專利名稱：一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物病原線蟲生物學領域，涉及腐爛莖線蟲種群高質(zhì)量純化培養(yǎng)的方法。
背景技術：
甘薯腐爛莖線蟲病是我國農(nóng)業(yè)上的重要病害，在國內(nèi)主要分布于河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇等省區(qū)。其病原物甘薯腐爛莖線蟲OViJ^y7cAm D然tructor)最早在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，導致馬鈴薯腐爛(Thorne G，1945年提出)。甘薯莖線蟲病是我國甘薯產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，其病原腐爛莖線蟲是我國重要的檢疫性對象。近年來由于甘薯生產(chǎn)上引種不當，造成甘薯莖線蟲病的大面積蔓延。危害越來越嚴重，已經(jīng)危及了甘薯的生產(chǎn)。該病害是由線蟲危害引起的，病原經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學丁再福，林茂松等鑒定是馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)，這是植物寄生線蟲中惟一引起植物干腐癥狀的病原物，甘薯受到馬鈴薯腐爛莖線蟲的侵染，輕者減產(chǎn)10% -30%，重者達50% -80%，甚至絕收。該線蟲除了危害馬鈴薯、甘薯，還危害胡蘿卜、花生、薄荷等。
獲得群體純度高、生命力良好的線蟲是系統(tǒng)研究該線蟲生物學特性、致病機理、種群群體及個體遺傳變異等工作的基礎和前提。目前系統(tǒng)進行純化培養(yǎng)該線蟲的方法，一般通過下述幾種渠道獲得，如在P D A平板中接入茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani )、灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers)和毛殼菌 (Chaetomiumsp)，25°C溫箱中暗培養(yǎng)腐爛莖線蟲，另外劉斌等人報道采用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)對腐爛莖線蟲進行的單異活體培養(yǎng)，在室內(nèi)可以快速和大量繁殖腐爛莖線蟲(劉斌，鄭經(jīng)武，2006，浙江農(nóng)業(yè)學報)；阮龍等人報道采用甘薯發(fā)根單寄主培養(yǎng)體系繁殖馬鈴薯腐爛莖線蟲的方法(阮龍，吳飛，姜疆等，生物技術通報， 2006第六期)，上述純化培養(yǎng)方法都是通過接種大量線蟲獲得成功，且純化成功的基礎是在大量線蟲接種前進行腐生線蟲等其他蟲體的去除，如漆永紅等人報道在接種線蟲前先吸出 400至500條腐爛莖線蟲，然后在顯微鏡下去除腐生線蟲(漆永紅，李秀花，馬娟.華北農(nóng)學報.2008)。上述方法在實際應用中如果線蟲群體純度不高，且攜帶其他土壤線蟲的話， 去除這些雜蟲所需工作量必然加大，難免攜帶雜蟲，降低了培養(yǎng)的純度，這對于快速接種、 高質(zhì)量純化線蟲帶來不便，同時上述純化培養(yǎng)繁殖方法雖然給快速大量繁殖線蟲帶來了便利，但若腐爛莖線蟲在真菌上長時期繁殖培養(yǎng)(寄主發(fā)生改變的情況下)，可能在致病力等生物學特性方面發(fā)生轉(zhuǎn)變。阮龍等人報道采用甘薯發(fā)根單寄主培養(yǎng)體系繁殖馬鈴薯腐爛莖線蟲的方法不僅存在著上述缺陷，而且方法非常繁雜。因此，高質(zhì)量純化培養(yǎng)線蟲顯得非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，該方法不僅簡單、容易操作，而且獲得的線蟲群體純度高、生命力好。
本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)
一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟
(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲的大齡幼蟲、雄蟲放到器皿中備用；
(2)純化培養(yǎng)
將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條大齡幼蟲和兩條雄蟲接入一個小孔內(nèi)，再將切下的薯塊做為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后平放在培養(yǎng)箱里，于25°C培養(yǎng)30天，用直徑為13毫米打孔器將接種過線蟲的小孔取下分別進行線蟲分離。本發(fā)明進一步改進方案是，一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟
(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100X顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然后放到器皿中備用；
(2)純化培養(yǎng)
將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內(nèi)，再將切下的薯塊做為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后放置在培養(yǎng)箱里，于25°C培養(yǎng)30天，用直徑為13毫米打孔器將接種過線蟲的小孔取下分別進行線蟲分離。上述兩種方法，甘薯斷面上孔的直徑均為2-6毫米(直徑太大容易漂移，且浪費薯塊)，深度為10-30毫米，孔與孔的間距為2. 5-4厘米(只要便于培養(yǎng)后的線蟲取出分離，孔間距應盡量小一些，節(jié)約薯塊)。在培養(yǎng)箱內(nèi)預先噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境。在每個孔里注入少許無菌水，其目的在于接種線蟲時，便于線蟲由挑針游離到無菌水里，而不至于被挑針與薯塊擠壓致死。上述兩種方法，分別重復20次。將每次得到的腐爛莖線蟲均放入計數(shù)皿中分離觀察，對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，應用DPS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計算平均數(shù)并進行差異性比較。結(jié)果顯示，腐爛莖線蟲群體采用已受孕單條雌蟲及線蟲自交兩種方法進行種群的純化培養(yǎng)試驗是可行的。單雌純化培養(yǎng)與該線蟲親本自交相比，純化繁殖成功的概率顯著增高，達65%，培養(yǎng)30天后分離觀察后代平均數(shù)量為84. 15，比親本自交平均繁殖后代數(shù) 137.4在Patl5水平上顯著降低，分析認為可能在單條雌蟲接種之前部分卵塊已經(jīng)排出體外所致。研究也發(fā)現(xiàn)兩種方法所分離到的線蟲群體整齊度相對均一，但采用單雌純化繁殖所需工作量相對較少，約為2小時；而采用線蟲親本自交的工作量相對較大，約為4小時 ’另研究發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲不存在孤雌生殖現(xiàn)象，其繁殖后代只能通過有性生殖進行。表1為單雌純化培養(yǎng)與親本自交純化培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計注表中平均后代數(shù)a、b分別代表在Patl5水平上存在顯著性。即親本自交平均后代數(shù) 137. 4條與單雌繁殖平均后代數(shù)84. 15條在數(shù)量差異顯著性表現(xiàn)上有95%置信度。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下明顯優(yōu)點
本發(fā)明用兩種方法純化培養(yǎng)腐爛莖線蟲，分別都獲得較好的效果，方法簡單、容易操作、工作量小，更為重要的是獲得的群體純度高、生命力好，為系統(tǒng)研究該線蟲的生物學特性、致病機理、種群群體及個體的遺傳變異等工作的提供了保證。


圖1為薯塊切片打孔示意圖。
具體實施例方式實施例1
本實施例中供試腐爛莖線蟲群體由南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院線蟲實驗室提供。所用薯塊品種為蘇渝303 (對腐爛莖線蟲無抗性)，由江蘇省農(nóng)科院提供。一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟
(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100X顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然后放到凹面皿中備用；
(2)純化培養(yǎng)
將整薯縱向切去三分之一(得到三分之一的薯塊1，三分之二的薯塊2)，在三分之二薯塊的斷面上打孔(如圖1所示，甘薯斷面上孔3的直徑為3毫米，深度為20毫米，孔與孔的間距為3厘米)，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內(nèi)，再將三分之一的薯塊1作為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的三分之二的薯塊2上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后放置在培養(yǎng)箱里(放置前，預先在培養(yǎng)箱內(nèi)噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境)，于25°C培養(yǎng) 30天得到若干純腐爛莖線蟲。在本實施例中，分離線蟲時選用孔徑為13mm的打孔器將孔3取出分離。圖中所示，共有二十個孔3。分離結(jié)果見表1中單雌繁殖。實施例2
一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟(1)線蟲的準備
在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲的大齡幼雌蟲、雄蟲放到器皿中備用；
(2)純化培養(yǎng)
將整薯縱向切去三分之一(得到三分之一的薯塊1，三分之二的薯塊2)，在三分之二薯塊的斷面上打孔(如圖1所示，甘薯斷面上孔3的直徑為3毫米，深度為20毫米，孔與孔的間距為3厘米)，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條大齡幼雌蟲和兩條雄蟲接入一個小孔內(nèi)，再將三分之一的薯塊1作為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的三分之二的薯塊2上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后平放在培養(yǎng)箱里(放置前，預先在培養(yǎng)箱內(nèi)噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境)，于25°C培養(yǎng)30天得到若干純腐爛莖線蟲。 在本實施例中，分離線蟲時選用孔徑為13mm的打孔器將孔3取出分離。圖中所示，共有二十個孔3。分離結(jié)果見表1中親本自交。
權利要求
1.一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特征在于包括下列步驟(1)線蟲的準備在40X體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100X顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然后放到器皿中備用；(2)純化培養(yǎng)將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內(nèi)，再將切下的薯塊做為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后放置在培養(yǎng)箱里，于25°C培養(yǎng)30天得到若干純腐爛莖線蟲。
2.如權利要求1所述的一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特征在于甘薯斷面上接種線蟲孔的直徑為2-6毫米，深度為1(Γ30毫米，孔與孔的間距為2. 5-4厘米。
3.如權利要求1所述的一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特征在于在培養(yǎng)箱內(nèi)接入腐爛莖線蟲前，預先噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境。
4.一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特征在于包括下列步驟(1)線蟲的準備在40Χ體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲的大齡幼蟲、雄蟲放到器皿中備用；(2)純化培養(yǎng)將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條大齡幼蟲和兩條雄蟲接入一個小孔內(nèi)，再將切下的薯塊做為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后放置在培養(yǎng)箱里，于25°C培養(yǎng)30天得到若干純腐爛莖線蟲。
5.如權利要求4所述的一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特征在于甘薯斷面上接種線蟲孔的直徑為2-6毫米，深度為1(Γ30毫米，孔與孔的間距為2. 5-4厘米。
6.如權利要求4所述的一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，其特征在于在培養(yǎng)箱內(nèi)接入腐爛莖線蟲前，預先噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化培養(yǎng)甘薯腐爛莖線蟲的方法，包括下列步驟(1)線蟲的準備。在40×體式顯微鏡下用針挑取腐爛莖線蟲種群雌蟲放在玻片上，在100×顯微鏡下進一步確認為受孕雌蟲，然后放到器皿中備用；(2)純化培養(yǎng)。將整薯橫向或縱向切開，在其中的一個斷面上打孔，在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出孔為準，之后將步驟(1)得到的腐爛莖線蟲，一條接入一個小孔內(nèi)，再將切下的薯塊做為天然保濕蓋蓋在接入腐爛莖線蟲后的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，并用彈性材料捆綁后放置在培養(yǎng)箱里，于25℃培養(yǎng)30天，用直徑為13毫米打孔器將接種過線蟲的小孔取下分別進行線蟲分離。本發(fā)明方法簡單、容易操作、工作量小，更為重要的是獲得的群體純度高、生命力好，為系統(tǒng)研究該線蟲的生物學特性、致病機理、種群群體及個體的遺傳變異等工作的提供了保證。
文檔編號A23K1/18GK102318585SQ201110128860
公開日2012年1月18日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權日2011年5月18日
發(fā)明者李茹, 梁照文, 王宏寶 申請人:江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所