專利名稱：噻唑烷二酮能量限制擬似劑的制作方法
噻唑烷二酮能量限制擬似劑相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求2009年10月9日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/250045號(hào)和2010年2月16日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/304881號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其兩者均通過(guò)引用以其全文結(jié)合到本文中。政府資助
本發(fā)明至少部分得到政府支持的國(guó)立衛(wèi)生研究院項(xiàng)目(Grant)第CA112250號(hào)的資助。政府可擁有該發(fā)明的某些權(quán)利。 背景
噻唑烷二酮(TZDs)，包括羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮和環(huán)格列酮，為核轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) Y的選擇性配體。通過(guò)參與脂肪細(xì)胞內(nèi)葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、脂肪酸代謝和甘油三酯貯存的胰島素敏感基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)調(diào)節(jié)許多方面的脂肪組織功能，這些TZDs改善胰島素敏感性。另外，TZD介導(dǎo)的PPAR y激活已經(jīng)顯示通過(guò)模擬脂肪細(xì)胞上胰島素的基因組效應(yīng)促進(jìn)前脂肪細(xì)胞(pre-adipocytes)分化，并且調(diào)節(jié)脂連蛋白、前炎性細(xì)胞因子像IL-6和TNF a和脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)許多內(nèi)分泌調(diào)節(jié)劑的受體(host)。通過(guò)這些有益的作用，TZDs通過(guò)減少胰島素抗性和協(xié)助血糖控制提供了用于II型糖尿病的新型口服療法。像脂肪細(xì)胞一樣，許多人癌細(xì)胞系已被報(bào)道呈現(xiàn)高水平的PPAR Y表達(dá)。這些腫瘤細(xì)胞體外暴露于高劑量(>50 y M)的TZDs，尤其是曲格列酮和環(huán)格列酮，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和/或再分化，提示PPAR Y信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與TZDs的抗腫瘤活性之間存在假定的關(guān)聯(lián)。Grommes等.Lancet Oncol. , 5,第419-429頁(yè)(2004)。另外，曲格列酮的體內(nèi)抗癌活性在一些包括患有脂肪肉瘤或前列腺癌的患者在內(nèi)的臨床病例中得到證實(shí)。Demetri等Proc Natl Acad Sci USA. 96,第 3951-3956 頁(yè)(1999)和 Hisatake 等，Cancer Res.,60，第5494-5498頁(yè)(2000)。積累的證據(jù)表明，曲格列酮和環(huán)格列酮通過(guò)祀向于控制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和生存的多樣化信號(hào)通路介導(dǎo)不依賴PPAR Y的抗癌作用。Wei等，Cancer Lett. , 276，第 119-124 頁(yè)(2009)。在已鑒定的各種“脫祀(off-target) ”機(jī)制中，通過(guò)蛋白酶體降解(proteasomaldegradation)或轉(zhuǎn)錄抑制，TZDs對(duì)廣泛范圍的細(xì)胞周期-和細(xì)胞凋亡-調(diào)節(jié)蛋白包括￠-聯(lián)蛋白(catenin)、細(xì)胞周期蛋白Dl、Spl、雄激素受體(AR)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)的作用，尤其值得注意。研究人員已經(jīng)獲得證據(jù)表明，該作用可歸因于TZDs通過(guò)增加該E3泛素連接酶的表達(dá)水平激活0 -轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)序列包含蛋白(repeats containingprotein) ( P-TrCP)介導(dǎo)的革巴蛋白例如P -聯(lián)蛋白、細(xì)胞周期蛋白Dl和Spl的蛋白酶體降解能力。Wei 等，Mol Pharmacol. ; 72，第 725-733 頁(yè)(2007)和 Wei 等，J Biol Chem.,283，第26759-26770頁(yè)(2008)。在研究作為T(mén)ZD誘導(dǎo)的P -TrCP介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白Dl和Spl蛋白水解作用基礎(chǔ)的機(jī)制過(guò)程中，觀察到P -TrCP依賴的降解也發(fā)生于葡萄糖剝奪的條件下。與癌細(xì)胞形成對(duì)照，良性細(xì)胞對(duì)這些不依賴PPAR Y的抗腫瘤作用是抗性的，其強(qiáng)調(diào)TZDs作為開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥骨架的潛在性。該前提對(duì)兩個(gè)PPAR Y無(wú)活性衍生物STG28和0SU-CG12被證實(shí)是真實(shí)的，它們呈現(xiàn)比各母體化合物曲格列酮和環(huán)格列酮高數(shù)倍的抗腫瘤效力。Huang 等，J. Med Chem. , 49,第 4684_4689 頁(yè)(2OO6)和 Yang 等，J. MedChem.，51，第 2100-2107 頁(yè)(2008)。噻唑烷二酮的另一個(gè)可能的靶標(biāo)為一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)。AMPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞和全身水平兩者的能量體內(nèi)平衡和胰島素敏感性的功能性作用為已知的。在應(yīng)答于刺激例如運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞應(yīng)激和脂肪因子中，該細(xì)胞燃料-傳感酶經(jīng)控制養(yǎng)分?jǐn)z取和能量代謝的多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)一系列的代謝變化以抵消能量消耗，包括葡萄糖刺激和脂肪酸攝取、脂肪酸氧化和線粒體生物合成并抑制糖原合成。最近，越來(lái)越多的證據(jù)提示，根據(jù)其激活結(jié)節(jié)性硬化復(fù)癥2的能力，一種通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素類似靶標(biāo)(mTOR)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白合成的腫瘤抑制基因，提示在AMPK與癌細(xì)胞生長(zhǎng)和生存之間存在關(guān)系。Inoki等，Cell, 115，577-590 (2003)。從機(jī)理的角度來(lái)看，AMPK通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)mTOR整合生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞代謝。另外，據(jù)報(bào)道AMPK通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子，尤其是白 細(xì)胞介素(IL)-6的產(chǎn)生來(lái)抑制炎性反應(yīng)。Lihn等，Mol Cell Endocrinol. , 292，36-41(2008)。這些研究結(jié)果一同提示AMPK代表用于治療II型糖尿病、代謝綜合征和癌癥的治療性相關(guān)靶標(biāo)。癌細(xì)胞通過(guò)在其微環(huán)境中轉(zhuǎn)變細(xì)胞代謝為有氧糖酵解，提供所謂Warburg效應(yīng)。Samudio 等，Cancer Res. 69,第 2163-2166 頁(yè)(2009)獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。Warburg 效應(yīng)是大多數(shù)癌細(xì)胞主要通過(guò)糖酵解，隨后經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)乳酸發(fā)酵，而不是像大多數(shù)正常細(xì)胞那樣通過(guò)在線粒體內(nèi)丙酮酸氧化產(chǎn)生能量的觀察結(jié)果。即使氧氣豐富這也會(huì)發(fā)生。Warburg效應(yīng)可能是癌中破壞線粒體，適應(yīng)于腫瘤內(nèi)低氧環(huán)境的后果，或者是腫瘤基因關(guān)閉線粒體的結(jié)果，因?yàn)樗鼈儏⑴c細(xì)胞凋亡程序。靶向于有氧糖酵解以利用惡性細(xì)胞相對(duì)于正常細(xì)胞對(duì)糖酵解抑制作用的不同易感性，因此是癌癥療法的有用方法。靶向于有氧糖酵解也可用于其它目的，例如治療糖尿病或延長(zhǎng)壽命。使用有氧糖酵解用于癌癥療法的實(shí)例為在各種自發(fā)性或化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤動(dòng)物模型中飲食熱量限制在抑制癌變中的體內(nèi)療效。參見(jiàn)Jiang等，Cancer Res 68，第5492-5499 頁(yè)(2008) ; Hursting 等，Annu Rev Med 54，第 131-152 頁(yè)(2003) ; Thompson等，J. Mammary Gland Biol Neoplasia 8,第 133-142 頁(yè)(2003);和 Berrigan 等，Carcinogenesis 23，第 817-822 頁(yè)(2002)。也可獲得使用各種化合物例如白藜蘆醇(Baur等，NatRevDrugDiscov. 5,第493-506 頁(yè)(2006)和 Cucciolla 等，Cell Cycle 6，第 2495-2510 頁(yè)(2007))或者 2-脫氧葡萄糖(Zhu等，CancerRes. 65，第7023頁(yè)(2005))抑制致癌作用的信息也是可行的。由于它們分別通過(guò)抑制葡萄糖代謝和攝取模擬能量限制的有益作用的能力，能量限制擬似劑(mimetic agents) 2-脫氧葡萄糖和白藜蘆醇已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。然而,這些藥物的治療應(yīng)用受到其相對(duì)弱體外效力的限制。仍需要新的能量限制擬似劑，特別是呈現(xiàn)增加效力，用于治療癌癥、代謝紊亂或其它涉及異常糖酵解的病癥的那些擬似劑。發(fā)明概述
本發(fā)明提供在受試者中抑制糖酵解的方法，方法包括給予所述受試者包含噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物。由于噻唑烷二酮衍生物抑制糖酵解的能力，其代表類似于由于葡萄糖饑餓療法(glucose starvation)造成的能量限制形式,其代表一類新的能量限制擬似齊U。使用噻唑烷二酮衍生物在受試者中抑制糖酵解的方法可用于抑制腫瘤糖酵解代謝并從而在受試者中治療或預(yù)防癌癥，并且也可用于延長(zhǎng)受試者的壽命，包括尚未診斷患有癌癥的受試者。用于該方法的噻唑烷二酮衍生物用本文提供的式I、II、III和IV進(jìn)一步定義。本發(fā)明也提供用于通過(guò)提供有效量的噻唑烷二酮衍生物激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶的方法。另外，由于激活A(yù)MPK導(dǎo)致IL-6表達(dá)的抑制，本發(fā)明也提供通過(guò)給予是受試者包括噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物在受試者中抑制IL-6表達(dá)的方法。用于激活A(yù)MPK和抑制IL-6表達(dá)的合適的噻唑烷二酮衍生物包括通過(guò)式I、III和IV的具體實(shí)施方案定義的那些衍生物。附圖簡(jiǎn)述
通過(guò)參照以下繪圖可更易于理解本發(fā)明，其中
圖I提供描繪受到導(dǎo)致其作為能量限制擬似劑起作用的能力的噻唑烷二酮(TZDs)影 響的各種因素的示意圖。圖2提供顯示用于制備大量噻唑烷二酮化合物庫(kù)的固相方法的示意圖和圖表。圖的上面部分顯示推定的合成流程圖，而圖的下面部分顯示存在于組成庫(kù)的化合物上的R1和R2取代基。圖3提供曲線圖和顯示PPAR Y不依賴的TZDs抗增殖作用的免疫印跡。部分A)顯示曲格列酮(TG)、環(huán)格列酮(CG)、STG28 (STG)和OSU-CG12 (CG12)相對(duì)于兩種能量限制擬似劑白藜蘆醇(Resv)和2-脫氧葡萄糖(2-DG)在10% FBS-補(bǔ)充的培養(yǎng)基中72小時(shí)對(duì)LNCaP前列腺和MCF-7乳腺癌細(xì)胞相對(duì)于非惡性前列腺上皮細(xì)胞(PrECs)的活力的劑量依賴性作用。MTT數(shù)據(jù)表示為平均值±95%置信區(qū)間(誤差棒)(n = 6)。部分B)顯示缺乏0SU-CG12對(duì)在PrECs中的P -TrCP, Spl和雄激素受體(AR)表達(dá)水平的作用，證實(shí)非惡性的PrECs對(duì)0SU-CG12的抗增殖活性的抗性。蛋白質(zhì)印跡為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表，所有實(shí)驗(yàn)具有類似的結(jié)果。圖4提供TZDs誘導(dǎo)自噬的證據(jù)。左小圖提供免疫印跡，其顯示M 0SU-CG12對(duì)LC3-I轉(zhuǎn)變成LC3-II的時(shí)間依賴性作用，一種自噬標(biāo)志物，然而其可通過(guò)自噬抑制劑3-MA(I mM)得到阻斷。LNCaP細(xì)胞用GFP-LC3質(zhì)粒瞬態(tài)轉(zhuǎn)染，隨后暴露于M OSU-CG12單獨(dú)或在3-MA存在下指明的時(shí)間間隔。GFP免疫印跡得到實(shí)施以檢測(cè)LC3-II形成。右圖提供5u M OSU-CG12單獨(dú)或在I mM 3-甲基腺嘌呤(3-MA)存在下對(duì)GFP-LC3熒光的模式作用的顯微分析圖像。在CG12組中明顯的點(diǎn)狀模式(punctuate pattern)表明其積聚進(jìn)入到自噬泡。在6孔板上培養(yǎng)的表達(dá)GFP-LC3的LNCaP細(xì)胞經(jīng)受不同藥物處理36小時(shí)，然后經(jīng)熒光顯微法檢測(cè)。免疫印跡和顯微鏡撿數(shù)據(jù)為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表，所有實(shí)驗(yàn)具有類似的結(jié)果。圖5提供免疫印跡顯示能量限制和TZDs共同承擔(dān)促進(jìn)P -TrCP介導(dǎo)的糖酵解的能力。如所指明的那樣把LNCaP和MCF-7細(xì)胞暴露于曲格列酮(TG)、STG28、環(huán)格列酮(CG)、0SU-CG12 (CG12)，兩種能量限制擬似劑(2-脫氧葡萄糖(2-DG)和白藜蘆醇)和不含葡萄糖的培養(yǎng)基(葡萄糖饑餓)，并且對(duì)P-TrCP介導(dǎo)的糖酵解的組分的作用經(jīng)蛋白質(zhì)印跡來(lái)評(píng)價(jià)。這些端點(diǎn)包括P -TrCP, ^ -TrCP底物和Spl靶基因產(chǎn)物的表達(dá)以及參與促進(jìn)P -TrCP底物識(shí)別的激酶磷酸化狀態(tài)。免疫印跡為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖6提供免疫印跡，其顯示TZDs共同承擔(dān)LNCaP細(xì)胞內(nèi)2_脫氧葡萄糖(2_DG)和葡萄糖饑餓療法引發(fā)與能量限制相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)的能力。部分A)顯示IOy M OSU-CG12(CG12)相對(duì)于10 mM 2-DG和葡萄糖饑餓對(duì)各種與能量限制(Sirtl表達(dá)的誘導(dǎo)，p53去乙?；?，AMP激活蛋白激酶(AMPK)磷酸化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激指示劑GRP78的表達(dá)和與P-TrCP依賴的糖酵解_TrCP、Spl和細(xì)胞周期蛋白Dl的表達(dá)水平)有關(guān)的各種標(biāo)志物的時(shí)間依賴作用的蛋白質(zhì)印跡分析。部分B)顯示如在A中那樣在用CG12和2-DG處理的LNCaP細(xì)胞中經(jīng)RT-PCR的Sirtl、GRP78、^-TrCP, Spl和細(xì)胞周期蛋白Dl的mRNA表達(dá)水平的平行分析。部分C)顯示TZDs在不同劑量下，相對(duì)于2-DG、白藜蘆醇和葡萄糖饑餓對(duì)LNCaP細(xì)胞內(nèi)ER應(yīng)激和AMPK/mT0R/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的蛋白質(zhì)印跡分析。ER應(yīng)激的指示劑包括IREl a的表達(dá)水平，一種ER應(yīng)激傳感器，GRP78和GADD153。免疫印跡和PCR結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖7提供曲線圖和免疫印跡，其顯示TZDs通過(guò)阻斷葡萄糖攝取靶向于能量代謝。部分A)顯示0SU-CG12 (CG12，左小圖)和白藜蘆醇(中間圖)對(duì)[3H]_2_脫氧葡萄糖([3H]-2DG)攝取的劑量和時(shí)間依賴作用。數(shù)據(jù)表示為平均值±95%置信區(qū)間(誤差棒) (n=3)。右小圖，0SU-CG12和白藜蘆醇的球棒結(jié)構(gòu)(ball-and-stile)。部分B)顯示10 y MOSU-CG12相對(duì)于10 mM 2-DG對(duì)在LNCaP細(xì)胞中糖酵解率(左小圖)和NADH (中間圖)和乳酸(右小圖)的細(xì)胞內(nèi)水平的時(shí)間依賴作用。數(shù)據(jù)表示為平均值±95%置信區(qū)間(誤差棒)(n=3)。部分C)證實(shí)補(bǔ)充葡萄糖在LNCaP細(xì)胞內(nèi)對(duì)0SU-CG12的抗增殖活性提供劑量依賴的保護(hù)作用。在所指明濃度的葡萄糖存在下培養(yǎng)的細(xì)胞生存力在藥物處理72小時(shí)后經(jīng)MTT試驗(yàn)測(cè)定。數(shù)據(jù)表示為平均值±95%置信區(qū)間(誤差棒)(n=6)。在部分D)中左小圖證實(shí)補(bǔ)充葡萄糖(20 mg/ml)逆轉(zhuǎn)Sirtl的瞬態(tài)誘導(dǎo)和隨之而來(lái)的24小時(shí)時(shí)間期間內(nèi)p53經(jīng)0SU-CG12在LNCaP細(xì)胞中的去乙酰化。D)的右小圖證實(shí)補(bǔ)充葡萄糖抑制PARP裂解，AMPK激活和GRP78、GADD153和P -TrCP在用不同劑量0SU-CG12處理的LNCaP細(xì)胞中表達(dá)的誘導(dǎo)。免疫印跡結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖8提供曲線圖和免疫印跡，其顯示P -TrCP表達(dá)對(duì)能量限制擬似劑的抗增殖作用是重要的并且通過(guò)Sirtl介導(dǎo)的P-TrCP蛋白穩(wěn)定化向上調(diào)節(jié)。部分A)顯示野生型(WT)或顯性陰性(AF)形式的P-TrCP異位表達(dá)對(duì)通過(guò)0SU-CG12(CG12，左小圖)和2-脫氧葡萄糖(2-DG，左小圖)的LNCaP細(xì)胞生存力的劑量依賴性抑制的作用。細(xì)胞生存力通過(guò)MTT試驗(yàn)測(cè)定。數(shù)據(jù)表示為平均值±95%置信區(qū)間(誤差棒)(n=6)。pCMV，用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。部分B)顯示W(wǎng)T (WT- ^ -TrCP-Myc)和顯性陰性(AF- ^ -TrCP-Myc) ^ -TrCP的異位表達(dá)對(duì)0SU-CG12 (5 u M)和2-DG (5 mM)促進(jìn)LNCaP細(xì)胞中PARP裂解的能力的作用。部分C)顯示在0SU-CG12處理的LNCaP細(xì)胞內(nèi)Sirtl向上調(diào)節(jié)會(huì)升高P -TrCP表達(dá)水平。左小圖，血凝素標(biāo)記的Sirtl異位表達(dá)(HA-Sirtl)以劑量依賴方式增加P-TrCP表達(dá)，伴隨靶蛋白細(xì)胞周期蛋白Dl和Spl表達(dá)相應(yīng)減少。右小圖，顯性陰性抑制Sirtl阻斷0SU-CG12介導(dǎo)的P-TrCP誘導(dǎo)和PARP裂解。部分D)提供Sirtl經(jīng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定增加P-TrCP表達(dá)的證據(jù)。左小圖，Sirtl去乙酰化酶活性對(duì)P-TrCP蛋白經(jīng)0SU-CG12的穩(wěn)定是必要的。通過(guò)煙酰胺或splitomicin的Sirtl去乙酰化酶活性的藥理抑制逆轉(zhuǎn)0SU-CG12提高P -TrCP蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力。LNCaP細(xì)胞用5 u M OSU-CG12單獨(dú)或在50 mM煙酰胺或200 u Msplitomicin存在下預(yù)處理12小時(shí)，隨后用100 u g/mL放線菌酮處理另外12或24小時(shí)。右小圖，RT-PCR分析顯示如以上所描述的那樣處理的LNCaP細(xì)胞中P-TrCP mRNA水平保持不變。所有免疫印跡和PCR結(jié)果為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖9提供免疫印跡，其顯示顯性陰性或藥理抑制AMPK阻斷0SU-CG12介導(dǎo)的自噬，但對(duì)細(xì)胞凋亡或ER應(yīng)激沒(méi)有影響。左小圖，野生型(WT)的異位表達(dá)相對(duì)于K45R激酶死亡、顯性陰性(DN)形式的 AMPK 對(duì) 0SU-CG12 (5 u M)調(diào)節(jié) p-mT0R、p-p70S6K、^ -TrCP 和GADD153的表達(dá)水平，GFP-LC3的轉(zhuǎn)變和在表達(dá)GFP-LC3的LNCaP細(xì)胞中PARP裂解的能力的作用。右小圖，化合物C，一種AMPK藥理抑制劑的作用平行分析。


圖10提供免疫印跡和顯微圖像，其顯示shRNA介導(dǎo)的TSC2的急速下調(diào)保護(hù)細(xì)胞免于0SU-CG12誘導(dǎo)的自噬。左小圖，shRNA介導(dǎo)的TSC2急速下調(diào)的有效性經(jīng)TSC2和p-AMPK在0SU-CG12處理細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)。右小圖，用混雜的或TSC2 shRNA轉(zhuǎn)染的表達(dá)GFP-LC3的LNCaP細(xì)胞被暴露于DMSO或5 y M OSU-CG12 36小時(shí)，，然后經(jīng)熒光顯微法檢測(cè)以評(píng)價(jià)GFP-LC3熒光的模式。
圖11提供曲線圖和免疫印跡圖，其顯示0SU-CG12通過(guò)靶向于AMPK/TSC2/mT0R/ P70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)自噬。部分A)顯示顯性陰性抑制AMPK部分保護(hù)LNCaP細(xì)胞免于0SU-CG12介導(dǎo)的抗增殖作用。數(shù)據(jù)表示為平均值±95%置信區(qū)間(誤差棒)(n = 6)。部分B)顯示siRNA介導(dǎo)的GADD153 (DDIT3)急速下調(diào)不影響PARP裂解、P -TrCP誘導(dǎo)或AMPK激活。所有免疫印跡和熒光顯微鏡撿數(shù)據(jù)為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
圖12，部分(A)提供基于苯亞甲基-噻唑烷二酮的集中化合物庫(kù)的兩層次篩選(two-tiered screening)以鑒定先導(dǎo)AMPK激活劑的示意圖。部分(B)提供系列A-C化合物的合成通法。反應(yīng)條件系列 A a, K2C03/Rl-Br ；b, LAH，THF ；c, (CF3SO2)2O,批啶，CH2Cl2 ；d，K2CO3, DMF ；e, AcOH,哌啶，乙醇 / 回流。系列 B a, AcOH,哌啶，乙醇，回流；b, K2CO3, DMF。系列 C a, K2CO3, DMF ；b,吡啶，CH2Cl2 ；c, LAH，干燥 THF，0°C ；d, MnO2, CH2Cl2,回流；d，哌啶，EtOH，回流；e，AcOH,哌唆，乙醇/回流。
圖13提供基于噻唑烷二酮的集中化合物庫(kù)的化合物1-60的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖14，部分(A)提供AMPK作為mTOR-和IL_6/IL_6受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑作用的示意圖。部分(B)提供環(huán)格列酮和62，每一種在IOy M下，對(duì)在處理6小時(shí)后于含有10% FBS的培養(yǎng)基中相對(duì)于LPS處理的和未處理的(Ctr) THP-I巨噬細(xì)胞在LPS處理的THP-I細(xì)胞內(nèi)AMPK、p70S6K和Stat3的磷酸化作用的蛋白質(zhì)印跡分析。(C)左小圖，環(huán)格列酮(CG)和62在所指明的濃度下于處理6小時(shí)后在含有10% FBS的培養(yǎng)基中對(duì)THP-I巨噬細(xì)胞中LPS刺激的IL-6產(chǎn)生的抑制作用的ELISA分析。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。右小圖，經(jīng)MTT試驗(yàn)(N = 6)對(duì)THP-I細(xì)胞的生存力的相應(yīng)作用。
圖15,部分(A)提供化合物1-60相對(duì)于環(huán)格列酮(CG),每一種在IOii M下,對(duì)處理6小時(shí)后在含由10% FBS的培養(yǎng)基中相對(duì)于僅用LPS處理的(L)和未處理的(Ctr)THP-I巨噬細(xì)胞用LPS處理的THP-I細(xì)胞中AMPK、p70S6K和Stat3的磷酸化作用的影響蛋白質(zhì)印跡分析。部分(B)上圖提供化合物1-60相對(duì)于環(huán)格列酮(CG)，每一種在10 y M下，對(duì)處理6小時(shí)后在含有10% FBS的培養(yǎng)基中的THP-I巨噬細(xì)胞中LPS刺激的IL-6的產(chǎn)生具有抑制作用的ELISA分析。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。在下面的小圖中，顯示了經(jīng)MTT試驗(yàn)(N = 6)對(duì)THP-I細(xì)胞的活力的相應(yīng)作用。
圖16，部分(A)顯示化合物8、12、31、44、49、53和54相對(duì)于環(huán)格列酮(CG)相比較，每一種在IOii M下，對(duì)分化的THP-I細(xì)胞中PPARy激活的作用。THP-I細(xì)胞用PPRE-x3-TK-Luc報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，，然后暴露于在10% FBS補(bǔ)充的RPMI 1640培養(yǎng)基中的各種藥物或DMSO媒介物48小時(shí)。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。部分(B)上圖提供化合物8、12、31、44、49、53和54相對(duì)于環(huán)格列酮(CG)，每一種在I y M下，對(duì)處理6小時(shí)后在含有10% FBS的培養(yǎng)基中的THP-I巨噬細(xì)胞中LPS刺激的IL-6產(chǎn)生的作用的ELISA分析。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。下圖顯示經(jīng)MTT試驗(yàn)(N = 6)對(duì)THP-I細(xì)胞生存力的相應(yīng)作用。
圖17，部分(A)提供化合物53對(duì)處理6小時(shí)后在含有10% FBS的培養(yǎng)基中的THP-I巨噬細(xì)胞中LPS刺激的IL-6產(chǎn)生的劑量依賴作用的ELISA分析。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。部分(B)顯示化合物53對(duì)處理6小時(shí)后在含有10% FBS的培養(yǎng)基中的LPS處理的THP-I巨噬細(xì)胞中的IL-6的mRNA水平的劑量依賴性抑制作用的RT-PCR分析的結(jié)果。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。部分(C)顯示化合物53相對(duì)于0. 5 mM AICAR對(duì)處理6小時(shí)后在含有10% FBS的培養(yǎng)基中LPS處理的THP-I巨噬細(xì)胞中AMPK和p70S6K的磷酸化水平的劑量依賴性作用的蛋白質(zhì)印跡分析。
圖18，部分(A)提供在用顯性陰性(DN)-AMPK質(zhì)粒或pCMV空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的THP-I巨噬細(xì)胞中AMPK表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡分析。部分(B)顯示DN-AMPK的異位表達(dá)對(duì)用或未用10 ii M化合物53共處理的THP-I巨噬細(xì)胞中LPS刺激的IL-6產(chǎn)生的保護(hù)作用。柱狀圖，平均值，棒狀圖，SD (N=3)。部分(C)顯示化合物53對(duì)在含有10% FBS的培養(yǎng)基中的C-26腺癌細(xì)胞中AMPK和p70S6K的磷酸化水平的劑量-和時(shí)間-依賴性作用的蛋白質(zhì)印跡分析。部分(D)顯示化合物53相對(duì)于PTl和A-769662的表面靜電勢(shì)和結(jié)構(gòu)。
圖19提供顯示化合物53和54在不同癌細(xì)胞系中的細(xì)胞生存力的圖表。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供在受試者中限制能量代謝的方法，方法包括給予所述受試者包含噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物。具體地講，本發(fā)明提供在受試者中抑制糖酵解的方法，方法包括給予所述受試者包含式I、式II、式III或式IV的噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物。本發(fā)明提供許多先前尚未用于限制能量代謝的噻唑烷二酮衍生物，其中許多呈現(xiàn)比先有技術(shù)的能量限制擬似劑更高的效力。另一方面，本發(fā)明提供通過(guò)傳遞有效量的噻唑烷二酮衍生物激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的方法。具體地講，本發(fā)明提供通過(guò)提供有效量的式I、式III或式IV的噻唑烷二酮衍生物激活A(yù)MPK的方法。由于激活A(yù)MPK導(dǎo)致抑制IL-6，這些噻唑烷二酮衍生物也可用于通過(guò)給予所述受試者包含式I、III或IV的噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物在受試者中抑制IL-6表達(dá)的方法。定義
如本文提出的術(shù)語(yǔ)僅用于描述實(shí)施方案并且不應(yīng)在總體上構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。當(dāng)用于描述本發(fā)明和所附權(quán)利要求書(shū)時(shí)，單數(shù)形式“一”、“一”和“該”包括其復(fù)數(shù)形式，除非有關(guān)此類的上下文顯示不當(dāng)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“有機(jī)基團(tuán)”用于指被分類為脂族基團(tuán)、環(huán)狀基團(tuán)或脂族與環(huán)狀基 團(tuán)的組合(例如烷芳基和芳烷基)的烴基。在本發(fā)明的上下文中，用于本發(fā)明噻唑烷二酮的合適有機(jī)基團(tuán)為不干擾噻唑烷二酮能量限制活性的那些有機(jī)基團(tuán)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“脂族基團(tuán)”意指飽和或不飽和的線形或分支烴基。該術(shù)語(yǔ)用于包括例如烷基、烯基和鏈炔基。本文使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”、“烯基”和前綴“烷”包括直鏈基團(tuán)和分支鏈基團(tuán)。除非另外規(guī)定，這些基團(tuán)含有1-20個(gè)碳原子，烯基含有2-20個(gè)碳原子。在一些實(shí)施方案中，這些基團(tuán)具有總共至多10個(gè)碳原子、至多8個(gè)碳原子、至多6個(gè)碳原子或至多4個(gè)碳原子。包括4或更少碳原子的烷基也可稱為低級(jí)烷基。烷基也可根據(jù)它們包括的碳原子數(shù)稱謂(即C1-C4烷基為包括1-4個(gè)碳原子的烷基)。本文使用的環(huán)烷基指形成環(huán)結(jié)構(gòu)的烷基(即烷基、烯基或鏈炔基)。環(huán)狀基團(tuán)可為單環(huán)或多環(huán)并且優(yōu)選地具有3-10個(gè)環(huán)碳原子。環(huán)烷基可經(jīng)包括4或更少碳原子的烷基連接于主結(jié)構(gòu)。示例性的環(huán)狀基團(tuán)包括環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、環(huán)戊基、環(huán)己基、金剛烷基及取代和未取代的冰片基、降冰片基和降冰片烯基。除非另外規(guī)定，“亞烷基(alkylene) ”和“亞烯基(alkenylene) ”為以上定義的“烷 基”和“烯基”基團(tuán)的二價(jià)形式。術(shù)語(yǔ)“亞烷基(alkylenyl)”和“亞烯基(alkenylenyl) ”為在“亞烷基”和“亞烯基”分別被取代時(shí)使用。例如，芳基亞烷基包含芳基被連接于其上的亞燒基部分。術(shù)語(yǔ)“鹵代烷基”包括用一個(gè)或更多個(gè)鹵素原子取代的基團(tuán)，包括全氟化基團(tuán)。這對(duì)于其包括前綴“鹵代”的其它基團(tuán)也是真實(shí)的。合適鹵代烷基的實(shí)例為氯甲基、三氟甲基等。鹵代部分包括氯、溴、氟和碘。本文使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”包括碳環(huán)芳環(huán)或環(huán)系統(tǒng)。芳基的實(shí)例包括苯基、萘基、聯(lián)苯基、芴基和茚基。芳基可為取代或未取代的。除非另外指定，術(shù)語(yǔ)“雜原子”指原子O、S或N。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”包括含有至少一個(gè)環(huán)雜原子(例如0、S、N)的芳環(huán)或環(huán)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”包括含有2-12個(gè)碳原子、1-3個(gè)環(huán)、1-4個(gè)雜原子且0、S和/或N作為雜原子的環(huán)或環(huán)系統(tǒng)。合適的雜芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、異吲哚基、三唑基、吡咯基、四唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咔唑基、苯并噁唑基、嘧啶基、苯并咪唑基、喹喔啉基、苯并噻唑基、萘啶基、異噁唑基、異噻唑基、嘌呤基、喹唑啉基、吡嗪基、I -氧化吡啶基、噠嗪基、三嗪基、四嗪基、噁二唑基、噻二唑基等。術(shù)語(yǔ)“亞芳基(arylene)”和“亞雜芳基”為以上定義的“芳基”和“雜芳基”基團(tuán)的二價(jià)形式。術(shù)語(yǔ)“亞芳基(arylenyl)”和“亞雜芳基”為在“亞芳基”和“亞雜芳基”分別被取代時(shí)使用。例如，烷基亞芳基包含烷基被連接于其上的亞芳基部分。當(dāng)基團(tuán)在本文所描述的任何結(jié)構(gòu)式或流程中存在多于一次時(shí)，每一個(gè)基團(tuán)(或取代基)被獨(dú)立地選擇，無(wú)論明確指出與否。例如，對(duì)于式-C(O)-NR2，每一個(gè)R基團(tuán)被獨(dú)立地選擇。作為簡(jiǎn)化，遍及該申請(qǐng)使用的某些術(shù)語(yǔ)的討論和詳述的手段，術(shù)語(yǔ)“基團(tuán)”和“部分”用于在其允許取代或其可被取代的化學(xué)種類與其不允許如此取代或可不被如此取代的那些化學(xué)種類之間進(jìn)行區(qū)別。因此，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“基團(tuán)”用于描述化學(xué)取代基時(shí)，所描述的化學(xué)物質(zhì)包括未取代的基團(tuán)和具有非過(guò)氧化的0、N、S、Si或F原子的基團(tuán)，例如在鏈以及羰基或其它常規(guī)取代基上。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“部分”用于描述化學(xué)化合物或取代基時(shí)，僅有未取代的化學(xué)物質(zhì)打算包括在內(nèi)。例如，短語(yǔ)“烷基”打算不僅包括純的開(kāi)鏈飽和烴烷基取代基例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，而且還包括具有本領(lǐng)域已知的進(jìn)一步的取代基例如輕基、燒氧基、燒基橫酸基、齒原子、氰1基、硝基、氣基、竣基等的燒基取代基。因此，“燒基”包括釀基、齒代燒基、硝基燒基、竣基燒基、輕基燒基、氰1基燒基等。另一方面，短語(yǔ)“燒基部分”限于僅包括純的開(kāi)鏈飽和經(jīng)燒基取代基例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等。本發(fā)明包括本文所描述以任何其藥學(xué)上可接受的鹽形式，包括異構(gòu)體(例如非對(duì)映體和對(duì)映體)、互變異構(gòu)體、鹽、溶劑合物、多晶型、前藥等存在的化合物。具體地講，如果化合物為光學(xué)活性的，本發(fā)明特別地包括化合物的對(duì)映體中的每一種以及對(duì)映體的外消旋混合物。應(yīng)該理解術(shù)語(yǔ)“化合物”包括任何或所有這樣的形式，無(wú)論明確指出與否(盡管有時(shí)“鹽”被明確指出)。本文使用的術(shù)語(yǔ)噻唑烷二酮衍生物為由如本文所提供的結(jié)構(gòu)式描述的本發(fā)明噻唑烷二酮化合物的速記法；并且不打算包括可由本領(lǐng)域技術(shù)人員表征為噻唑烷二酮的所有 可能的化合物。本文使用的“治療”、“醫(yī)治”和“處理”等指提供給處于病癥或疾病例如癌癥風(fēng)險(xiǎn)中或罹患這些病癥的受試者益處的任何作用，包括通過(guò)減輕或抑制至少一種癥狀、延遲疾病進(jìn)展、預(yù)防或延遲疾病發(fā)作等改善病癥。受試者可由于暴露于致癌劑、對(duì)障礙包括糖酵解有遺傳傾向等處于風(fēng)險(xiǎn)中。本文使用的“藥學(xué)上可接受的”意指化合物或組合物從疾病嚴(yán)重性和治療的必要性來(lái)看適合于給予受試者本文所描述方法，而沒(méi)有過(guò)度有害的副作用。術(shù)語(yǔ)“治療有效的”和“藥理有效的”打算使每一種藥物的量具有將實(shí)現(xiàn)降低疾病嚴(yán)重性同時(shí)避免不良副作用例如通常與替代療法相關(guān)的那些副作用目標(biāo)的資格。治療有效量可以一個(gè)或更多個(gè)劑量給藥。另一方面，有效量為足以提供顯著化學(xué)效應(yīng)的量，例如用可檢測(cè)量激活A(yù)MPK。使用噻唑烷二酮衍生物限制能量代謝
本發(fā)明提供通過(guò)給予所述受試者一種或多種本發(fā)明的噻唑烷二酮衍生物在受試者中限制能量代謝的方法。具體地講，本發(fā)明提供通過(guò)給予所述受試者包含一種或多種噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物在受試者中抑制糖酵解方法。本文定義的受試者為動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物例如馴養(yǎng)的家畜(例如，牛、馬、豬)或?qū)櫸?例如狗、貓)。更優(yōu)選地，受試者為人。受試者也可為需要能量限制的受試者。需要能量限制的受試者為由于通過(guò)能量限制引起的各種生化效應(yīng)而得益于能量限制的受試者。例如，需要減少代謝應(yīng)激的受試者可為需要能量限制的受試者。由能量限制所引起的另外作用在本文中描述。需要能量限制的受試者也可為對(duì)于患有癌癥具有升高的風(fēng)險(xiǎn)或已經(jīng)被診斷為患有癌癥的受試者、尚未診斷為患有癌癥的受試者、患有糖尿病的受試者、患有代謝紊亂的受試者或者希望延長(zhǎng)壽命和/或降低代謝水平的受試者。限制能量代謝指的是可例如通過(guò)膳食能量限制例如限制熱量攝入(即熱量限制)產(chǎn)生的作用。膳食能量限制導(dǎo)致減少葡萄糖可用性，導(dǎo)致葡萄糖代謝和糖酵解減少。糖酵解為一系列代謝過(guò)程，通過(guò)此過(guò)程一個(gè)分子的葡萄糖分解代謝成兩分子的丙酮酸以提供兩個(gè)ATP分子的凈收益。在正常細(xì)胞中，糖酵解提供細(xì)胞能量產(chǎn)生的最初步驟并且為三羧酸循環(huán)的前體，其在線粒體中進(jìn)行并產(chǎn)生基本上更大量的ATP每葡萄糖分子。限制能量代謝也可通過(guò)給予稱為能量限制擬似劑的合適化合物來(lái)模擬。例如，
2-脫氧葡萄糖可由于被己糖激酶磷酸化限制能量代謝，其然后被限制在磷酸化狀態(tài)，該狀態(tài)聚集并阻止進(jìn)一步的葡萄糖代謝。本發(fā)明人實(shí)施并在本文中描述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的噻唑烷二酮衍生物能夠引起與饑餓相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)例如沉默信息調(diào)控基因I (regulator)(Sirtl)基因誘導(dǎo)、AMPK激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因?yàn)猷邕蛲槎苌锬軌蛞鹋c饑餓相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)，和由于本文提供的其它原因，噻唑烷二酮衍生物為有效的能量限制擬似劑(ERMs)。抑制糖酵解導(dǎo)致限制能量代謝。糖酵解為使葡萄糖轉(zhuǎn)變成丙酮酸，導(dǎo)致高能量化合物、ATP和NADH的釋放的代謝途徑。在糖酵解正常水平上任何數(shù)量的減少代表關(guān)于本文描述的本發(fā)明能量代謝的限制。然而，本發(fā)明的不同實(shí)施方案可導(dǎo)致不同程度的抑制作用。例如，給予噻唑烷二酮衍生物可導(dǎo)致糖酵解的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或完全抑制，或者在該數(shù)目范圍內(nèi)任何其它顯著水平的抑制作用。所達(dá)到的抑制作用水平可隨所使用噻唑烷二酮衍生物的劑量變化，并且因此為劑量依賴的。盡管可獲得高水平的糖酵解抑制作用，應(yīng)該注意的是更溫和水平，即50%抑制率或更少通常為臨床更加有用的，因?yàn)檫@避免高水平糖酵解抑制作用的潛在毒性。
盡管糖酵解的抑制作用可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種不同化合物和作用進(jìn)行測(cè)量，通常用于測(cè)量糖酵解減少的標(biāo)志物的實(shí)例為細(xì)胞葡萄糖攝取的速率減少，NADH和乳酸的形成減少及自噬的增加，其可通過(guò)自噬體形成的相應(yīng)增加來(lái)鑒定。本發(fā)明的噻唑烷二酮衍生物的這些和其它作用在圖I中用圖表顯示。本發(fā)明的噻唑烷二酮衍生物擾亂葡萄糖穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致標(biāo)志細(xì)胞反應(yīng)，包括瞬態(tài)Sirtl誘導(dǎo)、AMPK激活和ER應(yīng)激。這些反應(yīng)中的每一種在介導(dǎo)TZDs的抗腫瘤作用中起作用。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明在Sirtl誘導(dǎo)與P-TrCP蛋白積累之間的機(jī)械聯(lián)系，通過(guò)一系列凋亡調(diào)節(jié)蛋白的蛋白酶體降解和轉(zhuǎn)錄抑制最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。AMPK激活導(dǎo)致經(jīng)常規(guī)AMPK-TSC2-mT0R-p70S6K途徑自噬。ER應(yīng)激信號(hào)引發(fā)傳感蛋白例如GRP78、GADD153和IREla向上調(diào)節(jié)，它也可在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中起作用。受試者體內(nèi)糖酵解的抑制作用可具有一種或多種有益作用。例如，受試者體內(nèi)糖酵解的抑制作用可提供治療癌癥的方法。糖酵解的抑制作用也可用于在受試者延長(zhǎng)壽命(即提供生命延續(xù)作用)，包括尚未診斷出患有癌癥的受試者。也可進(jìn)行糖酵解的抑制作用以提供本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它作用，例如減少胰島素水平，治療代謝紊亂或刺激自噬。各種噻唑烷二酮衍生物抑制癌癥生長(zhǎng)的能力在以下表I中得到證實(shí)。如經(jīng)
3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四唑鎗溴化物)(MTT)試驗(yàn)測(cè)量的那樣，化合物被試驗(yàn)其減少LNCaP前列腺癌細(xì)胞生存力的能力。測(cè)試的化合物顯示比已知能量限制擬似劑例如2-DG或白藜蘆醇顯著更高的活性(即更低的IC5tl)。許多噻唑烷二酮衍生物抑制癌細(xì)胞增殖的IC5tl值處于低y M范圍內(nèi)，它們分別比白藜蘆醇和2-脫氧葡萄糖更有效至少一至三個(gè)數(shù)量級(jí)。表I.噻唑烷二酮衍生物的抗腫瘤效力
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0 __ .........—5j~~j 3-74,2404.54.S如本文指出的那樣，惡性細(xì)胞相對(duì)于正常細(xì)胞呈現(xiàn)顯著升高的糖酵解活性，稱為Warburg效應(yīng)的作用。幾種機(jī)制已經(jīng)提示有助于該作用，包括線粒體缺陷，適合于癌組織中的缺氧環(huán)境，致瘤信號(hào)和某些代謝酶的異常表達(dá)。因?yàn)榘┘?xì)胞使用線粒體呼吸機(jī)械產(chǎn)生ATP的能力減少，癌細(xì)胞被迫增大其糖酵解活性以維持足夠的ATP產(chǎn)生用于持續(xù)生長(zhǎng)。該代謝適應(yīng)使癌細(xì)胞依賴于糖酵解途徑并易受其抑制作用的侵害。另外，因?yàn)樵摯x變化在癌細(xì)胞中幾乎是無(wú)所不在的，靶向于糖酵解途徑代表用于治療廣泛種類的不同類型癌癥的有用方法。使用糖酵解抑制作用用于抗癌治療的進(jìn)一步討論，參見(jiàn)Pelicano等，Oncogene,25，第 4633-4646 頁(yè)(2006)。當(dāng)糖酵解受到抑制時(shí)，正常細(xì)胞中完整的線粒體使它們能夠使用替代能源例如脂肪酸和氨基酸以產(chǎn)生代謝中間體，其引導(dǎo)至三羧酸循環(huán)用于通過(guò)呼吸產(chǎn)生ATP。結(jié)果，具有 正常線粒體的細(xì)胞相對(duì)于癌細(xì)胞對(duì)抑制糖酵解的藥物不太敏感，提供治療選擇性。因此，本發(fā)明由于噻唑烷二酮衍生物的選擇性抑制癌細(xì)胞中糖酵解的能力，提供使用它們治療癌癥的方法。癌癥治療的有效性可通過(guò)在對(duì)給予噻唑烷二酮衍生物有反應(yīng)的受試者中評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷的減少或腫瘤生長(zhǎng)的降低來(lái)測(cè)量。腫瘤負(fù)荷減少可代表質(zhì)量直接降低，或者其可根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)延遲來(lái)測(cè)量，其通過(guò)自所治療腫瘤生長(zhǎng)至一定體積所需要的時(shí)間減去對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)至相同體積的平均時(shí)間計(jì)算。噻唑烷二酮衍生物可用于治療和預(yù)防癌癥兩者。本文使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”包括在處于風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中或者完全防止臨床上明顯不需要的細(xì)胞增殖發(fā)作或者防止不需要的快速細(xì)胞增殖的臨床前明顯階段的發(fā)作。也打算由該定義包括的是預(yù)防惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或者阻止或扭轉(zhuǎn)惡性細(xì)胞的進(jìn)展。這包括預(yù)防性治療具有發(fā)展前癌和癌癥的升高風(fēng)險(xiǎn)的那些預(yù)防。風(fēng)險(xiǎn)升高代表高于受試者患上其可例如通過(guò)家族史或檢測(cè)引起易于發(fā)生癌癥的基因測(cè)定的癌癥的平均風(fēng)險(xiǎn)。癌細(xì)胞含有已導(dǎo)致細(xì)胞相對(duì)無(wú)限制生長(zhǎng)的遺傳損傷。存在于癌細(xì)胞中的遺傳損傷在癌細(xì)胞系的后代作為可遺傳特征被保持。用本發(fā)明方法治療的癌癥可為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或在本文得到描述的任何形式的癌癥。表現(xiàn)為實(shí)體瘤和而是替代形成如在白血病通常所見(jiàn)的非實(shí)體瘤的癌癥兩者的癌癥可得到治療。基于所有類型癌癥中有氧糖酵解增加的普遍性，本發(fā)明提供用于治療受到各種不同類型癌癥包括癌、肉瘤和淋巴瘤困擾的受試者的方法。本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)噻唑烷二酮衍生物可用于抑制多種不同類型癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。例如，已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)噻唑烷二酮衍生物用于抑制前列腺癌、乳腺癌、白血病、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌和腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的有效性。這些實(shí)驗(yàn)在本文后面提供的實(shí)施例2中描述。用噻唑烷二酮衍生物抑制糖酵解也可用于治療II型糖尿病或代謝綜合征。本文定義的代謝綜合征為可導(dǎo)致發(fā)生心臟病或糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增大的疾病組合，并且其特征在于多種選自以下的癥狀如在2型糖尿病或空腹血糖受損觀察到的空腹高血糖、糖耐量受損或胰島素抗性；高血壓、伴有主要圍繞腰部的脂肪沉積的中央肥胖、HDL膽固醇減少和甘油三酯升高。通過(guò)傳遞給有需要的受試者藥用組合物中治療有效量的噻唑烷二酮衍生物，噻唑烷二酮衍生物可用于治療或預(yù)防II型糖尿病或代謝綜合征。由于它們影響本文描述的糖酵解，并且也由于其對(duì)AMPK的作用，噻唑烷二酮衍生物為有效的。已知AMPK系統(tǒng)作為真核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器起作用，并且對(duì)代謝控制和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用。Towler 等，Circ Res, 100，328-341 (2007)。通過(guò)給予噻唑烷二酮衍生物在受試者提供能量代謝限制的另一個(gè)潛在益處是其可延長(zhǎng)所治療受試者的壽命，從而提供生命延續(xù)(prolongevity)作用。實(shí)驗(yàn)室大鼠和小鼠體內(nèi)重復(fù)性的長(zhǎng)壽研究已經(jīng)證實(shí)，能量限制可顯著增加壽命和延遲年齡相關(guān)疾病的發(fā)病。類似的作用已在許多無(wú)脊椎動(dòng)物種類觀察到，并且在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的最近研究已顯示能量限制產(chǎn)生與在嚙齒類觀察到的那些相平行的生理作用。評(píng)價(jià)能量限制擬似劑對(duì)壽命作用的研究也得到實(shí)施。參見(jiàn) Ingram 等，Ann N Y Acad Sci. , 1019 第 412-23 頁(yè)(2004)。
對(duì)能量限制擬似劑的生命延續(xù)作用的幾種機(jī)制已被提出，包括氧化應(yīng)激減少，炎癥控制和防止大分子的糖基化。具體地講，人們注意到抑制糖酵解可刺激自噬，后者可導(dǎo)致清除釋放顯著量的活性氧種類的細(xì)胞器。已進(jìn)一步假設(shè)能量限制的生命延續(xù)作用可為將有機(jī)體的能量重定向于針對(duì)生存而不是低的能量可用率期間再生的進(jìn)化上保守的應(yīng)激反應(yīng)。生命延續(xù)作用為當(dāng)與未治療的受試者比較增加用治療有效劑量的能量限制擬似劑治療的受試者平均壽命的作用。盡管生命延續(xù)作用也可在被診斷患有疾病例如癌癥的受試者中實(shí)現(xiàn)，生命延續(xù)作用可在健康受試者中實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樗鲎饔貌灰蕾囉诩膊〉娜コＲ驗(yàn)樯永m(xù)作用作為預(yù)防慢性問(wèn)題例如氧化應(yīng)激或炎癥的結(jié)果被觀察到，為觀察到顯著的生命延續(xù)作用受試者必須治療延長(zhǎng)的時(shí)間段。基于小鼠中觀察到的結(jié)果，生命延續(xù)作用可提供壽命增加 10%、20%、30% 或 40%。Mattson, M. P. , Annu. Rev. Nutr. 25:第 237-60 頁(yè)(2005)。生命延續(xù)作用可在已診斷為健康的受試者或尚未診斷為患有疾病或紊亂的受試者中提供。例如，生命延續(xù)作用可在已診斷為不患有癌癥的受試者或尚未診斷患有癌癥的受試者中提供。用于診斷癌癥的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。作為他們努力研究多種噻唑烷二酮衍生物活性的一部分，本發(fā)明人實(shí)施內(nèi)部基于噻唑烷二酮的集中化合物庫(kù)的篩選，以鑒定具有介導(dǎo)不依賴過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) y激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)和抑制白細(xì)胞介素(IL)-6產(chǎn)生能力的化合物。與脂多糖(LPS)刺激的THP-I人巨噬細(xì)胞內(nèi)激活狀態(tài)的AMPK和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)的同系物(即AMPK和p70核糖體蛋白S6激酶分別磷酸化)，和IL-6/IL-6受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(即IL-6產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與轉(zhuǎn)錄激活因子3分別磷酸化)有關(guān)的基于細(xì)胞的試驗(yàn)被用于篩選該化合物庫(kù)，這導(dǎo)致鑒定各種有活性的噻唑烷二酮衍生物，伴隨化合物53(N- {4- [3- (I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基-甲基]-苯基} -4-硝基-3-三氟甲基-苯磺酰胺)被鑒定為先導(dǎo)化合物。在本文的實(shí)施例中描述的證據(jù)表明抑制IL-6產(chǎn)生可歸因于AMPK激活。噻唑烷二酮衍生物介導(dǎo)的AMPK激活也在C-26結(jié)腸腺癌細(xì)胞中得到證實(shí)，表明該作用不是細(xì)胞系特異性的。AMPK代表用于治療II型糖尿病、代謝綜合征和癌癥的治療性相關(guān)靶標(biāo)，進(jìn)一步支持使用噻唑烷二酮衍生物作為能量限制擬似劑。因此，本發(fā)明的另一方面提供通過(guò)提供有效量的噻唑烷二酮衍生物激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶的方法。另外，本發(fā)明的另一方面提供通過(guò)給予所述受試者包含一種或多種本文描述的作為AMPK激活劑有效的噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物在受試者中抑制IL-6表達(dá)的方法。噻唑烷二酮衍生物
本發(fā)明的噻唑烷二酮衍生物包括式I、II、III和IV的化合物。例如，噻唑烷二酮衍生物可為具有以下式I的化合物
%I
其中R1為氫或羥基；其中R2和R3選自氫、羥基、鹵代、氨基、甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、硝基、氨基磺酰基、三氟甲基磺?；望u代烷基部分；并且其中R4選自烷基、烯基、環(huán)烷基和芳基。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，R1為羥基。在其它的實(shí)施方案中，R2為三氟甲基，而在另外的其它實(shí)施方案中，R3為氫。 在其它的實(shí)施方案中，式I的噻唑烷二酮衍生物可為以下所顯示的任何一種化合物。例如，噻唑烷二酮衍生物可為任何一種以下化合物
(Z)-5-(4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-噻唑烷-2，4-二酮(0SU-CG12)
O
(Z) -3-(2-乙基-丁基)-5-(4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮(0SU-CG5)
O
O (
(Z) -3- (2-乙基-戊基)-5- (4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮 (Z) -5- (4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (4-異丙基-芐基)-噻唑烷-2，4- 二酮
權(quán)利要求
1.在受試者中抑制糖酵解的方法，該方法包括給予所述受試者包含以下式I化合物的藥用組合物
2.權(quán)利要求I的方法，其中R1為羥基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中R2為三氟甲基。
4.權(quán)利要求3的方法，其中R3為氫。
5.權(quán)利要求4的方法，其中化合物為(Ζ)-5-(4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)_噻唑烷-2，4-二酮或(Z)-3-(2-乙基-丁基)-5-(4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮。
6.權(quán)利要求3的方法，其中R3為羥基。
7.權(quán)利要求6的方法，其中化合物選自(Z)-5-(3，4-二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (I-甲基-環(huán)己基甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (2-乙基-丁基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (2-乙基-戊基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (4-異丙基-芐基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3- (4-叔丁基-芐基)-5- (3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z)-5-(3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (2-三氟甲基-芐基)-噻唑烷_(kāi)2，4- 二酮、(Z) -3-環(huán)己基甲基-5- (3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3-芐基-5- (3，4- 二羥基_5_三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3-環(huán)庚基甲基-5- (3，4- 二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4-二酮和(Z)-5-(3，4-二羥基-5-三氟甲基-苯亞甲基)-3-異丁基-噻唑烷_(kāi)2，4-二酮。
8.權(quán)利要求I的方法，其中R1為氫且R2和R3為鹵代部分。
9.權(quán)利要求8的方法，其中化合物選自(Z)-5-(3，5-二溴-苯亞甲基)-3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-3- (2-乙基-丁基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-3- (2-乙基-戊基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-3- (4-異丙基-芐基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3- (4-叔丁基-芐基)-5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-3- (2-三氟甲基-芐基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3-環(huán)己基甲基-5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3-芐基-5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮、(Z) -3-環(huán)庚基甲基-5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮和(Z) -5- (3，5- 二溴-苯亞甲基)-3-異丁基-噻唑烷-2，4- 二酮。
10.權(quán)利要求I的方法，其中受試者對(duì)于患有癌癥具有升高的風(fēng)險(xiǎn)或已經(jīng)被診斷為患有癌癥。
11.用于在受試者中抑制糖酵解的方法，該方法包括給予所述受試者包含以下式II化合物的藥用組合物
12.權(quán)利要求11的方法，其中R1選自
13.權(quán)利要求11的方法，其中R2選自氫、溴、氯、甲基、甲氧基、乙氧基和硝基；和&選自氫、甲基、甲氧基和溴。
14.權(quán)利要求11的方法，其中化合物具有以下結(jié)構(gòu)
15.權(quán)利要求11的方法，其中受試者對(duì)于患有癌癥具有升高的風(fēng)險(xiǎn)或已經(jīng)被診斷為患有癌癥。
16.在受試者中抑制糖酵解的方法，該方法包括給予所述受試者包含以下式III化合物的藥用組合物
17.權(quán)利要求16的方法，其中化合物選自5-[3_溴-4-(6-乙氧基_2，5，7，8-四甲基-色烷-2-基甲氧基)-苯亞甲基]-噻唑烷_(kāi)2，4- 二酮、5-[4- (6- 丁氧基-2，5，7，8-四甲基-色烷-2-基甲氧基)-3-甲氧基-苯亞甲基]-噻唑烷-2，4- 二酮和4-{2-[2-溴-4-(2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基)-苯氧基甲基]-2，5，7，8-四甲基-色燒-6-基氧基} - 丁臆。
18.在受試者中抑制糖酵解的方法，該方法包括給予所述受試者包含以下式IV化合物的藥用組合物
19.權(quán)利要求18的方法，其中化合物選自4-甲氧基-N-{4-[3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基]-苯基}-苯磺酰胺、N-{4-[3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基-甲基]-苯基}-4-硝基-3-三氟甲基-苯磺酰胺和N- {4-[3- (I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基]-苯基} -4-硝基苯磺酰胺。
20.通過(guò)提供有效量的噻唑烷二酮衍生物激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶的方法，所述噻唑烷二酮衍生物選自式III化合物
21.權(quán)利要求20的方法，其中噻唑烷二酮衍生物為以下式III的化合物
22.權(quán)利要求21的方法，其中化合物選自5-[3-溴-4-(6-乙氧基-2，5，7，8-四甲基-色烷-2-基甲氧基)_苯亞甲基]-噻唑烷_(kāi)2，4- 二酮、5-[4-(6_ 丁氧基-2，5，7，8-四甲基-色烷-2-基甲氧基)-3-甲氧基-苯亞甲基]-噻唑烷-2，4- 二酮和4-{2- [2-溴-4- (2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基)-苯氧基甲基]_2，5，7，8-四甲基-色燒-6-基氧基} - 丁臆。
23.權(quán)利要求20的方法，其中噻唑烷二酮衍生物為以下式I的化合物
24.權(quán)利要求23的方法，其中化合物選自5-(4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (I-甲基-環(huán)己基甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮和5- (4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3-丙基-噻唑烷-2，4- 二酮。
25.權(quán)利要求20的方法，其中噻唑烷二酮衍生物為以下式III的化合物
26.權(quán)利要求25的方法，其中化合物選自4-甲氧基-N-{4-[3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基]-苯基}-苯磺酰胺、N-{4-[3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基-甲基]-苯基}-4-硝基-3-三氟甲基-苯磺酰胺和N- {4-[3- (I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基]-苯基} -4-硝基苯磺酰胺。
27.在受試者中抑制IL-6表達(dá)的方法，該方法包括給予所述受試者包含噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物，所述噻唑烷二酮衍生物選自式III化合物
28.權(quán)利要求27的方法，其中化合物選自5-[3_溴-4-(6-乙氧基_2，5，7，8-四甲基-色烷-2-基甲氧基)-苯亞甲基]-噻唑烷_(kāi)2，4- 二酮、5-[4- (6- 丁氧基-2，5，7，8-四甲基-色烷-2-基甲氧基)-3-甲氧基-苯亞甲基]-噻唑烷-2，4- 二酮和4-{2-[2-溴-4-(2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基)-苯氧基甲基]-2，5，7，8-四甲基-色燒-6-基氧基} - 丁臆。
29.權(quán)利要求27的方法，其中化合物選自5-(4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3- (I-甲基-環(huán)己基甲基)-噻唑烷-2，4- 二酮和5- (4-羥基-3-三氟甲基-苯亞甲基)-3-丙基-噻唑烷-2，4- 二酮。
30.權(quán)利要求27的方法，其中化合物選自4-甲氧基-N-{4-[3-(I-甲基-環(huán)己基甲 基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基]-苯基}-苯磺酰胺、N-{4-[3-(I-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基-甲基]-苯基}-4-硝基-3-三氟甲基-苯磺酰胺和N-{4-[3-(1-甲基-環(huán)己基甲基)-2，4- 二氧代-噻唑烷-5-亞基甲基]-苯基}-4-硝基苯磺酰胺。
全文摘要
通過(guò)給予受試者包括噻唑烷二酮衍生物的藥用組合物在受試者中抑制糖酵解的方法得到描述。噻唑烷二酮衍生物為有效的能量限制擬似劑，并可因此在受試者用于治療或預(yù)防癌癥、治療代謝紊亂或延長(zhǎng)受試者的壽命。各種噻唑烷二酮衍生物也適合于激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶或抑制IL-6表達(dá)。
文檔編號(hào)A01N43/40GK102638980SQ201080055915
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者C-S.陳, J-H.古 申請(qǐng)人:俄亥俄州州立大學(xué)研究基金會(huì)