專利名稱：一種蛹蟲草白化菌株及其子實體的栽培方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種蛹蟲草菌株，具體來說是涉及一種蛹蟲草白化菌株AB6 Cordycepsmilitaris albino strain AB6CCTCC NO :M 2011073 及其子實體的栽培方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)醫(yī)學與現(xiàn)代科學研究都表明，冬蟲夏草含有多種對人體有益的營養(yǎng)有效成分，例如蟲草素、蟲草酸、腺苷等，其具有抗菌，抗腫瘤，抗氧化，滋陰壯陽，保肝益肺和提高免疫力等功效，因而越來越受到人們的喜愛，市場需求不斷擴大。但野生冬蟲夏草產(chǎn)量十分有限，因此急需開發(fā)出人工栽培蟲草的方法
發(fā)明內(nèi)容
。本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種蛹蟲草白化菌株，另一目的是開發(fā)其白化子實體的栽培方法。本發(fā)明所提供的蛹蟲草白化菌株AB6是2008年在蛹蟲草子實體栽培過程中以獲得的蛹蟲草白化子實體通過組織分離優(yōu)化而獲得，并于2011年3月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址是武漢市武昌珞珈山，簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO =M 2011073。該菌株與產(chǎn)生橙黃色子實體的正常蛹蟲草的ITS序列相似率達98%，利用RAPD 技術(shù)對菌株間差異進行分析，篩選36條隨機引物，未獲得可區(qū)分兩菌株的隨機引物，可推測兩菌株在遺傳物質(zhì)上具有極高的相似性。該菌株菌絲受光照刺激產(chǎn)生黃色色素的能力明顯低于正常的蛹蟲草，兩者在PDA平板上的菌落形態(tài)在顏色方面有顯著的差別；該菌株經(jīng)人工培養(yǎng)產(chǎn)生的子實體呈白色，部分子實體可見淺黃色的分生孢子，但無法形成子囊和子囊孢子。我們通過將上述蛹蟲草白化菌株或其新鮮子實體進行組織分離，接入綜合PDA斜面培養(yǎng)基制備斜面母種，斜面母種再接至液體培養(yǎng)基中制備一級菌種，一級菌種接入液體培養(yǎng)基中制備生產(chǎn)種，最后生產(chǎn)菌種在生產(chǎn)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得一種人工栽培的蛹蟲草白化子實體，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明所述的蛹蟲草白化子實體的栽培方法，其特征包括以下的步驟(1)將蛹蟲草白化菌株 AB6 Cordyceps militaris albino strainAB6CCTCC NO: M 2011073或其新鮮子實體進行組織分離，按黃豆大小接入綜合PDA斜面培養(yǎng)基，20 25°C 下，暗培養(yǎng)4 7天后，光照7 10天，菌絲長滿斜面，選取菌絲生長整齊且基生菌絲發(fā)達的作為斜面母種，所述的綜合PDA培養(yǎng)基pH 5. 0 7. 0，其原料組成為每IOOOmL水中加入馬鈴薯 200g,葡萄糖 20g, KH2P043g,MgSO4 ·7Η20 1. 5g，維生素 B1O. 02 0. 05g,瓊脂 15 20g， 其制備方法是按所述組成分別稱重后，先將馬鈴薯去皮切成小條放入鍋中，加入3. 5 4. 5 倍質(zhì)量的水，煮沸20 30分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用6 8層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補至原加水量后，加入瓊脂熔化，再加入葡萄糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂和維生素B1攪拌均勻；
(2)將步驟(1)得到的斜面母種按每IOOmL培養(yǎng)基接入2 10塊黃豆大小的菌塊的接種量接至液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，100 120r/min，振蕩培養(yǎng)5 7天，選取菌絲球大小均勻一致的菌種作為一級菌種，所述的液體培養(yǎng)基pH 6. 5 7. 0，其組成是每IOOOmL 培養(yǎng)基中含葡萄糖10 30g，蛋白胨2 6g，KH2PO4I 4g，MgSO4 · 7H20 1 4g和余量的水；(3)將步驟( 得到的一級菌種按液體培養(yǎng)基體積2% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，100 120r/min，振蕩培養(yǎng)3 7天，選取菌絲球大小均勻一致的菌株作為生產(chǎn)菌種；(4)在無菌的環(huán)境下，按生產(chǎn)菌種和水的體積比1 3 8的比例將步驟(3)得到的生產(chǎn)菌種用水稀釋，再按每IOOOmL生產(chǎn)菌種接種入0. 5 1. 2kg生產(chǎn)用培養(yǎng)基的比例進行接種，在18 25°C，空氣相對濕度50% 65%下，先進行暗培養(yǎng)3 4天，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，進行光照培養(yǎng)，光強400 lOOOlx，10 12h/d，空氣相對濕度80% 90%，18 23°C，經(jīng)7 14天長出子實體原基，再培養(yǎng)40 50天，待部分子實體頂部變成圓形，或出現(xiàn)孢子時，即進行采收，得到蛹蟲草白化子實體，所述的生產(chǎn)種培養(yǎng)基是按Ikg大米和1 2L營養(yǎng)液的比例組成，其中每升營養(yǎng)液由碳源10 30g，氮源8 15g，無機磷鹽3 7g， 以及余量的水組成，pH6. 0 7. 5。步驟( 所述的一級菌種還可以用同樣的方法進一步擴大培養(yǎng)為二級菌種。步驟⑷所述的蛹蟲草白化子實體還可以在60°C下烘3 4小時得到干品，以便于保存和再利用，所述的碳源、氮源和無機磷鹽是微生物培養(yǎng)基中常用的，碳源可以是可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖等，氮源是蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸或硝酸銨，無機磷鹽是 NaH2PO4或Na2HPO4,碳源、氮源和無機磷鹽可為食品級或生化試劑級；大米購自農(nóng)貿(mào)市場，大米和營養(yǎng)液混合后，封口，121°C滅菌40min，冷卻至室溫備用。本發(fā)明的蛹蟲草白化子實體的生物轉(zhuǎn)化率達到30% 45%，即每千克培養(yǎng)料能產(chǎn)出300g 450g的新鮮子實體。本發(fā)明的蛹蟲草白化子實體含有多種有效成分和營養(yǎng)成分，其腺苷含量為1 1. 16mg/g，蟲草素含量為1.5 12. 9mg/g，蟲草酸含量為10 14. 8mg/g，粗蛋白含量為 20 觀％，粗纖維含量為15 17. 2%，可作為食品或原料使用。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實施例1 稱取馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，KH2P043g, MgSO4 · 7H20 1. 5g，維生素 B1O. 02g,瓊脂 20g，將馬鈴薯(已去皮)切成小條放入鍋中，加入3. 5倍質(zhì)量的水，煮沸20分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用6層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補至原加水量后，加入瓊脂熔化，再加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和維生素A攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH至5. 0，趁熱按5mL/管的量分裝于18mmX 180mm試管里，塞上棉塞，包上油紙，于121°C，15磅蒸汽壓，滅菌20分鐘，冷卻到 45°C倒成斜面，得到綜合PDA斜面培養(yǎng)基。將新鮮蛹蟲草白化子實體進行組織分離，取菌肉按黃豆大小的接種量接入無菌的綜合PDA斜面培養(yǎng)基，200C，暗培養(yǎng)7天后，光照10天，菌絲長滿斜面，選取菌絲生長整齊且基生菌絲發(fā)達的作為斜面母種直接使用或保藏于4°C下備用。稱取葡萄糖10g，蛋白胨2g，KH2PO4Ig, MgSO4 · 7H201g，將各成分分別用水溶解后混合，調(diào)節(jié)PH至6. 5，用水定容至1升，按裝量為50%的比例裝入耐高溫的容器內(nèi)，于121°C 下，15分鐘常規(guī)滅菌，冷卻至室溫，得到液體培養(yǎng)基，備用。將選取的斜面母種按每IOOmL培養(yǎng)基10塊黃豆大小的菌塊的接種量接至無菌液體培養(yǎng)基中，20°C下，lOOr/min，振蕩培養(yǎng)7天，選取菌絲球大小均勻一致的菌種作為一級菌種。將2mL —級菌種接種至IOOmL液體培養(yǎng)基中，20°C下，lOOr/min，振蕩培養(yǎng)7天，選取菌絲球大小均勻一致的菌株作為生產(chǎn)菌種。將葡萄糖10g，蛋白胨8g，NaH2P043g混合用水定容到1L，pH調(diào)節(jié)至6. 0，得到營養(yǎng)液。將20g大米裝入250毫升的玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，在加入營養(yǎng)液20mL，混合，用聚乙烯薄膜和橡皮筋封口，121°C滅菌40min，冷卻至室溫，得到生產(chǎn)用培養(yǎng)基，備用。在無菌室內(nèi)，將IOOmL的生產(chǎn)菌種用300mL的無菌水稀釋，再接入50g無菌的生產(chǎn)用培養(yǎng)基中，在18°C，空氣相對濕度50%下，先進行暗培養(yǎng)4天，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，進行光照培養(yǎng)，光強4001x，10h/d,空氣相對濕度80%，18°C，經(jīng)14天即可長出子實體原基，再培養(yǎng)50天，待部分子實體頂部變成圓形，即進行采收，得到蛹蟲草白化子實體，將子實體在 60°C下烘3小時，即可獲得干品(水分含量不高于13% )，便于保存和再利用。經(jīng)統(tǒng)計，本次生物轉(zhuǎn)化率達到30%，即每千克培養(yǎng)料能產(chǎn)出300g的新鮮子實體。 經(jīng)檢測，得到的蛹蟲草白化菌株子實體含腺苷lmg/g，蟲草素12. 9mg/g，蟲草酸10mg/g，粗蛋白28%，粗纖維17.2%。實施例2 稱取馬鈴薯200g,葡萄糖 20g, KH2P043g, MgSO4 · 7Η201· 5g，維生素 B1O. 05g,瓊脂 15g，將馬鈴薯(已去皮)切成小條放入鍋中，加入4. 5倍質(zhì)量的水，煮沸30分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用8層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補至原加水量后，加入瓊脂熔化，再加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和維生素B1攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至7. 0，趁熱按IOmL/管的量分裝于20mmX 200mm試管里，塞上棉塞，包上油紙，于121°C，15磅蒸汽壓，滅菌30分鐘，冷卻到50°C倒成斜面，得到綜合PDA斜面培養(yǎng)基。將蛹蟲草白化菌株AB6Cordyc印s militaris albino strain AB6CCTCC NO :M 2011073從5°C保存下取出，按黃豆大小的接種量接入無菌的綜合PDA斜面培養(yǎng)基中，25°C 下，暗培養(yǎng)4天后，光照7天，選取菌絲生長整齊且基生菌絲發(fā)達的菌種作為活化母種即斜面母種。稱取葡萄糖30g，蛋白胨6g，KH2P044g, MgSO4 · 7H20 4g，將各成分分別用水溶解后混合，調(diào)節(jié)PH至7. 0，用水定容至1升，按裝量為50%的比例裝入耐高溫的容器內(nèi)，于121 °C 下，15分鐘常規(guī)滅菌，冷卻至室溫，得到液體培養(yǎng)基，備用。將活化母種按每IOOmL培養(yǎng)基2塊黃豆大小的菌塊的接種量接至無菌的液體培養(yǎng)基中，25°C下，120r/min，振蕩培養(yǎng)5天，選取菌絲球大小均勻一致的菌種作為一級菌種。將IOmL —級菌種接種至IOOmL液體培養(yǎng)基中，25°C下，120r/min,振蕩培養(yǎng)3天， 選取菌絲球大小均勻一致的菌株作為生產(chǎn)菌種。將可溶性淀粉30g，硝酸銨15g，Na2HP047g混合用水定容到1L，pH調(diào)節(jié)至7. 5，得到營養(yǎng)液。將20g大米裝入250毫升的玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，再加入營養(yǎng)液40mL，混合，用聚乙烯薄膜和橡皮筋封口，121°C滅菌40min，冷卻至室溫，得到生產(chǎn)用培養(yǎng)基，備用。在無菌條件下，將IOOmL的生產(chǎn)菌種用SOOmL的無菌水稀釋，再接入120g無菌的生產(chǎn)用培養(yǎng)基中，在25°C，空氣相對濕度65 %下，先進行暗培養(yǎng)3天，待菌絲長滿培養(yǎng)基后， 進行光照培養(yǎng)，光強lOOOlx，12h/d，空氣相對濕度90%，23°C，經(jīng)7天即可長出子實體原基， 再培養(yǎng)40天，待部分子實體出現(xiàn)孢子時，即進行采收，得到蛹蟲草白化子實體，將子實體在 60°C下烘4小時，即可獲得干品(水分含量不高于13% )，便于保存和再利用。經(jīng)統(tǒng)計，本次生物轉(zhuǎn)化率達到45%，即每千克培養(yǎng)料能產(chǎn)出450g的新鮮子實體。 經(jīng)檢測，得到的蛹蟲草白化菌株子實體含腺苷1. 16mg/g，蟲草素1. 5mg/g，蟲草酸14. Smg/ g，粗蛋白20%，粗纖維15%。
權(quán)利要求
1.一種蛹蟲草白化菌株 AB6 Cordyceps militaris albino strain AB6CCTCC NO: M2011073。
2.權(quán)利要求1所述的蛹蟲草白化菌株子實體的栽培方法，其特征包括以下的步驟(1)將蛹蟲草白化菌株AB6 Cordyceps militaris albino strainAB6CCTCC NO :M 2011073或其新鮮子實體進行組織分離，按黃豆大小接入綜合PDA斜面培養(yǎng)基，20 25 V 下，暗培養(yǎng)4 7天后，光照7 10天，菌絲長滿斜面，選取菌絲生長整齊且基生菌絲發(fā)達的作為斜面母種，所述的綜合PDA培養(yǎng)基pH 5. O 7. 0，其原料組成為每IOOOmL水中加入馬鈴薯 200g,葡萄糖 20g, KH2P043g, MgSO4 ·7Η20 1. 5g，維生素 BIO. 02 0. 05g,瓊脂 15 20g， 其制備方法是按所述組成分別稱重后，先將馬鈴薯去皮切成小條放入鍋中，加入3. 5 4. 5 倍質(zhì)量的水，煮沸20 30分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用6 8層紗布過濾，取濾汁于鍋中，補至原加水量后，加入瓊脂熔化，再加入葡萄糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂和維生素B1攪拌均勻；(2)將步驟⑴得到的斜面母種按每IOOmL培養(yǎng)基接入2 10塊黃豆大小的菌塊的接種量接至液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，100 120r/min，振蕩培養(yǎng)5 7天，選取菌絲球大小均勻一致的菌種作為一級菌種，所述的液體培養(yǎng)基pH 6. 5 7. 0，其組成是每IOOOmL 培養(yǎng)基中含葡萄糖10 30g，蛋白胨2 6g，KH2PO4I 4g，MgSO4 · 7H20 1 4g和余量的水；(3)將步驟( 得到的一級菌種按液體培養(yǎng)基體積2% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，100 120r/min，振蕩培養(yǎng)3 7天，選取菌絲球大小均勻一致的菌株作為生產(chǎn)菌種；(4)在無菌的環(huán)境下，按生產(chǎn)菌種和水的體積比1 3 8的比例將步驟C3)得到的生產(chǎn)菌種用水稀釋，再按每IOOOmL生產(chǎn)菌種接種入0. 5 1. 2kg生產(chǎn)用培養(yǎng)基的比例進行接種，在18 25°C，空氣相對濕度50% 65%下，先進行暗培養(yǎng)3 4天，待菌絲長滿培養(yǎng)基后，進行光照培養(yǎng)，光強400 lOOOlx，10 12h/d，空氣相對濕度80% 90%，18 23°C，經(jīng)7 14天長出子實體原基，再培養(yǎng)40 50天，待部分子實體頂部變成圓形，或出現(xiàn)孢子時，即進行采收，得到蛹蟲草白化子實體，所述的生產(chǎn)種培養(yǎng)基是按Ikg大米和1 2L營養(yǎng)液的比例組成，其中每升營養(yǎng)液由碳源10 30g，氮源8 15g，無機磷鹽3 7g， 以及余量的水組成，PH6. 0 7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛹蟲草白化菌株子實體的栽培方法，步驟(4)所述的蛹蟲草白化菌株子實體在60°C下烘3 4小時得到干品，所述的碳源是可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖， 所述的氮源是蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸或硝酸銨，所述的無機磷鹽是NaH2PO4或 Nei2HPO4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛹蟲草白化菌株AB6 Cordyceps militaris albino strain AB6 CCTCC NOM 2011073及其子實體的栽培方法，其特征是通過將上述蛹蟲草白化菌株或其新鮮子實體進行組織分離，接入綜合PDA斜面培養(yǎng)基制備斜面母種，斜面母種再接至液體培養(yǎng)基中制備一級菌種，一級菌種接入液體培養(yǎng)基中制備生產(chǎn)種，最后生產(chǎn)菌種在生產(chǎn)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得一種人工栽培的蛹蟲草白化子實體得到蛹蟲草白色菌株子實體。本發(fā)明的蛹蟲草白化菌株子實體生物轉(zhuǎn)化率達到30％～45％，其腺苷含量為1～1.16mg/g，蟲草素含量為1.5～12.9mg/g，蟲草酸含量為10～14.8mg/g，粗蛋白含量為20～28％，粗纖維含量為15～17.2％，可作為食品或原料使用。
文檔編號A01G1/04GK102210255SQ20111008565
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者宋斌, 李泰輝, 林群英, 黃浩 申請人:廣東省微生物研究所