬南芥FITl基因作為 bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，參與了植物對鐵吸收的調(diào)控。在缺鐵條件下，AtFITl能與其它的bHLH蛋白相互作用，形成異源二聚體而啟動下游功能基因三價鐵還原酶AtFR02和高親和力亞鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白AtIRTl等的表達，提高植物的吸鐵效率。玉米作為我國重要的糧食作物，有關(guān)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子研究的報道并不多。最近Li 等(2011)在玉米中克隆了一個bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmPTFl，過量表達該基因能提高玉米對低磷脅迫的耐受性(Planta，2011，233 1129-1143)。然而，目前玉米中尚未見受錳脅迫誘導(dǎo)表達的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與功能鑒定的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種受重金屬錳脅迫誘導(dǎo)表達的玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因 ZmMITl (Manganese-Induced Transcription Factor 1)及其編碼蛋白的應(yīng)用；該基因能提高植物對重金屬錳脅迫的抗性，尤其是能夠提高煙草抗錳毒的能力。玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl，其由序列表SEQ ID NO 3的核苷酸序列定義。玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl的編碼蛋白，其由序列表SEQ ID NO: 12的氨基酸序列定義。所述的玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl基因及其編碼蛋白在培育抗重金屬錳脅迫的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明中，MnC12處理的玉米幼苗葉片中，所述的轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl被誘導(dǎo)表達。本發(fā)明所述的蛋白ZmMITl是屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子蛋白，是植物對逆境脅迫信號響應(yīng)的上游關(guān)鍵調(diào)控因子，所以調(diào)控ZmMITl的表達能夠調(diào)節(jié)植物對重金屬錳毒的抗性。因此所述的編碼錳誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子ZmMITl的基因ZmMITl在植物抗重金屬污染領(lǐng)域，特別是玉米抗土壤錳毒領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，其經(jīng)濟效益潛力巨大。


圖1 重組質(zhì)粒pGEM-T-ZmMITl的酶切驗證電泳圖；圖2 玉米幼苗葉片中ZmMITl基因響應(yīng)不同重金屬脅迫的表達模式柱狀圖；圖3 =ZmMITl基因植物表達載體構(gòu)建示意圖；圖4 轉(zhuǎn)ZmMITl基因的煙草株系表達水平柱狀圖；圖5 轉(zhuǎn)ZmMITl基因的煙草幼苗對錳脅迫處理的生長表型照片；圖6 轉(zhuǎn)ZmMITl基因的煙草幼苗對錳脅迫處理的生長表現(xiàn)柱狀圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1 材料處理 玉米(Zea mays L.)自交系鄭58 ；購自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所。
玉米材料處理 消毒挑選飽滿的玉米種子，經(jīng)蒸餾水浸泡24h后，用0. 1 %的升汞消毒5分鐘并用滅蒸水沖洗5遍。A，發(fā)芽將所述的充分吸水的種子在28°C，黑暗條件下發(fā)芽；具體操作為將所述的充分吸水的種子播在鋪有一層吸水棉的瓷盤中，上面覆蓋兩層濕的吸水紗布，黑暗條件下吸水3天。B，不同重金屬離子的脅迫處理將發(fā)芽的種子移至含蒸餾水的培養(yǎng)皿中，在溫度為24-26°C、濕度為60%、光暗交替周期為12h/12h的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長至二葉一心(約10天)時，倒掉蒸餾水，進行Mn2+、Cu2+、Fe3+和Zn2+溶液脅迫處理實驗。MnCl2溶液的濃度為10mM，CuCl2溶液的濃度為0. 3mM, FeCl3溶液的濃度為ImM和ZnCl2溶液的濃度為0. 6mM ；處理的時間分別為1、3、6、12、24、48小時；脅迫處理后的玉米作為實驗者，未做脅迫處理的玉米幼苗作為對照組。實施例2 =ZmMITl基因的克隆A.玉米葉片總RNA的分離和純化1.總RNA的提取(1)液氮研磨葉片至粉末狀，取適量加入2ml離心管中，同時加入Iml TRIZOL裂解液，震蕩混勻，室溫靜置5min。(2) 4°C，12，OOOrpm離心15min，取上清于新的離心管中。(3)加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3分鐘。(4) 4°C，12，OOOrpm 離心 15min。(5)吸取上層水相400-600 μ 1，于新的離心管中。(6)加入和上步吸取液等體積的異丙醇，輕柔混勻，室溫靜置5-lOmin。(7) 4°C，12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，RNA此時沉于管底。(8)加入Iml 75%乙醇，輕柔振蕩離心管，懸浮沉淀，室溫靜置5min。(9)4°C,8, OOOrpm 離心 5min，盡量棄凈上清。(10)重復(fù)步驟⑶，(9) 一次。(11)室溫晾干或真空干燥5-lOmin。(12)加入40 60 μ 1 DEPC處理并高壓滅菌過的H2O或TE buffer溶解RNA樣品。2. RNA的純化(以總RNA為50 μ 1為例)(1)純化體系
RNA50 μ
DNase (RNase Free, lu/μ )6.25 μ
RNase Inhibitor0.5 μ
10 xDNaseBuffer7.5 μ
DEPC-H2O加至總體系100 μ (2) 37°C溫浴 30min，去除 RNA 中的 DNA。(3)力口 DEPC-H20 至 300 μ 1。
(4)加入300 μ 1的酚/氯仿(1:1)，搖勻靜置5min。(5) 4°C，12，OOOrpm 離心 15min，吸上清。(6)加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀l_2h。(7)重復(fù) 3. 2. 2. 1 中(7)至(11)步驟。(8)加入30 40 μ 1用DEPC處理并高壓滅菌過的H2O或TE buffer溶解RNA樣
權(quán)利要求
1.玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl，其特征在于，其由序列表SEQID NO :3的核苷酸序列定義。
2.玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl的編碼蛋白，其特征在于，其由序列表SEQID NO 12的氨基酸序列定義。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMITl基因及其編碼蛋白在培育抗重金屬錳脅迫的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種受重金屬錳脅迫誘導(dǎo)表達的玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因ZmMIT1(Manganese-Induced Transcription Factor 1)及其編碼蛋白的應(yīng)用；該基因能提高植物對重金屬錳脅迫的抗性，尤其是能夠提高煙草抗錳毒的能力。ZmMIT1在玉米抗重金屬污染領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H5/00GK102229937SQ20111015037
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者丁俊強, 吳建宇, 夏宗良, 孫凱樂, 李志敏, 蘇新宏 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)