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通過多價(jià)寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物抑制細(xì)菌蛋白的產(chǎn)生的制作方法

文檔序號(hào):113908閱讀:271來源:國知局
專利名稱:通過多價(jià)寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物抑制細(xì)菌蛋白的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物和抑制細(xì)菌蛋白生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)
開發(fā)用于控制細(xì)菌增殖的新試劑具有極為重要的意義。雖然獲取抗生素試劑的分子方法已經(jīng)產(chǎn)生了有意義的結(jié)果,但是由于細(xì)菌建立了對(duì)抗生素的抗性,目前的抗生素治療變得愈加受限。存在靶向多個(gè)細(xì)菌功能的多個(gè)類型的抗生素。雖然沒有窮盡性的列表, 但是一些特性包括靶向細(xì)菌蛋白生產(chǎn)(反義阻斷,例如抗核糖體試劑)、細(xì)菌細(xì)胞壁完整性和基因組完整性(例如DNA促旋酶)。雖然如此,這些試劑中的大部分已經(jīng)被細(xì)菌進(jìn)化和通過接合發(fā)展出的可遺傳的抗性中和,而預(yù)期其他試劑也將遇到相同的命運(yùn)。在一些情況下, 細(xì)菌抗性從一種細(xì)菌跳躍到另一種細(xì)菌。此外,目前抗生素的廣泛使用已經(jīng)導(dǎo)致了抵抗大多數(shù)醫(yī)藥干預(yù)的“超級(jí)菌株”的出現(xiàn)。因此,靶向細(xì)菌的新型藥物是優(yōu)先研究對(duì)象?,F(xiàn)已證明可多價(jià)寡核苷酸納米顆粒綴合物具有用于遺傳調(diào)控和真核系統(tǒng)中的檢測(cè)策略的顯著能力。對(duì)于基因調(diào)控,通過激活RNA干擾途徑或通過螯合作用和/或在反義策略中降解mRNA阻斷蛋白生產(chǎn)。在檢測(cè)的情況下,可將與寡核苷酸納米顆粒綴合物結(jié)合的 mRNA翻譯成熒光信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中,納米顆粒綴合物是無毒且穩(wěn)定的,對(duì)互補(bǔ)靶標(biāo)具有較高的親和性,并且能夠不借助轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入細(xì)胞。然而,寡核苷酸在細(xì)菌中,特別是作為殺菌劑的應(yīng)用價(jià)值有限。現(xiàn)已開發(fā)出有限數(shù)量的試劑,但其從未被廣泛使用。盡管在概念上討論,但此策略未得到充分利用是由于技術(shù)上的挑戰(zhàn)(例如,基因敲減(knockdown)能力差、不能實(shí)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)遞送和寡核苷酸鏈在細(xì)菌內(nèi)的穩(wěn)定性(即核酸酶抗性))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了包含寡核苷酸修飾的納米顆粒和載體的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與原核基因的目標(biāo)非編碼序列充分互補(bǔ),所述互補(bǔ)的程度使其足以與所述目標(biāo)序列在允許雜交的條件下雜交。本文所述的抗生素組合物進(jìn)入原核細(xì)胞,并調(diào)控原核基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
在一些實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中與原核基因的雜交抑制原核細(xì)胞的生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中寡核苷酸的雜交抑制由原核基因編碼的功能性原核蛋白的表達(dá)。一方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,該抗生素組合物對(duì)功能性原核蛋白的表達(dá)的抑制為約75%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中所述雜交導(dǎo)致具有活性改變的原核基因編碼的蛋白的表達(dá)。一方面,提供抗生素組合物,其中與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,所表達(dá)的基因產(chǎn)物的活性降低約10%。另一方面,提供抗生素組合物,其中與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,所表達(dá)的基因產(chǎn)物的活性提高約 10%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中寡核苷酸與靶序列的雜交抑制原核基因的轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中寡核苷酸與靶序列的雜交抑制由原核基因編碼的功能性原核蛋白的翻譯。本發(fā)明還提供抗生素組合物,其中寡核苷酸的雜交抑制對(duì)原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的表達(dá)。在多個(gè)方面,提供抗生素組合物,其中所述寡核苷酸的雜交抑制原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的表達(dá),所述原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白選自以下組成的組革蘭氏陰性基因產(chǎn)物、革蘭氏陽性基因產(chǎn)物、細(xì)胞周期基因產(chǎn)物、參與DNA復(fù)制的基因產(chǎn)物、細(xì)胞分裂基因產(chǎn)物、參與蛋白合成的基因產(chǎn)物、細(xì)菌促旋酶和?;d體基因產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中所述原核基因編碼賦予抗生素抗性的蛋白。在一些實(shí)施方式中,所提供的抗生素組合物還包含抗生素試劑。在多個(gè)方面,提供抗生素組合物,其中所述抗生素試劑選自由以下組成的組青霉素G、甲氧西林、萘夫西林、 苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氨芐青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐青霉素、美洛西林、 阿洛西林、哌拉西林、亞胺培南、氨曲南、頭孢噻吩、頭孢克洛、頭孢西丁、頭孢呋辛、頭孢尼西、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢丙烯、氯碳頭孢、頭孢他美、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢他唆、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢泊肟、頭孢磺啶、氟羅沙星、萘啶酸、諾氟沙星、 環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、西諾沙星、強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、鏈霉素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、依托紅霉素、紅霉素琥珀酸乙酯、葡庚糖酸紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素、萬古霉素、 替考拉寧、氯霉素、克林霉素、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、利福平、莫匹羅星、甲硝唑、 頭孢氨芐、羅紅霉素、阿莫西林-克拉維酸鹽組合(Co-amoxiclavuanate)、哌拉西林和他唑巴坦的組合,及其各種鹽、酸、堿和其他衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與原核基因的非編碼鏈中的序列充分互補(bǔ)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與原核基因的非編碼鏈中的序列充分互補(bǔ),以形成三鏈結(jié)構(gòu)。在一些方面,提供抗生素組合物, 其中所述雜交在所述寡核苷酸和非編碼序列以及與所述非編碼序列互補(bǔ)的編碼序列之間形成三鏈結(jié)構(gòu)。在另一些方面,提供抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與原核基因的非編碼鏈中的序列充分互補(bǔ),所述互補(bǔ)的程度使其足以在所述寡核苷酸和所述非編碼序列之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在一些方面,所述非編碼序列為啟動(dòng)子序列。在一些實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中寡核苷酸與3'非編碼序列雜交。在另一些實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其中寡核苷酸與5'非編碼序列雜交。本發(fā)明還提供了抗生素組合物,其與靶序列在體外雜交。在一些實(shí)施方式中,提供抗生素組合物,其與靶序列在體內(nèi)雜交。本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞中功能性靶基因產(chǎn)物產(chǎn)生的方法,其包括使所述細(xì)胞在一定條件下接本發(fā)明的抗生素組合物的步驟,其中在所述條件下雜交導(dǎo)致由靶基因編碼的功能性蛋白產(chǎn)生被抑制。在另一個(gè)實(shí)施方式中提供了治療原核生物感染的方法,所述方法包括向細(xì)胞施用治療有效量的包含本發(fā)明納米顆粒的組合物的步驟。 本發(fā)明還提供了包含抗生素和本發(fā)明的納米顆粒的試劑盒。


圖1描述了阻斷啟動(dòng)子復(fù)合物結(jié)合(A)和全長(zhǎng)mRNA轉(zhuǎn)錄本(B)形成的寡核苷酸金納米顆粒綴合物的示意圖。圖2描述了綴合物處理后的大腸桿菌的電子顯微鏡圖片。圖3描述了使用納米顆粒抑制細(xì)菌熒光素酶表達(dá)的結(jié)果總結(jié)。無義表示在大腸桿菌基因組或轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上沒有互補(bǔ)區(qū)的序列。反義是指靶向熒光素酶的序列。相對(duì)熒光素酶活性顯示為柱內(nèi)相對(duì)于海腎熒光素酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的百分比。圖4顯示了雙鏈侵入示意圖。A)雙鏈通過納米顆粒侵入的示意圖(位于雙鏈末端熒光素酶和相鄰的dabcyl),從而釋放熒光信號(hào)。B)結(jié)果證明在短雙鏈(20堿基對(duì))和長(zhǎng)雙鏈(40堿基對(duì))中熒光都隨著雙鏈侵入而增加(灰色盒代表無義序列,黑色盒代表反義序列)。
具體實(shí)施例方式本文提供了抗生素組合物及其使用方法。一方面,所述抗生素組合物包含經(jīng)修飾而包含寡核苷酸的納米顆粒,其中所述寡核苷酸與原核基因的目標(biāo)非編碼序列充分互補(bǔ), 所述互補(bǔ)的程度足以使寡核苷酸可與目標(biāo)序列在允許雜交的條件下雜交。通過這種雜交, 抗生素組合物抑制了目標(biāo)原核細(xì)胞的生長(zhǎng)。在某些方面,在目標(biāo)細(xì)胞中,雜交抑制了由目標(biāo)序列編碼的功能性蛋白的表達(dá)。在各個(gè)方面,抑制由目標(biāo)序列編碼的原核蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯或轉(zhuǎn)錄和翻譯二者。本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用本文公開的抗生素組合物抑制細(xì)胞中目標(biāo)原核基因產(chǎn)物生產(chǎn)的方法,所述方法包括使所述細(xì)胞接觸抗生素組合物的步驟,其中與所述組合物的納米顆粒結(jié)合的寡核苷酸在允許雜交的條件下與細(xì)菌基因的目標(biāo)非編碼序列充分互補(bǔ),并且其中雜交導(dǎo)致由目標(biāo)基因編碼的功能性原核基因產(chǎn)物被抑制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解,抑制目標(biāo)原核序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯或轉(zhuǎn)錄和翻譯二者導(dǎo)致由目標(biāo)原核序列編碼的功能性蛋白的生產(chǎn)被抑制。寡核苷酸官能化的納米顆粒與目標(biāo)原核序列的雜交形成本文定義的“復(fù)合物”。本文使用的“復(fù)合物”是雙鏈(或雙元)復(fù)合物或三鏈(或三元)復(fù)合物。本文認(rèn)為三元復(fù)合物和二元復(fù)合物抑制目標(biāo)細(xì)菌原核酸的翻譯或轉(zhuǎn)錄。本文使用的“非編碼序列”具有本領(lǐng)域接受的含義。非編碼序列通常描述了不包含用于翻譯由該基因編碼的蛋白的密碼子的多核苷酸序列。在一些方面,非編碼序列是染色體的。在一些方面,非編碼序列是染色體外的。在一些方面,非編碼序列與所述基因的所有或部分編碼序列互補(bǔ)。非編碼序列包括調(diào)控元件,例如表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子。 非編碼序列的實(shí)例是5'非編碼序列和3'非編碼序列?!?'非編碼序列”是指位于編碼序列5'(上游)的多核苷酸序列。5'非編碼序列可存在于起始密碼子上游的完全加工mRNA 中,并可影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄本至mRNA的加工、mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率?!?'非編碼序列”是指位于編碼序列3'(下游)的多核苷酸序列,并且包括多腺苷酸化信號(hào)序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的信號(hào)的其他序列。多腺苷酸化信號(hào)的特征通常在于其影響多腺苷酸序列向mRNA前體3'末端添加的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中,非編碼序列包含啟動(dòng)子。“啟動(dòng)子”是指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。啟動(dòng)子通常位于基因的5'非編碼序列中,緊鄰結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。 啟動(dòng)子內(nèi)在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)中發(fā)揮作用的序列元件通常被表征為共有的核苷酸序列。這些啟動(dòng)子元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件[DSh ;McGehee et al.,Mol. Endocrinol. 7 :551 (1993)]、環(huán)式 AMP 反應(yīng)元件(CREs)、血清反應(yīng)元件[SREs ; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1 :47 (1990)]、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GREs)和其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)例如 CRE/ATF
, AP2 [Ye et al.,J. Biol. Chem.洸9 :257 (1994) ]、SP1、cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白[CREB ; Loeken, Gene Expr. 3 :253 (1993)]和八聚物因子[大致參見 Watson et al.,eds., Molecular Biology of the Gene,4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)和 Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303 :1 (1994)]。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,則轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而提高。與此不同,如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑調(diào)控。阻遏型啟動(dòng)子也是已知的?!昂诵膯?dòng)子”包含用于啟動(dòng)子功能的必需核苷酸序列,包括TATA盒和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。根據(jù)此定義,在缺失可增強(qiáng)活性或賦予組織特異性活性的特異序列的情況下,核心啟動(dòng)子可具有或沒有可檢測(cè)的活性。在一個(gè)實(shí)施方式中,非編碼序列包含調(diào)控元件?!罢{(diào)控元件”是調(diào)控核心啟動(dòng)子活性的多核苷酸序列。例如,調(diào)控元件可包含與細(xì)胞因子結(jié)合的多核苷酸序列,所述細(xì)胞因子能夠在具體原核生物中排他地或優(yōu)先地轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中,非編碼序列包含增強(qiáng)子?!霸鰪?qiáng)子”是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的調(diào)控元件,與增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的相對(duì)距離或朝向無關(guān)。應(yīng)注意,除非另有清楚說明,用于本說明書和權(quán)利要求書中的單數(shù)形式 “一”(〃 a"、“ an"和〃 the")包括復(fù)數(shù)形式。應(yīng)注意,本文中的術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交換使用并具有本領(lǐng)域可接受的含義。還應(yīng)注意,本文中的術(shù)語“連接”、“結(jié)合”和“官能化”也可交換使用并且是指寡核苷酸與納米顆粒的締合。“雜交”是指核酸的兩條或三條鏈之間按照Watson-Crick DNA互補(bǔ)原則通過氫鍵、 Hoogstein結(jié)合或本領(lǐng)域抑制的其他序列特異性結(jié)合的相互作用。雜交可以在本領(lǐng)域抑制的不同嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。抗生素組合物在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了抗生素組合物,所述抗生素組合物包含經(jīng)修飾而包含寡核苷酸的納米顆粒和載體,其中所述寡核苷酸與原核基因的目標(biāo)非編碼序列充分互補(bǔ),所述互補(bǔ)的程度足以使所述寡核苷酸可在允許雜交的條件下與目標(biāo)序列雜交。在多個(gè)實(shí)施方式中,配制抗生素組合物以將治療有效量施用給需要治療原核細(xì)胞感染的哺乳動(dòng)物。在一些方面,所述哺乳動(dòng)物是人。在多個(gè)實(shí)施方式中,預(yù)期寡核苷酸修飾的納米顆粒與原核基因的雜交抑制(或防止)了原核細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,預(yù)期寡核苷酸修飾的納米顆粒與原核基因的雜交在原核生物是細(xì)菌的情況下導(dǎo)致細(xì)菌抑制或殺菌的作用。當(dāng)雜交在體內(nèi)發(fā)生的情況下,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞的生長(zhǎng)相比,原核細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞的生長(zhǎng)相比,原核細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約;35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、 約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%,約2倍、約3倍、約4 倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約50倍或更多。當(dāng)雜交在體外發(fā)生的情況下,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞的生長(zhǎng)相比,原核細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞的生長(zhǎng)相比,原核細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %,約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約 9倍、約10倍、約20倍、約50倍或更多。無論是體內(nèi)抑制還是體外抑制,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都能使用常規(guī)技術(shù)確定原核細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制水平。例如,通過獲得樣品組(例如,在體內(nèi)抑制的情況下的體液,或在體外抑制情況下的液體培養(yǎng)物樣品)進(jìn)行原核細(xì)胞數(shù)量的直接量化,其中在一段時(shí)間內(nèi)收集樣品,將樣品培養(yǎng)在允許固體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上,并計(jì)數(shù)能夠生長(zhǎng)的原核細(xì)胞的所得數(shù)量。在較晚時(shí)間點(diǎn)的原核細(xì)胞數(shù)量與在較早時(shí)間點(diǎn)的原核細(xì)胞數(shù)量的比較產(chǎn)生了原核細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制百分比。在一些實(shí)施方式中,預(yù)期寡核苷酸修飾的納米顆粒與原核基因的雜交抑制了由原核基因編碼的功能性原核蛋白的表達(dá)。本文使用的“功能性原核蛋白”是指由原核基因編碼的全長(zhǎng)野生型蛋白。一方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,功能性原核蛋白的表達(dá)被抑制約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比, 功能性原核蛋白的表達(dá)被抑制約10 %、約15 %、約20 %、約25 %、約30 %、約35 %、約40 %、 約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%,約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、 約50倍或更多。在相關(guān)的方面,寡核苷酸修飾的納米顆粒與原核基因的雜交抑制了原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的表達(dá)。一方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比, 原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的表達(dá)被抑制約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的表達(dá)被抑制約10%、 約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%,約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、 約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約50倍或更多。
生長(zhǎng)所必需的原核蛋白包括,但不限于革蘭氏陰性基因產(chǎn)物、革蘭氏陽性基因產(chǎn)物、細(xì)胞周期基因產(chǎn)物、參與DNA復(fù)制的基因產(chǎn)物、細(xì)胞分裂基因產(chǎn)物、參與蛋白合成的基因產(chǎn)物、細(xì)菌促旋酶和?;d體基因產(chǎn)物。下文詳細(xì)討論了這些類型。本發(fā)明還涉及抗生素組合物,其中與原核基因的目標(biāo)非編碼序列的雜交導(dǎo)致表達(dá)具有活性改變的原核基因編碼的蛋白。一方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞中的蛋白活性相比,由原核基因編碼的蛋白活性降低約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞中的蛋白活性相比,原核蛋白的活性被抑制約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%。另一方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞中的蛋白活性相比,由原核基因編碼的蛋白活性提高約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸寡核苷酸修飾的納米顆粒的原核細(xì)胞中的蛋白活性相比,原核蛋白的表達(dá)增加約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、 約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%,約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、 約50倍或更多。原核細(xì)胞中的蛋白活性作為多個(gè)參數(shù)的函數(shù)而增加或降低,所述參數(shù)包括但不限于連接到納米顆粒的寡核苷酸的序列,目標(biāo)原核基因(因此,和由該基因編碼的蛋白)和納米顆粒的大小。在多個(gè)實(shí)施方式中,預(yù)期本發(fā)明的抗生素組合物抑制原核基因的轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)施方式中,預(yù)期本發(fā)明的抗生素組合物抑制原核基因的翻譯。在一些實(shí)施方式中,抗生素組合物與賦予抗生素抗性的原核基因的目標(biāo)非編碼序列雜交。這些基因是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并且在例如Liu et al. , Nucleic Acids Research 37 :D443_D447,2009 (全文通過引用并入本文)中討論。在一些實(shí)施方式中,抗生素組合物與賦予抗生素抗性的原核基因的目標(biāo)非編碼序列的雜交導(dǎo)致原核生物對(duì)抗生素的敏感性提高。一方面,與沒有接觸抗生素組合物的原核生物的敏感性相比,原核生物對(duì)抗生素的敏感性提高約5%。在多個(gè)方面,與沒有接觸抗生素組合物的原核生物的敏感性相比,原核生物對(duì)抗生素的敏感性提高約10 %、約15 %、約20 %、約25 %、約30 %、約35 %、 約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90 %、約95 %,約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、 約20倍、約50倍或更多。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用本文所述的常規(guī)技術(shù)測(cè)定對(duì)抗生素的相對(duì)敏感性。與抗生素的組合療法在一些實(shí)施方式中,配制包含寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物的抗生素組合物, 以各自的治療有效量與抗生素試劑組合施用。本文使用的術(shù)語“抗生素試劑”是指具有抑制細(xì)菌和其它微生物的生長(zhǎng)或?qū)⑵錃?,主要用于感染疾病的治療的任意化學(xué)物質(zhì)組。參見,例如美國專利No. 7,638,557(通過引用全文并入本文)??股氐膶?shí)例包括,但不限于青霉素G、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氨芐青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐青霉素、美洛西林、阿洛西林、哌拉西林、亞胺培南、氨曲南、頭孢噻吩、頭孢克洛、頭孢西丁、頭孢呋辛、頭孢尼西、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢丙烯、氯碳頭孢、頭孢他美、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、 頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢泊肟、頭孢磺啶、氟羅沙星、萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、西諾沙星、強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、丁胺卡那霉素、 慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、鏈霉素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、依托紅霉素、紅霉素琥珀酸乙酯、葡庚糖酸紅霉素、乳糖酸紅霉素、硬脂酸紅霉素、萬古霉素、替考拉寧、氯霉素、克林霉素、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、利福平、莫匹羅星、甲硝唑、頭孢氨芐、羅紅霉素、阿莫西林-克拉維酸鹽組合、哌拉西林和他唑巴坦的組合,及其各種鹽、酸、 堿和其它衍生物。抗細(xì)菌的抗生素包括,但不限于青霉菌、頭孢菌素、碳頭孢烯、頭霉素、碳青霉烯、單酰胺菌素、胺基糖甙、糖肽、喹諾酮、四環(huán)素和氟喹啉酮。給藥和藥物組合物本文使用的術(shù)語“治療有效量”是指足以治療、緩解或預(yù)防確定的疾病或癥狀,或顯示出可測(cè)量的治療、預(yù)防或抑制效果的組合物的量??赏ㄟ^,例如臨床癥狀的改進(jìn)、癥狀的減少或通過本文描述的測(cè)試檢測(cè)所述效果。對(duì)于受試者的精確有效量將取決于受試者的體重、大小和健康狀況,疾病的性質(zhì)和成都以及選擇施用的抗生素組合物或組合物的組合。 可通過臨床醫(yī)生技術(shù)和判斷能力之內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定給定情形的治療有效量??蓪⒈疚拿枋龅目股亟M合物與藥物可接受的賦形劑、載體或稀釋劑一起配制成藥物組合物??赏ㄟ^允許治療原核感染或癥狀的任何途徑施用化合物或包含抗生素組合物的組合物。優(yōu)選的施用途徑是口服施用。此外,可使用任何標(biāo)準(zhǔn)施用途徑向患者遞送化合物或包含抗生素組合物的組合物,包括胃腸外途徑,例如心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)、胸內(nèi)、透皮、經(jīng)直腸、口服、經(jīng)鼻或通過吸入施用。也可從本文所述的試劑制備慢釋制劑, 從而實(shí)現(xiàn)在與胃腸道中的體液接觸后,活性劑的受控釋放,并在血漿中提供基本恒定且有效水平的活性劑。出于此目的,可將結(jié)晶形式嵌入可生物降解的聚合物、水溶性聚合物或二者混合物和任選適合的表面活性劑的聚合物基質(zhì)中。在本文中,嵌入是指將微粒并入聚合物基質(zhì)中。還可以利用已知的分散或乳化包衣技術(shù),通過分散微粒或乳化微粒的包封化獲得控釋制劑。可采用單劑量施用的形式進(jìn)行使用,或者可在一段時(shí)間內(nèi),以分開的劑量或連續(xù)釋放制劑或施用方法(例如,泵)使用此實(shí)施方式的化合物。然而,將此實(shí)施方式的化合物施用給受試者,施用化合物的量或所選擇的施用途徑應(yīng)經(jīng)過選擇以允許有效地治療疾病癥狀。在一個(gè)實(shí)施方式中,可使用藥物可接受的賦形劑,例如載體、溶劑、穩(wěn)定劑、助劑、 稀釋劑等配制藥物組合物,其取決于施用的具體模式和劑型。通常,藥物組合物應(yīng)經(jīng)配制以達(dá)到生理相容的pH,并可在約pH 3至約pH 11的范圍,優(yōu)選約pH 3至約pH 7的范圍,這取決于施用的制劑和途徑。在可選的實(shí)施方式中,優(yōu)選將PH調(diào)整至約pH 5.0至約pH 8的范圍。更特別地,在多個(gè)方面,藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的至少一種本文所述的組合物和一種或多種藥物可接受的賦形劑。如本文所述,藥物組合物可任選地包含本文所述化合物的組合。術(shù)語“藥物可接受的賦形劑”是指用于施用藥物試劑,例如本文所述化合物的賦形劑。此術(shù)語是指可施用而沒有不適當(dāng)毒性的任何藥物賦形劑。藥物可接受的賦形劑由所施用的特定組合物并通過用于施用所述組合物的具體方法決定。因此,存在多種適合的藥物組合物的制劑(參見,例如Remington' s Pharmaceutical Sciences)0適合的賦形劑可以是載體分子,其包括大的代謝緩慢的大分子,例如蛋白、多糖、 聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和失活的蛋白顆粒。其它示例性的賦形劑包括抗氧化劑(例如抗壞血酸)、螯合劑(例如EDTA)、碳水化合物(例如糊精、羥烷基纖維素和/或羥烷基甲基纖維素)、硬脂酸、液體(例如,油、水、鹽水、甘油和/或乙醇)、潤濕或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。脂質(zhì)體也包含在藥物可接受的賦形劑的定義內(nèi)。此外,藥物組合物可以是無菌注射制劑的形式,例如無菌的含水注射乳劑或油質(zhì)懸液。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用適合的分散或潤濕劑和懸浮劑配制此乳劑或懸液。無菌注射制劑可以是無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑,例如1,2_丙二醇溶液中的無菌注射溶液或懸液。也可將無菌注射制劑配制成凍干粉。在可接受的載體和溶劑中,可使用水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外,也可以使用無菌不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。出于此目的,可采用任何無刺激的不揮發(fā)油,包括合成的單-或二甘油酯。此外,在注射制劑中同樣可以使用脂肪酸(例如油酸)。寡核苷酸序列和原核蛋白的抑制在一些方面,本發(fā)明提供了靶向特異核酸的方法??砂邢蛉魏晤愋偷脑撕怂?,并且可以使用,例如用于抑制功能性原核基因產(chǎn)物生產(chǎn)的方法??赏ㄟ^本發(fā)明方法靶向的核酸的實(shí)例包括,但不限于基因和原核RNA或DNA。在多個(gè)方面,對(duì)于原核靶核酸,核酸是由基因組DNA轉(zhuǎn)錄的RNA。用于抑制所提供的細(xì)胞中靶原核蛋白生產(chǎn)的方法包括,與沒有寡核苷酸官能化的納米顆粒時(shí)基因產(chǎn)物表達(dá)相比,靶基因產(chǎn)物的表達(dá)被抑制至少約1%、至少約5%、至少約 10%,至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、 至少約99%或至少約100%的那些方法。也就是說,所提供的方法包括導(dǎo)致對(duì)靶基因產(chǎn)物的表達(dá)產(chǎn)生任何程度的抑制的那些方法。在體內(nèi)測(cè)定抑制程度,例如由來自個(gè)體的體液樣品,其中在所述個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)靶原核生物或所述個(gè)體需要抑制原核蛋白,或在個(gè)體內(nèi)通過本領(lǐng)域已知的成像技術(shù)測(cè)定,,其中在所述個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)靶原核生物或所述個(gè)體需要抑制原核蛋白?;蛘?,在體外測(cè)定抑制程度, 通過量化細(xì)胞培養(yǎng)物或生物中剩余的原核生物的量,并與細(xì)胞培養(yǎng)物或生物內(nèi)在早先時(shí)間點(diǎn)的原核生物的量比較。在形成三元復(fù)合物的實(shí)施方式中,預(yù)期在原核基因組中引入突變。在這些實(shí)施方式中,寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物包含突變,并且三元復(fù)合物的形成引發(fā)了與納米顆粒相連的寡核苷酸與原核基因組鏈之間的重組事件。抗原核生物的寡核苷酸在與靶多核苷酸序列雜交時(shí),本發(fā)明的寡核苷酸具有至少約45°C的Tm,通常在約 50°C至60°C之間,盡管^可以更高,例如65°C。下文考慮可原核靶多核苷酸序列和原核 mRNA靶多核苷酸序列的選擇。
在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的寡核苷酸經(jīng)設(shè)計(jì)與靶原核序列在生理?xiàng)l件下雜交, 其1基本高于37°C,例如至少45°C且優(yōu)選60°C -80°C。經(jīng)設(shè)計(jì),所述寡核苷酸具有與該核酸的高結(jié)合親和性,并且在一個(gè)方面,所述寡核苷酸與靶原核序列100%互補(bǔ),或可包含錯(cuò)配。在所提供的方法中,寡核苷酸與靶原核序列的互補(bǔ)大于95%,與靶原核序列的互補(bǔ)大于90%,與靶原核序列的互補(bǔ)大于80%,與靶原核序列的互補(bǔ)大于75%,與靶原核序列的互補(bǔ)大于70%,與靶原核序列的互補(bǔ)大于65%,與靶原核序列的互補(bǔ)大于60%,與靶原核序列的互補(bǔ)55 %,與靶原核序列的互補(bǔ)大于50 %。應(yīng)理解,本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地測(cè)定寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物的適合的靶標(biāo),并且使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)設(shè)計(jì)并合成寡核苷酸。可通過獲取,例如目標(biāo)靶核酸的序列(例如,從GenBank)并使用,例如MacVector 6. 0程序、ClustalW算法、BLOSUM 30矩陣和默認(rèn)參數(shù)(其包括用于核酸比對(duì)的開口罰分10和開口延伸罰分5. 0),將其與其它核酸序列進(jìn)行比對(duì),而鑒定出靶標(biāo)。使用本發(fā)明的方法,預(yù)期任何必需原核基因均可作為靶基因。如上文所述,可使用多種方法,包括Gerdes描述的用于大腸桿菌(E.coli)的那些Rerdes et al., JBacteriol. 185(19) :5673_84,2003],來測(cè)定對(duì)于任何原核物種所必需的原核基因。很多必需基因在細(xì)菌界中是保守的,從而提供可靶選擇的額外引導(dǎo)。可使用易得的生物信息資源,例如通過生物技術(shù)信息國家中心(NCBI)維護(hù)的那些資源鑒定靶基因序列。可獲得用于大量微生物物種的完整參考基因組序列,并鑒定必需細(xì)菌基因的序列。一方面,細(xì)菌菌株得自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。可建立使用對(duì)于任何給定物種的適合培養(yǎng)基和條件的簡(jiǎn)單細(xì)胞培養(yǎng)方法,以測(cè)定寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物的抗菌活性。隨后,在用于治療人感染之前,在動(dòng)物模型或獸醫(yī)學(xué)動(dòng)物中檢測(cè)顯示出最佳活性的寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物。細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期靶蛋白的靶序列本發(fā)明的寡核苷酸經(jīng)設(shè)計(jì)與編碼必需原核基因的原核核酸序列雜交。示例性基因包括,但不限于細(xì)胞分裂所需的那些、細(xì)胞周期蛋白或脂質(zhì)生物合成或核酸復(fù)制所需的基因。一旦確定基因的必要性,任何必需細(xì)菌基因都是靶標(biāo)。用于測(cè)定生物中的必需基因的一個(gè)方法是使用[Gerdes et al.,J Bacteriol. 185(19) :5673_84,2003,通過引用全文并入本文]中描述的基因組步移技術(shù)。在此報(bào)道中,620個(gè)大腸桿菌基因被鑒定為必需基因,而 3,1 個(gè)基因被鑒定為對(duì)強(qiáng)需氧生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)不是必要的。進(jìn)化背景分析證實(shí), 大量必需的大腸桿菌基因在整個(gè)細(xì)菌界保守,特別是用于關(guān)鍵細(xì)胞過程,例如DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂和蛋白合成的基因亞類。在多個(gè)方面,本發(fā)明提供了寡核苷酸,其是有效地與編碼必需細(xì)菌蛋白的靶序列穩(wěn)定且特異結(jié)合的核酸序列,所述靶序列包括以下(1)特異于給定細(xì)菌物種的具體菌株的序列,例如與食品中毒相關(guān)的大腸桿菌菌株,如0157:H7(參見美國專利申請(qǐng) No. 20080194463的表1,全文通過引用并入本文);( 兩個(gè)或更多細(xì)菌物種的共有序列; (3)兩個(gè)相關(guān)細(xì)菌屬(即類似系統(tǒng)發(fā)生源的細(xì)菌屬)的共有序列;(4)通常在革蘭氏陰性細(xì)菌中保守的序列;(5)通常在革蘭氏陽性細(xì)菌中保守的序列;或(6)通常編碼必需細(xì)菌蛋白的核酸序列的共有序列。通常,使用本發(fā)明的方法調(diào)控基因表達(dá)的目標(biāo)包括在活性原核生長(zhǎng)或復(fù)制期間表達(dá)的原核核酸,例如由細(xì)胞分離和細(xì)胞壁合成(分裂細(xì)胞壁或dew)基因簇的基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA 序列,包括但不限于 zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、ftsN、ftsK、 ftsL、ftsQ、ftsff>ftsZ、murC、murD、murE、murF、murg、minC、minD、minE、mraY、mraW、mraZ、 seqA和ddlB。有關(guān)大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期的大體綜述,參見[Bramhi 11,Armu Rev Cell Dev Biol. 13 :395-424,1997]和[Donachie,Annu Rev Microbiol. 47 :199-230, 1993],二者均清楚地通過引用并入本文。其他靶標(biāo)包括參與脂質(zhì)生物合成(例如acpP)和復(fù)制(例如gyrA)的基因。大腸桿菌中的細(xì)胞分裂涉及所有3層細(xì)胞被膜(胞質(zhì)膜、剛性肽聚糖膜和外膜) 的協(xié)同內(nèi)陷。隔膜的壓縮將細(xì)胞分成兩個(gè)室并隔離復(fù)制的DNA。至少9個(gè)必需基因產(chǎn)物參與此過程ftsZ、ftsA、ftsQ、ftsL、ftsl、ftsN、ftsK、ftsW 和 zipA[Hale et al.,J Bacteriol. 181(1) : 167-76,1999]。預(yù)期的蛋白靶標(biāo)是下文討論的3個(gè),特別是下文討論的 GyrA和AcpP靶標(biāo)。大腸桿菌中最早的必需細(xì)胞分裂基因之一 FtsZ是可溶性微管蛋白樣GTPase,其在細(xì)菌細(xì)胞的分裂位點(diǎn)形成與膜結(jié)合的環(huán)。認(rèn)為此環(huán)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞壓縮,并且似乎影響細(xì)胞壁的內(nèi)陷。FtsZ與大腸桿菌內(nèi)被稱作ZipA的新整合內(nèi)膜蛋白直接結(jié)合,ZipA是介導(dǎo)大腸桿菌內(nèi)細(xì)胞分裂的隔膜環(huán)結(jié)構(gòu)的必需組分[Lutkenhaus et al.,Annu Rev Biochem. 66 93-116,1997]。GyrA是指細(xì)菌促旋酶的亞基A及其基因。細(xì)菌促旋酶是細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶之一,其控制細(xì)胞中DNA超螺旋水平,并且是DNA復(fù)制所需的。AcpP編碼酰基載體蛋白,這是脂質(zhì)生物合成中的必需輔助因子。脂肪酸生物合成途徑需要熱穩(wěn)定輔助因子?;d體蛋白結(jié)合途徑中的中間產(chǎn)物。對(duì)于這三種蛋白中的每一個(gè),美國專利申請(qǐng)No. 20080194463的表1都提供了示例性細(xì)菌序列,其包含多個(gè)重要致病菌的每一個(gè)的靶序列?;蛐蛄惺窃醋詫?duì)每個(gè)細(xì)菌菌株的全長(zhǎng)基因組序列的GenBank參考。用于原核16S核糖體RNA的靶序列在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的寡核苷酸經(jīng)涉及與編碼細(xì)菌16S rRNA核酸序列的序列在生理?xiàng)l件下雜交,其Tm基本大于37°C,例如至少45°C,優(yōu)選60°C 80°C。更具體地,寡核苷酸具有有效地與靶16S rRNA基因序列穩(wěn)定且特異結(jié)合的序列, 所述靶16S rRNA基因序列具有一個(gè)或多個(gè)以下特征(1)見于16srRNA的雙鏈序列中的序列,例如肽基轉(zhuǎn)移酶中心、α -八疊球菌環(huán)和16s rRNA序列的mRNA結(jié)合序列;⑵見于細(xì)菌 16s rRNA的單鏈序列;(3)特異于給定細(xì)菌物種的具體菌株的序列,例如與食品中毒相關(guān)的大腸桿菌菌株;(4)特異于具體細(xì)菌物種的序列;( 兩個(gè)或更多細(xì)菌物種的共有序列; (6)兩個(gè)相關(guān)細(xì)菌屬(即類似系統(tǒng)發(fā)生源的細(xì)菌屬)的共有序列;(7)通常在革蘭氏陰性細(xì)菌的16S rRNA序列中保守的序列;(6)通常在革蘭氏陽性細(xì)菌的16SrRNA序列中保守的序列;或(7)細(xì)菌的16S rRNA序列的通常共有序列。美國專利No. 6,677,153的表1提供了示例性細(xì)菌和相關(guān)16S rRNA序列的 GenBank登錄號(hào)。大腸桿菌(E. coli)是作為胃腸道正常菌群一部分的革蘭氏陰性菌。存在成百上千的大腸桿菌,它們大多數(shù)是無害的且生活在健康人和動(dòng)物的胃腸道中。目前,引起人胃腸
13炎的腸道毒性大腸桿菌(“EEC類”)被公認(rèn)分為4類。在其中有腸致病的(EPEC)菌株和與毒力機(jī)制與典型大腸桿菌腸毒素分泌相關(guān)的菌株。這類大腸桿菌可引起包括與胃腸道和尿道感染相關(guān)的疾病、敗血病、肺炎和腦膜炎在內(nèi)的各種疾病??股貙?duì)一些菌株無效且未必能預(yù)防感染復(fù)發(fā)。例如,估計(jì)在美國每年大腸桿菌0157:H7引起10,000至20,000例感染(疾病控制和預(yù)防聯(lián)邦中心)。出血性大腸炎是大腸桿菌0157:H7引起的急性病的名稱。學(xué)齡前兒童和老年人患并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)最高。最近有報(bào)道稱大腸桿菌0157:H7是引起四名兒童死亡的原因,這些兒童食用了來自太平洋西北的快餐店的未烹飪熟的漢堡包。[參見,如Jackson et al. , Epidemiol. Infect. 120(1) 17-20,1998]。腸道毒性大腸桿菌菌株的示例性序列包括GenBank登錄號(hào)X97M2、AF074613、 Y11275和 AJ007716。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)是引起各種病癥的革蘭氏陰性菌,此病癥在臨床上的范圍從地方性胃腸道感染、胃腸炎(痢疾、腹痛和發(fā)燒)至作為嚴(yán)重身體疾病的傷寒(包括傷寒癥)。沙門氏菌屬(Salmonella)感染也引起牲畜的顯著減重。典型的革蘭氏陰性菌(沙門氏菌屬的細(xì)胞壁)包含復(fù)雜的脂多糖(LPS)結(jié)構(gòu),其通過細(xì)胞溶解釋放,并可起到導(dǎo)致生物體毒力的內(nèi)毒素的作用。由于沙門氏菌存活在未完全熟制的肉和動(dòng)物制品中的事實(shí),所以受污染食物是非傷寒沙門氏菌感染傳播的主要方式。除了大量其它的家養(yǎng)和野生動(dòng)物外,最普通的動(dòng)物源是雞、火雞、豬和母豬。由沙門氏菌屬引起的傷寒癥和其它傷寒的流行病學(xué)與被人糞便污染的水有關(guān)。疫苗可用于傷寒癥且部分有效;然而,沒有疫苗可用于非傷寒沙門氏菌感染。非傷寒沙門氏菌病由衛(wèi)生屠宰操作和徹底熟制以及食物的冷藏來控制。身體疾病表明需要抗生素,且氨芐青霉素已有一些成功的用例。然而,在使用過量抗生素治療的患者、使用免疫抑制藥物治療并隨后進(jìn)行胃手術(shù)的患者和患有溶血性貧血、白血病、淋巴瘤或AIDS的患者中,沙門氏菌感染仍是醫(yī)學(xué)問題。假單胞菌屬(I^eudomonas spp.)是臨床上重要的運(yùn)動(dòng)型革蘭氏陰性棒菌,因?yàn)樗鼈兡芸勾蠖鄶?shù)抗生素,且是醫(yī)院獲得的(醫(yī)院內(nèi))感染的主要原因。感染最常見于免疫受損的個(gè)體、燒傷者、帶呼吸器的個(gè)體、插導(dǎo)管的個(gè)體、IV級(jí)麻醉品使用者和患有慢性肺病的個(gè)體(如囊腫性纖維化)。雖然感染很少出現(xiàn)在健康個(gè)體中,但其可出現(xiàn)在許多地方,并導(dǎo)致尿道感染、敗血癥、肺炎、咽炎和許多其它問題,且治療通常失敗且具有較顯著的死亡率。綠膿桿菌(I^eudomonas aeruginosa)是具有單級(jí)運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陰性、需氧型、 棒狀菌。人體條件致病病原菌(綠膿桿菌)也是植物的條件致病病原菌。與其它假單胞菌相同,綠膿桿菌分泌各種色素。綠膿桿菌的明確的臨床鑒定可包括鑒定綠膿菌素和熒光素的產(chǎn)生以及生物體在42°C的生長(zhǎng)能力。綠膿桿菌也能夠在柴油和航空燃油中生長(zhǎng),其被稱為利用烴的微生物(或“HUM蟲”),引起微生物腐蝕?;魜y弧菌(Vibrio cholera)為感染人并引起霍亂(由于衛(wèi)生差而傳播的疾病)的革蘭氏陰性棒狀菌,導(dǎo)致水供應(yīng)污染?;魜y弧菌可在人小腸內(nèi)繁殖,在小腸中其產(chǎn)生中斷離子通過粘膜傳遞的毒素,引起痢疾和脫水。感染霍亂弧菌的個(gè)體需要通過靜脈或口服含電解質(zhì)的溶液來補(bǔ)水。疾病通常為自限性的;然而,死亡可因脫水和大量電解質(zhì)損失而發(fā)生。已表明抗生素如四環(huán)素可縮短疾病的周期,且口服疫苗正處在開發(fā)中。淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoea)是革蘭氏陰性球菌,其是普通性傳播疾病淋病的病因。淋病奈瑟氏菌可改變其表面抗原,防止發(fā)展出對(duì)再感染的免疫性。據(jù)報(bào)道美國每年有將近750,000例淋病,以及每年未報(bào)道的估計(jì)750,000例其它病例,大多數(shù)發(fā)生在青少年和青年中。推薦使用氨芐青霉素、阿莫西林或一些青霉素類來治療淋病。然而,青霉素抗性的淋病的發(fā)生率正在增加,且通過注射如頭孢曲松或壯觀霉素給藥的新型抗生素現(xiàn)在被用于治療大多數(shù)淋病感染。金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是通常在人鼻子中繁殖且有時(shí)出現(xiàn)在皮膚上的革蘭氏陽性球菌。葡萄球菌屬Staphylococcus)可引起血流感染、肺炎和醫(yī)院內(nèi)感染。金黃色葡萄球菌可引起嚴(yán)重的食物中毒,且許多菌株在食物中生長(zhǎng)并產(chǎn)生外毒素。葡萄球菌屬對(duì)常規(guī)抗生素如萬古霉素的抗性已作為社區(qū)和醫(yī)院的主要公共健康挑戰(zhàn)出現(xiàn)在美國和國外。最近,萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌分離株已在日本被鑒定。結(jié)核絲桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是革蘭氏陽性菌,其是肺結(jié)核、有時(shí)是致殘和死亡疾病的病因。肺結(jié)核在全球范圍內(nèi)正在增加,且是由單一傳染病引起的死亡的主因(每年有三百萬人的死亡率)。其可影響包括腦、腎和骨的人體的許多器官,然而,肺結(jié)核目前最主要影響肺。如陽性皮膚測(cè)試所指出的,在美國,約一千萬個(gè)體被結(jié)核絲桿菌感染,每年約沈,000個(gè)新病例。肺結(jié)核(TB)病例的增加與HIV/AIDS、無家可歸、藥物濫用和具有主動(dòng)感染的患者的遷移有關(guān)。藥物敏感的TB的目前治療方案包括在6至9個(gè)月時(shí)間段內(nèi)服用兩種至四種藥物(如異煙胼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或鏈霉素),因?yàn)閱我凰幬餆o法消滅全部TB菌。此外,對(duì)結(jié)核絲桿菌的藥物抗性和多重藥物抗性菌株的觀察正在增加幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是微氣生的、革蘭氏陰性的、生長(zhǎng)緩慢的、有鞭毛的、具有螺旋或S形形態(tài)學(xué)的生物體,此生物體可感染胃壁。幽門螺桿菌是與導(dǎo)致胃癌的淺表性胃炎、胃潰瘍疾病和萎縮性胃炎相關(guān)的人胃病原菌。幽門螺桿菌是人中最常見慢性細(xì)菌感染中的一種,且已在超過90%的患有活動(dòng)性胃炎的患者中發(fā)現(xiàn)。目前的治療包括使用鉍、滅滴靈、和在大多數(shù)病例中消滅幽門螺桿菌的四環(huán)素或阿莫西林的三種藥物治療。 使用三重治療的問題包括患者依從性、副作用和滅滴靈抗性。具有前景的雙重治療的備選方案是阿莫西林+滅滴靈,或奧美拉唑+阿莫西林。肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)是革蘭氏陽性球菌,其是細(xì)菌性肺炎以及中耳感染(中耳炎)和腦膜炎的最常見原因之一。在美國每年肺炎球菌疾病占約50,000 例的菌血癥;3,000例的腦膜炎;100,000-135, 000的住院治療;和7,000, 000例的中耳炎。 肺炎球菌感染在美國每年引起約40,000例死亡。小于2歲的兒童、大于65歲的成年和患有包括如充血性心臟病、糖尿病、肺氣腫、肝病、鐮狀細(xì)胞、HIV等潛在醫(yī)療病癥的任何年齡的人,以及處于特殊環(huán)境如療養(yǎng)院和長(zhǎng)期護(hù)理機(jī)構(gòu)的那些人被感染的風(fēng)險(xiǎn)最高。藥物抗性肺炎鏈球菌已在美國變得普通,許多青霉素抗性肺炎雙球菌也對(duì)其它抗微生物藥如紅霉素或三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲噁唑有抗性。蒼白螺旋體(Tr印onema pallidum)是引起梅毒的螺旋菌。蒼白螺旋體是唯一地引起梅毒、雅司病和非性交的地方性梅毒或品他病的病原菌。蒼白螺旋體不能在體外生長(zhǎng), 且在缺少哺乳動(dòng)物細(xì)胞下無法復(fù)制。初始的感染在感染位點(diǎn)處引起潰瘍;然而,細(xì)菌在體內(nèi)移動(dòng),在一段時(shí)間內(nèi)破壞許多器官。在其最后的階段,雖然不會(huì)傳染,但未治療的梅毒可引起嚴(yán)重的心臟異常、精神障礙、失明、其它神經(jīng)問題和死亡。梅毒通常通過注射給藥青霉素治療。其它抗生素可用于對(duì)青霉素過敏的患者,或?qū)φ┝壳嗝顾責(zé)o反應(yīng)的患者。在梅毒的所有階段,正常治療將治愈疾病,但在晚期梅毒中,對(duì)器官已造成的損傷無法被逆轉(zhuǎn)。沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)是美國最常見的細(xì)菌型性傳播疾病,且估計(jì)每年有四百萬新病例。最高的感染比率出現(xiàn)在15至19歲。衣原體是非淋球菌的尿道炎 (NGU)、子宮頸炎、細(xì)菌性陰道炎和盆腔炎疾病(PID)的主因。衣原體感染可具有很溫和的癥狀或完全無癥狀;然而,如果不治療,衣原體感染可對(duì)特別是婦女的生殖器官造成嚴(yán)重傷害。通常處方抗生素如阿奇霉素、紅霉素、氧氟沙星(oflloxacin)、阿莫西林或強(qiáng)力霉素來治療衣原體感染。漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)貓抓發(fā)燒(CSF)或貓抓病(CSD)是通過接觸貓獲得的人的疾病,由被稱為henselae羅克利巴體菌(Rochalimaea henselae)的革蘭氏陰性棒菌引起,通常被稱為漢賽巴爾通體。癥狀包括發(fā)熱和淋巴結(jié)腫脹,且CSF通常是人中相對(duì)良性、限制自己的疾病,然而,漢賽巴爾通體的感染可在免疫受損人中產(chǎn)生不同的臨床癥狀,包括伴有菌血癥的急性發(fā)熱病、桿菌的血管瘤病、紫癜、桿菌的脾臟炎、和其它慢性疾病表現(xiàn)如AIDS腦病。此疾病用抗生素如強(qiáng)力霉素、紅霉素、利福平、青霉素、慶大霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星和阿奇霉素治療。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)是革蘭氏陰性菌家族;已知有六種類型,最大多數(shù)流感嗜血桿菌相關(guān)疾病由B型或“HIB”引起。直到開發(fā)出用于HIB的疫苗, HIB是中耳炎、竇感染、支氣管炎的常見原因,腦膜炎的最常見原因,且在肺炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié)感染)、蜂窩織炎(軟組織感染)和心包炎(心臟周圍的膜感染)的情況中是高頻病因。B型流感嗜血桿菌在人中分布廣泛,且通常位于喉嚨和鼻中且不引起疾病。5歲以下的未免疫的兒童有HIB疾病的風(fēng)險(xiǎn)。腦膜炎和由流感嗜血桿菌感染引起的其它嚴(yán)重感染可導(dǎo)致腦損傷或死亡。痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)是引起痢疾的革蘭氏陰性棒菌。在結(jié)腸中, 細(xì)菌進(jìn)入粘膜細(xì)胞并在粘膜細(xì)胞內(nèi)分裂,導(dǎo)致廣泛的炎性反應(yīng)。志賀菌感染可引起嚴(yán)重的痢疾,其可導(dǎo)致脫水且對(duì)很年輕的人、很老的人或慢性病很危險(xiǎn)。痢疾志賀菌形成強(qiáng)力毒素 (志賀毒素),其有細(xì)胞毒性、腸毒性、神經(jīng)毒性,且可作用蛋白質(zhì)合成抑制劑。已經(jīng)發(fā)展出對(duì)抗生素如氨芐青霉素和TMP-SMX的抗性,然而,使用更新,更昂貴的抗生素如環(huán)丙沙星、 諾氟沙星和依諾沙星的治療保持有效。李斯特菌屬(Listeria)是發(fā)現(xiàn)在人和動(dòng)物糞便中的革蘭氏陽性、運(yùn)動(dòng)型菌的屬。 核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)引起此類疾病如李斯特氏菌病、腦膜腦炎和腦膜炎。特別是在孕婦、新生兒、老年人和免疫損害個(gè)體中,此生物體是死于食物載病原體的主因之一。其發(fā)現(xiàn)在如腐爛植物質(zhì)、污水、水和土壤的環(huán)境中,且其可在極端溫度和鹽濃度并存下存活,使得其成為極危險(xiǎn)的食物載病原體,特別是對(duì)未再加熱的食物。細(xì)菌可從腸道內(nèi)的感染位點(diǎn)擴(kuò)展至中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎兒-胎盤單元。腦膜炎、腸胃炎和敗血病可由感染引起。在牛和羊中,李斯特屬感染引起腦炎和自然流產(chǎn)。奇異變形桿菌是腸的、革蘭氏陰性共棲生物體,與大腸桿菌不相關(guān)。奇異變形桿菌通常在人尿道中繁殖,但其是引起插導(dǎo)管個(gè)體中尿道感染主因的機(jī)會(huì)致病菌。奇異變形桿菌具有兩個(gè)特殊特征1)其具有極快速的運(yùn)動(dòng)性,自身表現(xiàn)為在培養(yǎng)平板上群游現(xiàn)象;且 2)其產(chǎn)生脲酶,此脲酶賦予奇異變形桿菌降解尿素的能力并在泌尿生殖道中存活。鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)是瘟疫(腹股溝腺炎的和肺部)的病因(瘟疫是一種在世界范圍內(nèi)已殺死百萬人的破壞性疾病)。生物體可通過被感染跳蚤的叮咬從大鼠轉(zhuǎn)移至人,或在廣泛感染期間通過空氣從人轉(zhuǎn)移至人。鼠疫耶爾森氏菌是需要極少數(shù)量來引起疾病的極度致病生物體,且如果不治療通常致死。生物體是腸侵入性的,且在通過宿主在全身蔓延前可在巨噬細(xì)胞中存活和增殖。炭疽桿菌(Bacillus anthracis)也稱為炭疽。人在接觸受污染的動(dòng)物時(shí)被感染。 炭疽不因人與人的接觸而傳播。疾病的三種形式反映出包括皮膚的(皮膚)、肺的(肺)和腸的感染位點(diǎn)。如果不治療,肺的和腸的感染通常是致命的。孢子被巨噬細(xì)胞吸收并內(nèi)變?yōu)橥淌扇苊阁w(膜艙室),在此處開始萌發(fā)。一旦它們快速增殖的被感染的巨噬細(xì)胞溶解, 細(xì)菌被釋放進(jìn)入血流,通過循環(huán)和淋巴系統(tǒng)散布,這是一種導(dǎo)致敗血性休克、呼吸窘迫和器官衰竭的過程。此病原菌的孢子已被用作恐怖武器。鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burldiolderia mallei)是引起鼻疽病(主要發(fā)生在馬、騾和驢中的傳染病)的革蘭氏陽性好氧菌。其很少與人感染相關(guān),且最常見于飼養(yǎng)的動(dòng)物。此生物體類似于類鼻疽伯克霍爾德氏菌(B.pseudomallei),且通過是不動(dòng)的而被區(qū)分。此病原菌是宿主適應(yīng)型,且在其宿主外的環(huán)境中未有發(fā)現(xiàn)。如果不用抗生素治療,鼻疽病通常是致命的,且傳播可通過空氣發(fā)生,或更常見是當(dāng)接觸感染動(dòng)物時(shí)發(fā)生。感染期間快速發(fā)作的肺炎、菌血癥(生物體通過血液傳播)、膿皰和死亡是常見結(jié)果。雖然類似于鼠傷寒沙門氏菌的分泌系統(tǒng)的III型分泌系統(tǒng)是必需的,但對(duì)毒力機(jī)制仍沒有充分了解。沒有疫苗可用于這種有潛在危險(xiǎn)的生物體,此生物體被認(rèn)為具有作為生物恐怖試劑可能性。與相關(guān)的類鼻疽伯克霍爾德氏菌相比(以下),此生物體的基因組攜帶大量插入序列,以及可在細(xì)胞表面蛋白的抗原變異中起作用的大量的簡(jiǎn)單序列重復(fù)。類鼻疽伯克霍爾德氏菌是在人和動(dòng)物中引起類鼻疽的革蘭氏陰性菌。類鼻疽是發(fā)現(xiàn)于亞洲某些地區(qū)、泰國和澳大利亞的疾病。類鼻疽伯克霍爾德氏菌是典型的土壤生物體, 且已經(jīng)從稻田和潮濕的熱帶土壤中分離,但其作為機(jī)會(huì)致病菌可引起如糖尿病患者等易感人群患病。此生物體可存在于細(xì)胞內(nèi),并引起肺炎和菌血癥(細(xì)菌通過血流傳播)。潛伏期可很長(zhǎng),感染前述疾病數(shù)十年,且其治療能服用數(shù)月抗生素,仍然普遍觀察到復(fù)發(fā)現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)傳播可經(jīng)由誘導(dǎo)位于細(xì)胞一級(jí)的肌動(dòng)蛋白聚合來發(fā)生,以允許通過胞漿移動(dòng)且從細(xì)胞至細(xì)胞。此生物體攜帶可促進(jìn)抗原變異的大量小序列重復(fù)(與在鼻疽伯克霍爾德氏菌基因組中發(fā)現(xiàn)的那些類似)。洋蔥伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia c印acia)是由至少7種不同亞種組成的革蘭氏陰性菌,包括多噬伯克霍爾德菌(BurWiolderia multivorans)、越南伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia vietnamiensis)、禾急定白克霍爾德菌(Burkholderia stabilis)、新^羊蔥白 3 ^/^^! (Burkholderia cenocepacia)禾口 Burkholderia ambifaria0 ^Μ- β^β/Κ 德氏菌是重要的人病原菌,其通常在患有潛在肺病(如囊腫性纖維化或)免疫問題(如慢性肉芽腫病)的人中引起肺炎。洋蔥伯克霍爾德氏菌通常發(fā)現(xiàn)于水和土壤中,且可在潮濕環(huán)境中存活很長(zhǎng)時(shí)間。人對(duì)人的傳播已有記載;因此,許多囊腫性纖維化患者的醫(yī)院、診所和營地對(duì)洋蔥伯克霍爾德氏菌已經(jīng)制定了嚴(yán)格的分離防范。相比于具有無需限制傳播的菌的那些個(gè)體,具有此菌的個(gè)體通常在單獨(dú)的區(qū)域治療。這是因?yàn)檠笫[伯克霍爾德氏菌的感染可導(dǎo)致肺功能快速降低,導(dǎo)致死亡。洋蔥伯克霍爾德氏菌的診斷包括從痰培養(yǎng)物中分離細(xì)菌。治療很困難,因?yàn)檠笫[伯克霍爾德氏菌自身抵抗許多常見抗生素,包括氨基糖苷(如托普霉素)和多粘菌素B。治療通常包括多重抗生素且可包括頭孢噻甲羧肟、強(qiáng)力霉素、哌拉西林、氯霉素和復(fù)方磺胺甲噁唑。土拉熱弗郎西絲菌(Francisella tularensi)作為在20世紀(jì)早期影響加利福尼亞圖革爾城中松鼠的似瘟疫疾病的病因被Edward Francis首先關(guān)注。此生物體現(xiàn)在使用他的名字。此疾病被稱為土拉菌病,且已在記錄的歷史中被提及。此生物體可通過被感染肉或經(jīng)由浮質(zhì)從被感染扁虱或鹿虻傳播至人,因此是潛在的生物恐怖試劑。與在軍團(tuán)菌屬 (Legionella)中觀察到的類似,其是水生生物,且被發(fā)現(xiàn)生活在原生動(dòng)物內(nèi)。其具有高感染率,其可侵入吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞,快速增殖。一旦在巨噬細(xì)胞內(nèi),此生物體可逃離吞噬體并在細(xì)胞溶質(zhì)中生活。獸醫(yī)應(yīng)用牲畜胃腸道中的健康微生物群落對(duì)健康和相關(guān)食品產(chǎn)物的相應(yīng)生產(chǎn)具有重要意義。與人類似,健康動(dòng)物的胃腸道包含多種細(xì)菌(即大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌), 其彼此之間以生態(tài)平衡存活。此平衡可能被飲食變化、脅迫或?qū)股鼗蚱渌委熜蕴幚淼姆磻?yīng)破壞,從而產(chǎn)生通常由例如沙門氏菌、彎曲菌、腸球菌、土拉菌和大腸桿菌的細(xì)菌導(dǎo)致的動(dòng)物細(xì)菌疾病。這些動(dòng)物中的細(xì)菌感染常要求治療性干預(yù),其具有處理成本并且常常與生產(chǎn)力下降相關(guān)。結(jié)果,定期使用抗生素處理牲畜以維持胃腸道中的菌落平衡。這種方法的缺點(diǎn)在于出現(xiàn)抗生素抗性細(xì)菌,并將此抗生素和抗性細(xì)菌轉(zhuǎn)移到用于人消費(fèi)的所得食品產(chǎn)物中。納米顆粒因此提供了被官能化為具有與其連接的多核苷酸的納米顆粒。納米顆粒的大小、 形成和化學(xué)組成有助于所得的多核苷酸官能化的納米顆粒的特性。這些特性包括例如光學(xué)特性、光電特性、電化學(xué)特性、電子特性、在各種溶液中的穩(wěn)定性、磁特性以及孔和通道大小變化。考慮了具有不同大小、形狀和/或化學(xué)組成的納米顆粒的組合物,以及具有統(tǒng)一大小、形狀和化學(xué)組成的納米顆粒的用途,和因此特性的混合。合適的顆粒的實(shí)例包括但不限于聚集顆粒、同向性顆粒(如球狀顆粒)、各向異性顆粒(如非球狀桿、四面體和/或棱柱)以及美國專利7,238,472和國際公開WO 2003/08539所述的核-殼顆粒(core-shell particle),上述文獻(xiàn)的公開通過引用全文并入。在一實(shí)施方案中,納米顆粒是金屬的,并且在各種方面,納米顆粒是膠態(tài)金屬。因此,在各種實(shí)施方案中,本發(fā)明的納米顆粒包括金屬(包括例如但不限于銀、金、鉬、鋁、鈀、 銅、鈷、銦、鎳,或適用于納米顆粒形成的任何其他金屬)、半導(dǎo)體(包括例如但不限于Cdk、 CdS和CdS或用ZnS包被的CdSe)和磁性(例如磁鐵)膠質(zhì)材料。還如美國專利公開2003/0147966所述,本發(fā)明的納米顆粒包括商購可獲得的納米顆粒,以及合成的納米顆粒,如由在溶液中漸進(jìn)性成核(如通過膠體反應(yīng))或通過各種物理和化學(xué)蒸汽淀積過程產(chǎn)生,如濺射淀積。參閱例如HaVashi,Vac. Sci. Technol. A5 (4) 1375-84(1987) ;Hayashi, Physics Today,44-60 (1987) ;MRS Bulletin, January 1990,16-47。如美國專利公開2003/0147966進(jìn)一步所述,利用本領(lǐng)域已知的方法,使用Hau⑶ 和檸檬酸鹽還原劑,可選地產(chǎn)生所考慮的納米顆粒。參閱例如Marinakos et al. , Adv. Mater. 11 :34-37(1999) ;Marinakos et al.,Chem. Mater. 10 :1214-19(1998) ;Enustun & Turkevich, J. Am. Chem. Soc. 85 :3317(1963)。納米顆粒平均直徑的大小范圍為約Inm至約250nm、約Inm至約MOnm、約Inm至約 230nm、約 Inm 至約 220nm、約 Inm 至約 2IOnmJ^] Inm 至約 200nm、約 Inm 至約 190nm、約 Inm 至約180nm、約Inm至約170nm、約Inm至約160nm、約Inm至約150nm、約Inm至約140nm、約 Inm 至約 130nm、約 Inm 至約 120nm、約 Inm 至約 IlOnmJ^] Inm 至約 IOOnmJ^] Inm 至約 90nm、 約Inm至約80nm、約Inm至約70nm、約Inm至約60nm、約Inm至約50nm、約Inm至約40nm、 約Inm至約30nm或約Inm至約20nm、約Inm至約10nm。在其他方面,納米顆粒的大小為約 5nm至約150nm(平均直徑)、約5至約50nm、約10至約30nm、約10至150nm、約IOnm至約 IOOnm,或約IOnm至約50nm。納米顆粒的大小為約5nm至約150nm(平均直徑)、約30nm至約lOOnm、約40nm至約80nm。方法中所用的納米顆粒大小根據(jù)它們具體用途或應(yīng)用而變化。 大小的變化有利地用于優(yōu)化納米顆粒的某些物理特征,如可以按本文所述推理的光學(xué)特性或表面積的數(shù)量。寡核苷酸本文所用術(shù)語“核苷酸”和其復(fù)數(shù)可以與本文所討論的或者本領(lǐng)域中以其他方式所知的修飾形式互換。在某些情況下,本領(lǐng)域使用“核堿基”,其包括天然存在的核苷酸以及可以聚合的核苷酸的修飾物。因此核苷酸或核堿基表示天然存在的核堿基腺嘌呤(A)、 鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶(U),以及非天然存在的核堿基,如黃嘌呤、 二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮雜黃嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶、N' , N'-橋亞乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌試,以及Benner et al.,美國專利5,432,272和Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research, vol. 25 :pp 4429-4443所述的“非天然存在”的核堿基。術(shù)語“核堿基”不但包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán),而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其他天然和非天然存在的核堿基包括以下文獻(xiàn)所公開的核堿基美國專利 3,687,808 (Merigan, et al. ) ;Chapter 15 by Sanghvi, in Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993 ;Englisch et al. ,1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30 :613-722 (特別是參閱 622 和 623 頁,以及 the Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed. , John Wiley & Sons,1990,pages 858-859, Cook,Anti-Cancer Drug Design 1991,6, 585-607,上述每篇文獻(xiàn)在此通過引用全文并入)。在各種方面,多核苷酸也包括一個(gè)或多個(gè)“核苷堿基”或“堿基單元”,其包括諸如雜環(huán)化合物的化合物,所述化合物的作用如同包括某些“通用堿基”在內(nèi)的核堿基,所述通用堿基在最經(jīng)典的意義看來不是核苷堿基但是發(fā)揮核苷堿基的作用。通用堿基包括3-硝基吡咯、任選地取代的吲哚(如5-硝基吲哚)以及任選地取代的次黃嘌呤。其他期望的通用堿基包括吡咯、二唑或三唑衍生物,包括本領(lǐng)域已知的通用堿基。修飾的堿基描述于EP 1 072 679和WO 97/U896中,兩者的公開通過引用并入本文。修飾的堿基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶堿基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫代脲嘧啶,8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤,5-鹵代特別是5-溴代、5-三氟甲基和其他 5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤,2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、 8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤和7-去氮雜腺嘌呤和3-去氮雜鳥嘌呤和3-去氮雜腺嘌呤。其他修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶,如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l, 4]苯并噁嗪-2 (3H)_酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并噻嗪_2 (3H)-酮);G 形夾具(G-clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5,4_b][l,4]苯并噁唑-2 (3H)-酮)、咔唑胞苷QH-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶 [3' ,2' 4,5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修飾的堿基也可以包括這樣的堿基其中, 嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)取代,如7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、2-氨基嘧啶和 2-吡啶酮。其他核堿基包括美國專利3,687,808所公開的核堿基、公開于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858—859, Kroschwitz, J.L,ed. John Wiley & Sons,1990 的核堿基,公幵于 Englisch et al. ,1991, Angewandte Chemie,International Edition,30 :613 的核減基,以及 Sanghvi, Y. S.,Chapter 15, Antisense Research and Applications,pages 289—302,Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed. , CRC ft~eSS,1993公開的核堿基。這些堿基中有某些可用于增加結(jié)合親和性,并包括 5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)證明,5-甲基胞嘧啶取代使核酸雙鏈體的穩(wěn)定性增加0.6-1. 2°C,并且在某些方面,與2' -0-甲氧基乙基糖修飾物組合。參閱U. S. I^at. Nos. 3,687,808、U. S. Pat. Nos. 4,845,205 ;5,130,302 ;5,134,066 ;5,175,273 ;5,367,066 ; 5,432,272 ;5,457,187 ;5,459,255 ;5,484,908 ;5,502,177 ;5,525,711 ;5,552,540 ; 5,587,469 ;5,594,121,5,596,091 ;5,614,617 ;5,645,985 ;5,830,653 ;5,763,588 ; 6,005,096 ;5, 750,692和5,681,941,上述專利公開通過引用并入本文。制備預(yù)定序列的多核苷酸的方法,是眾所周知的。參閱例如Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual(2nd ed. 1989)and F. Eckstein(ed.) Oligonucleotides and Analogues,1st Ed. (Oxford University Press,New York,1991)。 對(duì)于多核糖核苷酸和多脫氧核糖核苷酸兩者而言,優(yōu)選固相合成方法(合成DNA的眾所周知的方法可用于合成RNA)。多核糖核苷酸也可以酶促制備。也可以將非天然存在的核堿基并入多核苷酸中。參閱例如美國專利7,223,833 ;Katz,J. Am. Chem. Soc,74 :2238 (1951); Yamane, et al. , J. Am. Chem. Soc, 83 :2599(1961) ;Kosturko, et al. , Biochemistry, 13 3949(1974) ;Thomas, J. Am. Chem. Soc, 76 :6032(1954) ;Zhang, et al.,J. Am. Chem. Soc, 127 :74-75(2005);禾口 Zimmermann, et al.,J. Am. Chem. Soc, 124 13684—13685(2002)。所提供的用多核苷酸或其修飾形式官能化的納米顆粒通常包含長(zhǎng)度為約5個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸的多核苷酸。更具體而言,納米顆粒用多核苷酸官能化,所述多核苷酸的長(zhǎng)度為約5至約90個(gè)核苷酸、約5至約80個(gè)核苷酸、約5至約70個(gè)核苷酸、約5至約60個(gè)核苷酸、約5至約50個(gè)核苷酸、約5至約45個(gè)核苷酸、約5至約40個(gè)核苷酸、約5至約35個(gè)核苷酸、約5至約30個(gè)核苷酸、約5至約25個(gè)核苷酸、約5至約20個(gè)核苷酸、約5 至約15個(gè)核苷酸、約5至約10個(gè)核苷酸,和長(zhǎng)度位于具體公開的大小至能使多核苷酸實(shí)現(xiàn)期望結(jié)果的長(zhǎng)度之間的全部多核苷酸。因此考慮了長(zhǎng)度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個(gè)核苷酸的多核苷酸。考慮用于連接于納米顆粒的多核苷酸包括調(diào)節(jié)靶多核苷酸所表達(dá)的具有產(chǎn)物表達(dá)的多核苷酸。因此,考慮了與靶多核苷酸雜交并啟動(dòng)RNase活性(例如RNase H)的RNA 多核苷酸、與雙鏈多核苷酸雜交并抑制轉(zhuǎn)錄的形成三螺旋的多核苷酸以及與靶多核苷酸雜交并抑制翻譯的核酶。在各種方面,如果靶向特定mRNA,則單個(gè)納米顆粒-結(jié)合劑組合物能與多個(gè)拷貝的相同轉(zhuǎn)錄物結(jié)合。在一方面,提供了用相同多核苷酸官能化的納米顆粒,即每個(gè)多核苷酸具有相同的長(zhǎng)度和相同的序列。在其他方面,用兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸使納米顆粒官能化,所述多核苷酸是不同的,即至少一個(gè)連接的多核苷酸與至少另一個(gè)連接的多核苷酸的不同在于,其具有不同的長(zhǎng)度和/或不同的序列。在使不同的多核苷酸連接于納米顆粒的方面,這些不同的多核苷酸與相同的單個(gè)靶多核苷酸結(jié)合,但是在不同的位置或不同的底物位點(diǎn)與編碼不同的基因產(chǎn)物的不同的靶多核苷酸結(jié)合。修飾的多核苷酸如上文所述,預(yù)期使用修飾的寡核苷酸將納米顆粒官能化。在多個(gè)方面,在納米顆粒上官能化的寡核苷酸是完全修飾或部分修飾的。因此,在多個(gè)方面,多核苷酸的核苷酸單元中一個(gè)或多個(gè)或所有糖和/或一個(gè)或多個(gè)或所有核苷酸間連接被“非天然存在”的基團(tuán)取代。在一方面,該實(shí)施方案考慮了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中,多核苷酸的糖-主鏈被含有酰胺的主鏈取代。參閱例如美國專利5,539,082 ;5, 714,331和5,719,262,以及 Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500,上述文獻(xiàn)的公開通過引用并入本文。針對(duì)公開的多核苷酸所考慮的核苷酸和非天然核苷間的其他連接包括下述文獻(xiàn)所述的連接美國專利 4,981,957 ;5, 118,800 ;5, 319,080 ;5, 359,044 ;5, 393,878 ; 5,446,137 ;5,466,786 ;5,514,785 ;5,519,134 ;5,567,811 ;5,576,427 ;5,591,722 ; 5,597,909 ;5,610,300 ;5,627,053 ;5,639,873 ;5,646,265 ;5,658,873 ;5,670,633 ; 5,792,747 ;和 5,700,920 ;美國專利公開 No. 20040219565 ;國際專利公開 Nos. WO 98/39352 禾口 WO 99/14226 ;Mesmaeker et. al. ,Current Opinion in Structural Biology 5 :343-355(1995) VX R Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25 :4429-4443 (1997),上述文獻(xiàn)的公開通過引用并入本文。寡核苷酸的具體實(shí)例包括含有修飾的主鏈或非天然核苷酸間連接的多核苷。具有修飾的主鏈的多核苷酸包括在主鏈上保留了磷原子的多核苷酸和在主鏈上不具有磷原子的多核苷酸。在核苷間主鏈上不具有磷原子的修飾的多核苷酸被認(rèn)為在“寡核苷酸”含義的范圍內(nèi)。
含有磷原子的修飾的寡核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯,甲基和其他烷基磷酸酯,包括3'-亞烴基磷酸酯、5'-亞烴基磷酸酯和手性亞烴基磷酸酯,亞膦酸酯,氨基磷酸酯,包括3 ‘-氨基氨基磷酸酯(3-amino phosphor ami date)和氨基烷基氨基磷酸酯 (aminoalkylphosphoramidate),硫代氨基磷酸酉旨(thionophosphoramidate),硫羰燒基磷酸酉旨(thionoalkylphosphonate),it 撰燒基憐酸三酉旨(thionoalkylphosphotriester), 具有正常的3 ‘ -5 ‘連接的硒基磷酸酯(selenophosphate)和硼烷基磷酸酯 (boranophosphate),這些的2' -5'連接的類似物,具有反極性的那些,其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間連接是3'到3'、5'到5'或2'到2'連接。還考慮了具有反極性的多核苷酸, 其在最遠(yuǎn)的3’核苷酸間連接處包含單個(gè)3'到3'連接,即脫堿基(abasic)的單個(gè)反核苷殘基(核苷酸遺失具有取代其的羥基)。還考慮了鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)了上述含磷連接的代表性美國專利包括U. S. Pat. Nos. 3,687,808、
4,469,863,4,476,,301、5,023,243、5,177,196,5,188,897,5,,264,423,5,276,019、5,278:,302,5,286,,717、5,321,131、5,399,676,5,405,939,5,453,496,5,455,233、5,466;,677,5,476,925、5,519,126、5,536,821,5,541,306,5,550,111,5,563, 253、5,571,799,5,587,361,5,194,599,5,565, 555,5, 527:’ 899,5, 721,218,5, 672,I397以及
5,625,050,上述的公開通過引用并入本文。不包括磷原子的修飾的多核苷酸主鏈具有由以下形成的主鏈短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接,混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接,或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接。這些主鏈包括具有嗎啉代連接的主鏈;硅氧烷主鏈;硫化物、亞砜和砜主鏈; 甲酰基(formacetyl)和硫代甲?;?thioformacetyl)主鏈;亞甲基甲?;土虼柞;麈?;核糖乙?;?riboacetyl)主鏈;含有烯烴的主鏈;氨基磺酸酯主鏈;亞甲基亞氨基和亞甲基聯(lián)氨基主鏈;磺酸酯和磺酰胺主鏈;酰胺主鏈;和其他具有混合的N、0、S以及CH2 組成部分的主鏈。仍然在其他實(shí)施方案中,多核苷酸具有硫代磷酸酯主鏈,且寡核苷具有雜原子主鏈,且包括美國專利5,489,677和5,602,240所述的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3) -O-CH2-、-CH2-O-N (CH3) -CH2-、-CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2-和 0-N (CH3) -CH2-CH2-。參閱例如美國專利 5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,214,134,5,216,141,5, 235,033,5, 264,562、 5,264,564,5,405,938,5,434,257,5,466,677,5,470,967,5,489,677,5,541,307, 5,561,225,5,596,086,5,602,240,5,610,289,5,602,240,5,608,046,5,610,289, 5,618,704,5, 623,070,5, 663,312,5, 633,360,5, 677,437,5, 792,608,5, 646,269 和 5,677,439,上述專利的公開通過引用全文并入本文。在各種形式中,寡聚體中兩個(gè)連續(xù)單體間連接由選自以下的2-4個(gè),優(yōu)選3個(gè)基團(tuán) / 原子組成:-CH2-、-0-、-S-、-NRH-、> C = 0、> C = NRH,> C = S、_Si(R" )2-、_S0-、-S( 0) 2_、-P (0) 2_、-PO (BH3) _、-P (0,S) -、-P (S) 2_、-PO (R" )-、-PO (OCH3)-和-PO (NHRH)-,其中 RH選自氫和C1-4-烷基,且R"選自C1-6-烷基和苯基。這類連接的說明性實(shí)例是-CH2-CH2 -CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH =(當(dāng)用作與隨后單體的連接時(shí),包括肪)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH 2-CH2-NRH-、-NRH-C0-0-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C ( = NRH) -NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-0-C0-0-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-0-C0-NRH-,-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-C0-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH = N_0_、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N =(當(dāng)用作與隨后單體的連接時(shí)包括肪)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-0-NRH、-0-CH2-S-、-S-CH2-0-、-CH2-CH2-S-、-0-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH =(當(dāng)用作與隨后單體的連接時(shí)包括肪)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-C H2-SO2-CH2-, -0-S0-0-, -O-S (0) 2-0-、-0_S (0) 2-CH2-、-0_S (0) 2-NRH-、-NRH_S (0) 2-CH2-、-0_S ( 0) 2-CH2-、-O-P (0) 2-o-、-O-P (0,S) -o-、-O-P (S) 2-0", -S-P (0) 2-0", -S-P (0,S) -o-、-S-P (S) 2 -0-、-0-P (0) 2-S-、-0-P (0,S) -s-、-O-P (S) 2-S-、-S-P (0) 2-S-、-S-P (0,S) -s-、-S-P (S) 2-s-、-O-PO (R" ) -O-,-0-P0(OCH3) -O-,-0-P0(OCH2CH3) -0-,-0-P0(OCH2CH2S-R) -0-,-0-P0 (BH3) -0-、-O-PO (NHRN) -0-、-0-P (0) 2-NRHH-、_NRH_P (0) 2-0-、-0_P (0,NRH) -0-、-CH2-P (0) 2-0-、-0_P (0) 2-CH2-和-O-Si (R〃 )2-o-;其中,考慮了 -ch2-co-nrh-、-ch2-nrh-o-、-s-ch2-o-、-o-p(o)2-o-o -P (-0,S) -ο-、-O-P (S) 2-0-、-NRHP (0) 2_0_、-O-P (0,NRH) -0-、-O-PO (R “ ) -0-、-O-PO (CH3) -0 -以及-0寸0^服幻-0-,如果冊(cè)選自氫和(1-4-烷基,且1 〃選自C1-6-烷基和苯基。其他說明性實(shí)例在下述文獻(xiàn)中給出:Mesmaeker et. al.,1995,Current Opinion in Structural Biology,5 :343-355 禾口 Susan Μ. Freier and Karl-Heinz Altmann,1997, Nucleic Acids Research, vol 25 :pp 4429-4443。其他修飾形式的多核苷酸還詳細(xì)描述于美國專利申請(qǐng)20040219565中,該申請(qǐng)的公開通過引用全文并入本文。修飾的多核苷酸也可以含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。在某些方面,多核苷酸在 2'位置包含下述之一 0H;F;0-、S-或N-烷基;0-、S-或N-烯基;0_、S-或N-炔基;或 0-烷基-0-烷基,其中,烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-Cltl烷基或C2-Cltl烯基和炔基。其他實(shí)施方案包括 0[ (CH2)n0]mCH3、0(CH2)n0CH3> O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3^ O(CH2) η0ΝΗ2以及O(CH2)nON[(CH2)nCHJ2,其中η禾Π m為1到約10。附加多核苷酸在2’位置包含下述之一Cl-ClO低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2, N3> NH2、雜環(huán)烷基、 雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基(polyalkylamino)、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入物(intercalator)、改善多核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)或改善多核苷酸藥效特性的基團(tuán),以及具有相似特性的其他取代基。在一方面,修飾包括2’ -甲氧基乙氧基 O' -O-CH2CH2OCH3,也稱為 2' -0- -甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin et al., 1995,HeIv. Chim. Acta,78 :486-504),即烷氧基烷氧基基團(tuán)。其他修飾包括2' -二甲基氨氧基乙氧基(dimethylaminooxyethoxy),即 0(CH2)20N(CH3)2 基團(tuán),也稱為 2’ -DMA0E,和 2' -二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域也稱為2' -0-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或 2 ‘ -DMAE0E),即 2 ‘ -O-CH2-O-CH2-N (CH3) 2。其他修飾還包括2 ‘-甲氧基 O ‘ -0-CH3)、2 ‘-氨丙基(T-OCH2CH2CH2NH2)、 2 ‘-烯丙基 O ‘ -CH2-CH = CH2)、2' -0-烯丙基 O ‘ -O-CH2-CH = CH2)和 2 ‘-氟 (2' -F)。2'修飾可以位于阿拉伯(向上)的位置或核糖(向下)的位置。在一方面, 2'-阿拉伯修飾是2' -F。也可以在多核苷酸的其他位置進(jìn)行相似的修飾,例如在3'末端核苷酸或2' -5'連接的多核苷酸上的糖的3'位置,和5'末端核苷酸的5'位置。多核苷酸也可以具有取代戊呋喃糖基糖的諸如環(huán)丁基部分的糖模擬物。參閱例如U. S. Pat. Nos. 4,981,957 ;5,118,800 ;5,319,080 ;5,359,044 ;5,393,878 ;5,446,137 ;5,466,786 ;
235,514,785 ;5,519,134 ;5,567,811 ;5,576,427 ;5,591,722 ;5,597,909 ;5,610,300 ; 5,627,053 ;5,639,873 ;5,646,265 ;5,658,873 ;5,670,633 ;5,792,747 ;和 5,700,920,上
述專利的公開通過引用全文并入本文。在一方面,糖的修飾包括鎖核酸(LNA),其中2'羥基連接于糖環(huán)的3'或4'碳原子。由此形成雙環(huán)糖部分。在某些方面連接時(shí)橋接2'氧原子和4'碳原子的亞甲基 (-CH2-)n基團(tuán),其中η是1或2。LNA和其制劑描述于WO 98/39352和WO 99/14226,上述文獻(xiàn)的公開通過引用并入本文。與納米顆粒相連的寡核苷酸預(yù)期用于本方法的寡核苷酸包括通過任何方式結(jié)合到納米顆粒的那些。在多個(gè)方面,無論通過何種方式將寡核苷酸與納米顆粒相連,均通過5'連接、3'連接、相同類型的內(nèi)部連接或這些連接的任意組合實(shí)現(xiàn)連接。連接方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且描述于美國公開No. 2009/02096 ,其通過引用全文并入本文。將RNA連接到納米顆粒的方法大致描述于PCT/US2009/65822,其通過引用全文并入本文。因此,在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明預(yù)期與納米顆粒相連的多核苷酸是 RNA。在一些方面,所提供了與寡核苷酸相連的納米顆粒,其中所述寡核苷酸進(jìn)一步包含與納米顆粒結(jié)合的域。在一些方面,所述域是聚胸腺嘧啶序列。在其他方面,所述域是磷酸酯聚合物(C3殘基)。在一些方面,與納米顆粒相連的寡核苷酸是DNA。當(dāng)DNA與納米顆粒相連時(shí),DNA 包含與多核苷酸的靶序列充分互補(bǔ)的序列,以使與納米顆粒相連的DNA寡核苷酸和靶多核苷酸發(fā)生雜交,從而使靶多核苷酸與納米顆粒結(jié)合。在多個(gè)方面,DNA是單鏈或雙鏈,只要雙鏈分子還包括與靶多核苷酸的單鏈序列雜交的單鏈序列。在一些方面,在納米顆粒上官能化的寡核苷酸的雜交可與雙鏈靶多核苷酸形成三元結(jié)構(gòu)。在另一方面,可通過官能化在納米顆粒上的雙鏈寡核苷酸的雜交與單鏈靶多核苷酸的雜交形成三元結(jié)構(gòu)。間隔區(qū)在某些方面,考慮了官能化的納米顆粒,其包括這樣的納米顆粒其中寡核苷酸通過間隔區(qū)連接于納米顆粒。本文所用的“間隔區(qū)”表示這樣的部分其本身不參與調(diào)節(jié)基因表達(dá),但是當(dāng)以多拷貝的方式連接于納米顆粒時(shí),其作用是增加納米顆粒和功能寡核苷酸之間的距離,或增加個(gè)體寡核苷酸之間的距離。因此所考慮的間隔區(qū)以串聯(lián)方式位于個(gè)體寡核苷酸之間,無論寡核苷酸具有相同的序列還是具有不同的序列。在一方面,如果存在, 間隔區(qū)是有機(jī)部分。在另一方面,間隔區(qū)是多聚體,包括但不限于水溶性多聚體、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂質(zhì)、乙二醇或其組合。在某些方面,間隔區(qū)具有與其共價(jià)結(jié)合的多核苷酸,所述多核苷酸可以與納米顆粒結(jié)合。如上文所述,這些多核苷酸是相同的多核苷酸。作為間隔區(qū)與納米顆粒結(jié)合的結(jié)果,多核苷酸被遠(yuǎn)離納米顆粒的表面隔開,并且更易與其靶標(biāo)雜交。在間隔區(qū)是多核苷酸的情況中,在各種實(shí)施方案中,間隔區(qū)的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸、10-30個(gè)核苷酸或甚至多于30個(gè)核苷酸。間隔區(qū)可以具有不干擾多核苷酸與納米顆粒或靶多核苷酸結(jié)合的能力的任何序列。間隔區(qū)不應(yīng)當(dāng)具有彼此互補(bǔ)或與寡核苷酸的序列互補(bǔ)的序列,但是可以與靶多核苷酸全部或部分互補(bǔ)。在某些方面,多核苷酸間隔區(qū)的堿基都是腺嘌呤、都是胸腺嘧啶、都是胞苷、都是鳥嘌呤、都是尿嘧啶或都是某些其他修飾的堿基。表面密度本文所提供的納米顆粒在納米顆粒的表面上具有多核苷酸的組裝密度,其在各種方面足以導(dǎo)致納米顆粒間和單個(gè)納米顆粒上多核苷酸鏈間的協(xié)作行為。在另一方面,納米顆粒間的協(xié)作行為增加了多核苷酸對(duì)核酸酶降解的抗性。仍然在另一方面,細(xì)胞攝取納米顆粒受與納米顆粒結(jié)合的多核苷酸的密度的影響。如PCT/US2008/65366所述,其在此通過引用全文并入,在納米顆粒表面上更高密度的多核苷酸與細(xì)胞攝取的納米顆粒的增加有關(guān)。足以使納米顆粒穩(wěn)定的表面密度和對(duì)于期望的納米顆粒和多核苷酸的組合獲得所述密度所需的條件可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。通常,至少2pmole/Cm2的表面密度足以提供穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸組合物。在某些方面,表面密度為至少15pmoles/Cm2。還通過了方法,其中多核苷酸以下述表面密度結(jié)合于納米顆粒至少2pmol/Cm2、至少3pmol/Cm2、至少 4pmol/cm2、至少 5pmol/cm2、至少 6pmol/cm2、至少 7pmol/cm2、至少 8pmol/cm2、至少 9pmol/ cm2、至少 10pmol/cm2、至少約 15pmol/cm2、至少約 20pmol/cm2、至少約 25pmol/cm2、至少約 30pmol/cm2、至少約 35pmol/cm2、至少約 40pmol/cm2、至少約 45pmol/cm2、至少約 50pmol/ cm2、至少約 55pmol/cm2、至少約 60pmol/cm2、至少約 65pmol/cm2、至少約 70pmol/cm2、至少約 75pmol/cm2、至少約 80pmol/cm2、至少約 85pmol/cm2、至少約 90pmol/cm2、至少約 95pmol/ cm2、至少約 IOOpmol/cm2、至少約 125pmol/cm2、至少約 150pmol/cm2、至少約 175pmol/cm2、 至少約 200pmol/cm2、至少約 250pmol/cm2、至少約 300pmol/cm2、至少約 350pmol/cm2、至少約 400pmol/cm2、至少約 450pmol/cm2、至少約 500pmol/cm2、至少約 550pmol/cm2、至少約 600pmol/cm2、至少約 650pmol/cm2、至少約 700pmol/cm2、至少約 750pmol/cm2、至少約 800pmol/cm2、至少約 850pmol/cm2、至少約 900pmol/cm2、至少約 950pmol/cm2、至少約 IOOOpmol/cm2 或更高。實(shí)施例實(shí)施例1納米顆粒的制備使用公開的方法[G.Frens,Nature Physical Science. 1973,241,20]制備檸檬酸穩(wěn)定的金納米顆粒(l-250nm)。盡管在本實(shí)施例中使用的大小為13nm和5nm,但其他實(shí)施例包括大小為Inm至500nm的納米顆粒。簡(jiǎn)要而言,通過在回流水中使用檸檬酸的處理還原四氯金酸??墒褂猛干潆娮语@微鏡法和紫外/可見分光光度法確定粒徑和分散度。使用標(biāo)準(zhǔn)的固相亞磷酉先胺法[Pon,R. T. Solid-phase supports for oligonucleotide synthesis. Methods in Molecular Biology(Totowa, NJ, United States)(1993),20(Protocols for Oligonucleotides and Analogs),465-496]合成硫醇化的寡核苷酸。隨后以3nmol寡核苷酸/ImLlOnM膠體的濃度,將硫醇修飾的寡核苷酸添加到13士 Inm和15nm的金膠體中并振蕩過夜。12小時(shí)后,向混合物中他添加十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(10% )以達(dá)到0. 1% SDS濃度,向混合物中添加磷酸鹽緩沖劑(0. IM ;pH = 7. 4)以達(dá)到0. 01磷酸鹽濃度,并向混合物中添加氯化鈉溶液(2. 0M)以達(dá)到0. IM的氯化鈉濃度。素后,在8小時(shí)的時(shí)期內(nèi),向混合物中添加6份氯化鈉溶液(2. 0M)試樣,以達(dá)到0. 3M的氯化鈉終濃度,并振蕩過夜以完成官能化過程。將溶液離心(13,000rpm,20min)并在無菌磷酸鹽緩沖液重懸三次以產(chǎn)生純化的綴合物。實(shí)施例2寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物方法本實(shí)施例中的寡核苷酸設(shè)計(jì)包括兩個(gè)可能的作用機(jī)制。第一,使用公開的質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)序列,其將優(yōu)先與氨芐青霉素抗性(AmpR)基因內(nèi)酰胺酶的啟動(dòng)子位點(diǎn)的正義鏈雜交。利用綴合物與細(xì)菌基因組中AmpR啟動(dòng)子序列的優(yōu)先雜交(由更有利的結(jié)合常數(shù)和/或顆粒的細(xì)胞內(nèi)濃度賦予),這將使細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素敏感化。這將防止啟動(dòng)子復(fù)合物與其靶位點(diǎn)結(jié)合,并防止mRNA轉(zhuǎn)錄本(Amp抗性基因)轉(zhuǎn)錄,從而使細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素敏感化。所使用的序列為 5' -AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC ATA TTT GAA AAA AAA AAA A-SH-3' (SEQ ID NO :1)禾口 5' -AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC AM AM MA A-SH-3' (SEQ ID NO 2)。第二個(gè)策略可利用經(jīng)設(shè)計(jì)而與AmpR基因的內(nèi)部區(qū)域雜交的序列。這樣,將阻止完整mRNA轉(zhuǎn)錄本的完成。其下游作用是阻止功能性mRNA轉(zhuǎn)錄本(Amp抗性基因)的完整轉(zhuǎn)錄,并由此使細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素敏感化。對(duì)于此策略,選擇正義鏈以與靶雙鏈DNA雜交。其中的序列為 5' -ACT TTT AAA GTT CTG CTA TAA AAA AAA AA-SH-3' (SEQ ID NO :3)。圖 1中顯示了兩個(gè)策略的示意圖?;蛘?,也可以使用傳統(tǒng)的翻譯策略以結(jié)合mRNA,并阻止蛋白產(chǎn)生,由此使細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素敏感化。按照公開的方法(Promega和Invitrogen),使用包含氨芐青霉素的質(zhì)粒 (p si CHECK 2,?1~011^83或?5(;儀611-11\ Invitrogen)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞 JM109,并在包含抗生素(Amp)的平板上培養(yǎng)。選擇單個(gè)菌落,并在含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)。使用此培養(yǎng)物形成冷凍(10%甘油)母液以用于后續(xù)試驗(yàn)。在將大腸桿菌母液融化后,將小體積在帶有或沒有氨芐青霉素的液體肉湯中培養(yǎng),并涂布在相應(yīng)的LB平板上。在一個(gè)實(shí)施例中,將5 μ L冷凍細(xì)菌肉湯在ImL帶有30ηΜ 顆粒的LB肉湯中培養(yǎng)5. 5小時(shí)。從ImL中取100 μ L涂平板并培養(yǎng)過夜。使用透射電子顯微鏡法(圖2、確認(rèn)細(xì)菌進(jìn)入。在使用納米顆粒處理數(shù)個(gè)小時(shí)后,將小體積的細(xì)菌涂布到氨芐青霉素陽性或氨芐青霉素陰性的平板上。使細(xì)菌在這些平板上生長(zhǎng)額外的12小時(shí),并評(píng)估每種條件下生長(zhǎng)的菌落數(shù)量。結(jié)果總結(jié)在下表1中。使用此策略獲得了 66%的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制。預(yù)期條件的常規(guī)優(yōu)化將產(chǎn)生100%成功的細(xì)菌敏感化。表權(quán)利要求
1.一種包含寡核苷酸修飾的納米顆粒的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與原核基因的目標(biāo)非編碼序列充分互補(bǔ),所述互補(bǔ)的程度足以與目標(biāo)非編碼序列在允許雜交的條件下雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的抗生素組合物,其中與所述原核基因的雜交抑制原核細(xì)胞的生長(zhǎng)。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸的雜交抑制由所述原核基因編碼的功能性原核蛋白的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求3所述的抗生素組合物,其中與沒有接觸所述寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,所述功能性原核蛋白的表達(dá)被抑制約75%。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中雜交導(dǎo)致活性改變的原核基因編碼的蛋白的表達(dá)。
6.如權(quán)利要求5所述的抗生素組合物,其中與沒有接觸所述寡核苷酸修飾的納米顆粒的細(xì)胞相比,所述活性降低約10%。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中雜交抑制所述原核基因的轉(zhuǎn)錄。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中雜交抑制由所述原核基因編碼的功能性蛋白的翻譯。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸的雜交抑制原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的翻譯。
10.如權(quán)利要求9所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸的雜交抑制對(duì)于原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白的表達(dá),所述對(duì)于原核細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的功能性蛋白選自以下組成的組革蘭氏陰性基因產(chǎn)物、革蘭氏陽性基因產(chǎn)物、細(xì)胞周期基因產(chǎn)物、參與DNA復(fù)制的基因產(chǎn)物、細(xì)胞分裂基因產(chǎn)物、參與蛋白合成的基因產(chǎn)物、細(xì)菌促旋酶和酰基載體基因產(chǎn)物。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述原核基因編碼賦予抗生素抗性的蛋白。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中還包含抗生素試劑。
13.如權(quán)利要求12所述的抗生素組合物,其中所述抗生素試劑選自以下組成的組青霉素G、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氨芐青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐青霉素、美洛西林、阿洛西林、哌拉西林、亞胺培南、氨曲南、頭孢噻吩、頭孢克洛、頭孢西丁、頭孢呋辛、頭孢尼西、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢丙烯、氯碳頭孢、頭孢他美、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢泊肟、頭孢磺啶、氟羅沙星、萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、洛美沙星、西諾沙星、強(qiáng)力霉素、 米諾環(huán)素、四環(huán)素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、鏈霉素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、依托紅霉素、紅霉素琥珀酸乙酯、葡庚糖酸紅霉素、乳糖酸紅霉素、 硬脂酸紅霉素、萬古霉素、替考拉寧、氯霉素、克林霉素、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、 利福平、莫匹羅星、甲硝唑、頭孢氨芐、羅紅霉素、阿莫西林-克拉維酸鹽組合、哌拉西林和他唑巴坦的組合,及其各種鹽、酸、堿和其它衍生物。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與所述原核基因的非編碼鏈中的序列充分互補(bǔ)。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與所述原核基因的非編碼序列中的序列充分互補(bǔ),所述互補(bǔ)程度足以形成三鏈結(jié)構(gòu)。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述雜交在所述寡核苷酸和所述非編碼序列以及與所述非編碼序列互補(bǔ)的編碼序列之間形成三鏈結(jié)構(gòu)。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與所述原核基因的所述非編碼序列中的序列充分互補(bǔ),所述互補(bǔ)的程度足以在所述寡核苷酸和所述非編碼序列之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述非編碼序列是啟動(dòng)子序列。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與3'非編碼序列雜交。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其中所述寡核苷酸與5'非編碼序列雜交。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其與靶序列在體外雜交。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,其與靶序列在體內(nèi)雜交。
23.—種抑制細(xì)胞中靶基因產(chǎn)物產(chǎn)生的方法,其包括以下步驟使所述細(xì)胞在一定條件下接觸權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的抗生素組合物,在所述條件下雜交導(dǎo)致由所述靶基因編碼的功能性蛋白產(chǎn)生被抑制。
24.一種治療原核生物感染的方法,所述方法包括向細(xì)胞施用治療有效量的包含權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的納米顆粒的組合物的步驟。
25.—種試劑盒,其包含抗生素和權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及寡核苷酸修飾的納米顆粒綴合物和抑制細(xì)菌蛋白生產(chǎn)的方法。
文檔編號(hào)A01N43/04GK102307470SQ201080007013
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日
發(fā)明者大衛(wèi)·A·吉拉約翰, 尼馬·納瓦伊, 查德·A·米爾金 申請(qǐng)人:西北大學(xué)
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