Ke修飾的5-氟尿嘧啶，其制備，納米結(jié)構(gòu)，活性及應(yīng)用
【專利說(shuō)明】KE修飾的5-氟尿嘧陡，其制備，納米結(jié)構(gòu)，活性及應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及5-氟尿啼陡-1-基乙酰-Lys-Glu及其制備方法，Lys-Glu的正規(guī)簡(jiǎn) 稱是KE。涉及它的納米結(jié)構(gòu)及它的體內(nèi)外抗腫瘤作用，涉及它抗腫瘤細(xì)胞粘附侵襲和遷移 的作用。因而本發(fā)明涉及它在制備抗腫瘤藥物，制備抗腫瘤細(xì)胞遷移粘附和侵襲藥物中的 應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 5-氟尿嘧啶是一臨床常用的抗腫瘤藥物，它可用于多種癌癥的治療，胃癌，肝癌， 結(jié)腸等。雖然5-氟尿嘧啶對(duì)于腫瘤的治療有不錯(cuò)的療效，但其也存在一些不容忽視的問(wèn) 題。例如體內(nèi)半衰期短，口服生物利用度低，給藥劑量與中毒劑量相近，毒副作用大。為了 能更好地發(fā)揮5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用，提高其抑瘤效果、減少毒副作用。多年來(lái)人們對(duì) 5_氟尿嘧啶進(jìn)行了大量的修飾工作，合成了多種5-氟尿嘧啶衍生物，如在5-氟尿嘧啶上引 入葡萄糖、葉啉類化合物，金屬配合物，氨基酸和短肽等。遺憾的是這些努力并沒(méi)有獲得期 待的結(jié)果。在5-氟尿嘧啶的結(jié)構(gòu)修飾中，還有將RGD三肽引入的合成研究。因?yàn)樵谝恍┲?要的研究中，R⑶三肽已確認(rèn)對(duì)整合素受體沒(méi)有識(shí)別作用，所以這種修飾是一種目標(biāo)含糊的 化學(xué)工作，對(duì)5-氟尿嘧啶沒(méi)有任何生物學(xué)意義。
[0003] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α νβ3的阻斷劑，具有抗血栓和抗細(xì)胞 粘附活性。圖1是發(fā)明人創(chuàng)造的結(jié)構(gòu)類型的代表。盡管發(fā)明人付出了大量研究精力，篩選 了數(shù)百種化合物，一直沒(méi)有得到同時(shí)具有抗腫瘤和抗腫瘤粘附浸潤(rùn)和遷移作用的化合物。
[0004] 發(fā)明人在分析數(shù)百種化合物的結(jié)構(gòu)及活性變化的基礎(chǔ)上，認(rèn)識(shí)到將ΚΕ與5-氟尿 啼陡偶聯(lián)，形成的5-氟尿啼陡-1-基乙酰-Lys-Glu會(huì)同時(shí)具有抗腫瘤和抗腫瘤細(xì)胞粘附 浸潤(rùn)和遷移作用?；谶@個(gè)認(rèn)識(shí)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供下面結(jié)構(gòu)的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu的制備方法，該方 法由以下步驟構(gòu)成：
[0007] (1)60°C5-氟尿嘧啶在溴乙酸乙酯溶液，30%NaOH的水溶液中反應(yīng)10h，然后在冰 水浴，濃鹽酸存在下形成5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；
[0008] (2)采用液相合成制備Lys(Z)-Glu(0Bzl)_0Bzl;
[0009] (3)將1^8(2)-6111((?21)-(?21與5-氟尿嘧啶-1-基乙酸偶聯(lián)，制備5-氟尿嘧 陡 _1_ 基乙醜-Lys(Z)_Glu(OBzl) _0Bzl;
[0010] (4)將5-氟尿啼陡-1-基乙醜-Lys(Z)-Glu(OBzl)-〇Bzl脫保護(hù)，制備5-氟尿啼 啶-1-基乙酰-Lys-Glu。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu的抗細(xì)胞增殖活 性。
[0012] 本發(fā)明的第四個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu對(duì)荷S180小鼠腫 瘤增長(zhǎng)的抑制作用。
[0013] 本發(fā)明的第五個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu抗腫瘤細(xì)胞粘附， 侵襲和遷移作用。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1.發(fā)明人創(chuàng)造的抗腫瘤活性化合物的結(jié)構(gòu)類型代表。
[0015] 圖 2. 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu的合成路線·i)DCC，HOBt，NMM，THF;ii) 氯化氫/乙酸乙酯溶液（4N) ;iii)TFA，TFMSA;iv)Na0H(30% )，60°C，溴乙酸乙酯，濃HC1。
[0016] 圖3. 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu在純水溶液中1X10 5M濃度下的透射電鏡 照片。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018] 實(shí)施例1制備5-氟尿嘧啶-1-基乙酸
[0019] 1. 30g(10mmol)5-氟尿嘧啶置于100mL茄瓶中，加入10mLNa0H(30% )的水溶液 溶解，將反應(yīng)加熱升溫至60°C，待完全溶解，緩慢滴加1. 75mL溴乙酸乙酯溶液，恒溫60°C 反應(yīng)12h，TLC(乙酸乙酯：冰醋酸：水=5 : 2 : 0. 5)顯示反應(yīng)完成。將反應(yīng)液冷卻至 室溫，冰浴下緩慢滴加濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH至2,攪拌0. 5h，有無(wú)色固體析出，過(guò)濾，將濾餅分別 用冰水和乙醚洗三次，陰涼處晾干，得0. 56g(30% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/ e) :189 [Μ+Η]+· 4NMR(500MHz，DMS0-d6) :δ/ppm= 13.21 (s，lH)，11.89 (d，J= 4. 5HzlH)， 8. 07(d，J= 6. 5HzlH)，4. 37(s，2H)。
[0020]實(shí)施例 2 制備Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl
[0021] 3. 83g(10mmol)Boc-Lys(Z)用20mL無(wú)水THF溶解于250mL反應(yīng)瓶中，冰浴下加入 1. 48g(l.lmmol)N_ 羥基苯駢三氮唑（HOBt)及 2. 47g(l. 2mmol)二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)， 攪拌30min得到反應(yīng)物A。另將5. 17gTos*Glu(OBzl) -OBzl用20mL無(wú)水THF溶解于250mL 反應(yīng)瓶，冰浴下緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調(diào)節(jié)pH至9,得到反應(yīng)物B。冰浴下，將反應(yīng)物B 加入反應(yīng)物A中，緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調(diào)節(jié)pH至9,室溫下攪拌反應(yīng)12h，薄層層析 TLC(石油醚：丙酮=4 : 1)顯示反應(yīng)完成。反應(yīng)液過(guò)濾，減壓除去溶劑，殘留物柱層析分 離（石油醚-丙酮系統(tǒng)），制得 4. 20g(54.0%)。Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl。ESI-MS(m/ e):691[M+H]+〇
[0022] 實(shí)施例 3 制備HC1 ·Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl
[0023] 冰水浴下，· 20gg(5. 4mmol)Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl與 25mL氯化氫的乙酸乙 酯溶液（4N)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，薄層層析TLC(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=20 : 1 : 0.1) 顯示反應(yīng)完成。減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)用少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化 氫，制得2·88g(90·0%)HCl·Lys(Z)-Glu(0Bzl)-0Bzl。ESI-MS(m/e):589[M-H]。
[0024] 實(shí)施例 4 制備 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl(2)
[0025] 0. 90g(4. 8mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酸用15mL無(wú)水DMF溶解于100mL反應(yīng)瓶中， 冰浴下加入0. 71g(5. 28mmol)N-羥基苯駢三氮唑（HOBt)及1. 19g(5. 76mmol)二環(huán)己基碳二 亞胺（DCC)，攪拌 30min得到反應(yīng)物A。另將 2.88g(4.8mmol)HCl?LysO-GliKOBzD-OBzl 用20mL無(wú)水DMF溶解于100mL反應(yīng)瓶，冰浴下緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調(diào)節(jié)pH至9， 得到反應(yīng)物B。冰浴下，將反應(yīng)物B加入反應(yīng)物A中，緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調(diào)節(jié)pH 至9,室溫下攪拌反應(yīng)12h，薄層層析TLC(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=15 : 1 : 0.1)顯 示反應(yīng)完成。反應(yīng)液過(guò)濾，減壓除去溶劑，殘留物柱層析分離（二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)）， 制得0·30g(0·93%)5-氟尿嘧啶-l-基乙酰-Lys(Z)-Glu(0Bzl)-0Bzl，ESI-MS(m/e): 761[M+H]VH-匪R(300MHz，DMS0-d6) :δ/ρρπι= 8.45-8.33(m，2H)，8.17-8.14(d，lH)， 7. 62-7. 06 (m，15H)，6. 85 (m，1H)，5. 14-5. 00 (m，6H)，4. 38-4. 26 (m，4H)，2. 94-2. 90 (m，2H)， 2. 88-2. 76 (m，2H)，2. 38-2. 36 (m，2H)，2. 15-1. 82 (m，3H)，1. 60-0. 96 (m，7H)。實(shí)施例 7 制備 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu(3)
[0026] 冰浴下 0· 37g(0· 40mmol) 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl(2)溶 解于lOmL三氟乙酸中，得到的溶液加入2mL三氟甲磺酸（TFMSA)，攪拌反應(yīng)1. 5h，薄層層析 TLC(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=10 : 1 : 0. 1)及（乙酸乙酯：冰醋酸：水=5 : 2 : 1) 顯示反應(yīng)完成。冰浴下，往反應(yīng)化合物中加入大量無(wú)水乙醚，攪拌至有無(wú)色固體析出，過(guò)濾， 濾餅用蒸餾水溶解，氨水（10% )調(diào)節(jié)pH至6,用C18進(jìn)行柱分離，得到0. 013g(37% ) 5-氟 尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu。ESI-MS(m/e) :446[M+H]+.mp:193. 5-195. 2 °C;[a]D25 =-27.31(c= 0·1，CH30H).IR(KBr) :3360,3219,2960,1680,1541，1463,1261，1091，1008， 794em^-NMR(300MHz,DMS0 ：D20 = 4 ： 1) ：δ/ppm= 8. 03-8. 01 (m, 1H)4. 42-4. 32 (m, 2H)，4. 09-4. 07 (m，2H)，2. 96-2. 86 (m，2H)，2. 27-2. 15 (m，2H)，1. 80-1. 78 (m，1H)， 1. 60-1. 55(m，2H)，1. 39-1. 13(m，2H).純度：100 % 流動(dòng)相：CH30H:H20 :冰醋酸= 95 : 5 : 0· 1 保留時(shí)間：4. 68min。
[0027] 實(shí)驗(yàn)例1測(cè)定化合物3的透射電鏡照片
[0028] 將化合物3按照1X10 5M的濃度配置化合物的純水溶液，均勻的鋪在銅網(wǎng)上，在 透射電鏡（TEM，JEM-1230，JE0L)下觀察化合物的自組裝性質(zhì)。得到的照片如圖3。結(jié)果表 明，化合物3在水中均可形成納米顆粒，直徑在40-400nm。
[0029] 實(shí)驗(yàn)例2測(cè)定化合物3對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用
[0030] 1)本發(fā)明的化合物3用含0. 1 %DMS0的培養(yǎng)基配制成所需濃度。
[0031] 2)實(shí)驗(yàn)用的腫瘤細(xì)胞為!fepG2 (人肝細(xì)胞癌細(xì)胞），HL60(人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì) 胞），BEL-7402 (人肝癌細(xì)胞），MCF-7 (人乳腺癌細(xì)胞），HeLa(人宮頸癌細(xì)胞），U-20S(人 骨肉瘤細(xì)胞），S180 (小鼠腹水瘤細(xì)胞），L02 (人正常肝細(xì)胞）和Haca-T(人表皮正常細(xì)胞 株）。
[0032] 3)實(shí)驗(yàn)方法HL-60,BEL-7402,MCF-7 和S180 細(xì)胞選用RPMI-1640 培養(yǎng)基；HeLa， !fepG2，U-20S，L02和Haca-T細(xì)胞選用DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中均含10%經(jīng)滅活的胎牛血清 和1X105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素。
[0033] 貼壁細(xì)胞Η印G2,MCF-7,BEL-7402,HeLa，Haca-T，U-20S和半貼壁細(xì)胞S180 的培 養(yǎng)：分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以3X104個(gè)/mL的密度接種于96孔板， 每孔100μL，置于37°C和5 %C02的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4小時(shí)，然后按預(yù)設(shè)的濃度梯度加 入經(jīng)滅菌處理的化合物3與含0. 1 %DMS0的培養(yǎng)基配制成的溶液，每孔25μL，對(duì)照組加入 等體積的溶解樣品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液， 置于37°C和5%C02的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4小時(shí)。小心除去上清液后每孔加入100μL的 DMSO,振蕩約lOmin溶解紫色殘留物（甲瓚），立即于酶標(biāo)儀上檢測(cè)0·D.(吸光度）值，波長(zhǎng) 為 570nm。
[0034] 懸浮細(xì)胞HL60的培養(yǎng)：分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5X104個(gè) /mL的密度接種于96孔板，每孔100μL，然后按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入經(jīng)滅菌處理的化合物 3與含0. 1%DMSO的培養(yǎng)基配制成的溶液，每孔25μL，對(duì)照組加入等體積的溶解樣品的溶 媒，置于37°C和5%C02的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)48小時(shí)。每孔加入25μL濃度為5mg/mL的 MTT溶液，繼續(xù)置于條件為37°C和5%C02的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4小時(shí)。2500rpm離心lOmin， 小心吸出上清液，每孔加入lOOyLDMSO,振蕩約lOmin溶解紫色殘留物（甲瓚），立即于酶 標(biāo)儀上檢測(cè)〇·D