專利名稱：一種全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草是一種名貴的菌類中藥材，是中國(guó)被毛孢侵染只生長(zhǎng)在3500-5000公尺 高寒灌叢草甸的蝙蝠蛾幼蟲產(chǎn)生的有性型。冬蟲夏草主要分布于我國(guó)西南、西北3500公尺 以上的高原，主要產(chǎn)區(qū)是四川、青海、西藏及云貴高原。夏初子座出土、孢子未散發(fā)時(shí)挖取， 除去包裹在蟲體外的菌絲體干燥。由于產(chǎn)區(qū)局限、產(chǎn)量稀少，國(guó)內(nèi)外的需求量日益增大，刺 激亂采濫挖，生態(tài)破壞嚴(yán)重，致使冬蟲夏草產(chǎn)量急劇下降，價(jià)格直線上升，供求矛盾突出。全人工培育冬蟲夏草是解決上述問題的方法之一。目前報(bào)道的全人工培養(yǎng)冬蟲夏 草的文獻(xiàn)有申請(qǐng)?zhí)?00410021927.X，授權(quán)公告號(hào)CN1312271C，發(fā)明名稱冬蟲夏草的全 人工培養(yǎng)方法，申請(qǐng)日2005年1月5日的發(fā)明專利中公開了一種冬蟲夏草的全人工冬蟲 夏草的方法，其步驟為a，取樣取冬蟲夏草樣本(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)；b，菌種分離分別取冬蟲夏草的菌核部分、子座部分及子囊孢子進(jìn)行分離、培養(yǎng)得 中國(guó)被毛孢(Hiesutella Sinensis Liu, Guo, Yu et Zeng.)，保藏號(hào) CCTCC No. M871010 ； 菌種分離是將菌核、子座部分經(jīng)表面消毒、無菌水沖洗后，將菌核及子座切成小段或薄片， 或挑取子囊孢子置有分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在8°C 20°C進(jìn)行分離、培養(yǎng)；所述的分離培 養(yǎng)基為馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、水或者馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蠶蛹汁、水；c，寄主昆蟲采集、繁殖和飼養(yǎng)寄主蝠蛾H印ialus Spp.幼蟲首次采自海拔 3500 5000公尺的高寒灌叢草甸，在人工條件下經(jīng)過化蛹、羽化為成蟲、交尾、產(chǎn)卵，孵化、 幼蟲飼養(yǎng)循環(huán)進(jìn)行；具體步驟為①寄主昆蟲的采集寄主蝠蛾幼蟲首次采自海拔3500 5000公尺的高寒灌叢草 甸；②化蛹化蛹期溫度為10°C 18°C，濕度45% 60%，蛹的歷期20 50天；③羽化蛹的羽化溫度10°C 18°C，羽化的空氣相對(duì)濕度為80% 100% ；④成蟲、交尾羽化后的成蟲即可交尾，通過人為幫助提高交尾率；⑤產(chǎn)卵交尾后的雌成蟲即行產(chǎn)卵，收集卵粒置容器養(yǎng)護(hù)；⑥孵化在10 18°C，相對(duì)濕度60 90%的條件下，經(jīng)20 55天即孵化；⑦幼蟲飼養(yǎng)幼蟲飼養(yǎng)溫度8 18°C，濕度40 50% ；d，侵染將b步驟所得的菌絲體、分生孢子制成混懸液，侵染c步驟繁殖的蝠蛾幼 蟲；e，繼續(xù)飼養(yǎng)將d步驟經(jīng)侵染后的幼蟲繼續(xù)飼養(yǎng)至呆滯狀態(tài)，經(jīng)低溫4 8°C，光 照處理，至長(zhǎng)出子實(shí)體，即得人工培養(yǎng)的冬蟲夏草。該方法可以實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的全人工培育，但是，使用該培育方法仍有許多不足之處蝠蛾蛹不當(dāng)死亡率高、羽化率低；用于侵染的混懸液孢子含量低，不利于侵染；侵染方 法機(jī)械化操作程度有待提高，侵染率較低，侵染后至幼蟲僵化的時(shí)間較長(zhǎng)，僵化幼蟲長(zhǎng)原基 的時(shí)間參差不齊，工業(yè)化效率有待進(jìn)一步提高。由于平原人工飼養(yǎng)寄主蝠蛾幼蟲難度較大、中國(guó)被毛孢遺傳育種和侵染方法等原 因使得冬蟲夏草不能產(chǎn)業(yè)化，不能滿足市場(chǎng)對(duì)冬蟲夏草的需求。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決人工培育冬蟲夏草產(chǎn)量低的問題，本發(fā)明提供了一種新的全人工培育冬 蟲夏草的技術(shù)方案。本發(fā)明提供的新的全人工培育冬蟲夏草的技術(shù)方案為一種冬蟲夏草的全人工培 養(yǎng)方法，包括下列步驟 a、中國(guó)被毛孢混懸液的制備取保藏號(hào)為CCTCC No. M87101的中國(guó)被毛孢 Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，制備菌體和孢子的混懸液;b、寄主昆蟲的采集、繁殖和飼養(yǎng)首次采集不同產(chǎn)地的冬蟲夏草寄主蝠蛾蛹；在 人工條件下，對(duì)寄主蝠蛾進(jìn)行蛹的養(yǎng)護(hù)、羽化、交尾、產(chǎn)卵、卵的養(yǎng)護(hù)、孵化、幼蟲飼養(yǎng)，且循 環(huán)進(jìn)行；c、侵染取步驟b所述的蝠蛾幼蟲，用一端直徑小于0. 2mm的針狀器具沾取步驟a 的混懸液刺中蝠蛾幼蟲完成侵染；d、繼續(xù)飼養(yǎng)將步驟c經(jīng)侵染后的幼蟲繼續(xù)飼養(yǎng)至僵化，經(jīng)低溫4 8°C，光照處 理，長(zhǎng)出子實(shí)體，直至子實(shí)體抽生到3 5厘米長(zhǎng)度，收獲，干燥處理，即得冬蟲夏草。步驟a所述的制備菌體、孢子的混懸液的方法，包括下列步驟①，取保藏號(hào)為CCTCC No. M87101 的中國(guó)被毛孢 Hirsutella Sinensis Liu,Guo, Yu et Zeng.依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌液；②，將所得菌液中的菌絲體搗碎，用50-100目濾網(wǎng)濾過，濾液即為菌體和孢子的 混懸液，所述混懸液至少含有IO3個(gè)/ml孢子。前述步驟①的斜面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基每 IOOOml中含有碳源20g 50g,氮源IOg 45g，磷酸二氫鉀1. Og,硫酸鎂0. 5g，水IOOOml ； 所述碳源為葡萄糖、蔗糖或者葡萄糖和蔗糖，氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、蠶蛹粉中的一 種或者兩種以上的配合。步驟b中所述蛹的養(yǎng)護(hù)和羽化溫度為10_18°C，相對(duì)濕度為70-95% ；步驟b中所 述蛹的養(yǎng)護(hù)過程采用養(yǎng)護(hù)床，所述養(yǎng)護(hù)床為透氣隔離裝置；步驟b中所述交尾過程采用交 尾帳，其由網(wǎng)眼布制成，體積為IM3 6M3。步驟c中的針狀器具是一端直徑小于0. 2mm的不銹鋼實(shí)心針或空心針；步驟c中 刺中蝠蛾幼蟲的部位為蝠蛾幼蟲尾部背線或近尾部背線。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法在寄主蝠蛾蛹的養(yǎng) 護(hù)、中國(guó)被毛孢的培養(yǎng)和中國(guó)被毛孢對(duì)寄主蝠蛾侵染這三個(gè)步驟均有改進(jìn)。本發(fā)明提供的 方法可以降低蝠蛾蛹的不當(dāng)死亡率，提高蝠蛾蛹的羽化率，現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的蝠蛾蛹的不 當(dāng)死亡率為60%左右，而本發(fā)明蝠蛾蛹的成活率達(dá)到80% ；提高蝠蛾交尾率，由40%左右 提高到85%以上；大幅度的提高中國(guó)被毛孢對(duì)寄主蝠蛾幼蟲的侵染率，使侵染率從60%提高到80-90%，縮短侵染后幼蟲僵化的時(shí)間。本發(fā)明提供的全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法可以實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法一、寄主蝠蛾幼蟲飼養(yǎng)1)、蛹的采集寄主蝠蛾蛹首次采自海拔3500 5000公尺的草原；2)、蛹的養(yǎng)護(hù)和羽化采集的蝠蛾蛹置于養(yǎng)護(hù)床中養(yǎng)護(hù)，該養(yǎng)護(hù)床是由網(wǎng)眼布或者 紗網(wǎng)制備的裝置，其具有隔離作用，與外界通氣不密封，防止外界的寄生蜂等天敵進(jìn)入，容 易控制蛹養(yǎng)護(hù)的溫度和濕度，防止羽化后的成蟲到處飛舞，其內(nèi)部可以安裝溫度和濕度檢 測(cè)儀?？刂起B(yǎng)護(hù)溫度到10 18°C，養(yǎng)護(hù)床內(nèi)的相對(duì)濕度調(diào)節(jié)到70 95%，養(yǎng)護(hù)30 60 天后蛹羽化；3)、交尾待羽化后成蟲逐漸展翅，將養(yǎng)護(hù)床內(nèi)羽化的成蟲轉(zhuǎn)移到交尾帳內(nèi)交尾， 該交尾帳由網(wǎng)眼布制成，且體積為IM3 6M3 ；4)、產(chǎn)卵交尾后的雌成蟲即行產(chǎn)卵，收集卵粒置容器養(yǎng)護(hù)；5)、卵的養(yǎng)護(hù)受精卵在孵化容器中保持8 15°C溫度下保濕，相對(duì)濕度為60 90% ；6)、孵化相對(duì)濕度為60 90%，溫度為8 15°C，卵期20 45天；7)、幼蟲飼養(yǎng)溫度為8 20°C，相對(duì)濕度60 90%。在不使用養(yǎng)護(hù)床的情況下，蝠蛾蛹的不當(dāng)死亡率為60%左右，而使用本發(fā)明養(yǎng)護(hù) 床的情況下，蛹的存活率達(dá)到80%以上，成蟲交尾率由40%以下提高到85%以上。二、中國(guó)被毛孢培養(yǎng)1)取中國(guó)被毛孢 Hirsutella Sinensis Liu, Guo, Yu et Zeng.，保藏號(hào)為 CCTCC Νο·Μ87101。2)培養(yǎng)將中國(guó)被毛孢Hirsutella Sinensis Liu,Guo,Yu et Zeng.按照下述條件依次進(jìn) 行斜面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌液。a，斜面培養(yǎng)。培養(yǎng)基(每1000ml):葡萄糖10g，蔗糖30g，牛肉膏5g，蛋白胨10g， 蠶蛹汁20g，酵母粉10g，瓊脂20g，磷酸二氫鉀1. 0，硫酸鎂0. 5g，水1000ml。培養(yǎng)條件=PH 6. 5，溫度10 20°C，培養(yǎng)時(shí)間10 30天；b，液體振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基(每1000ml):葡萄糖10g，蔗糖30g，牛肉膏，5g，酵母粉 10g，蠶蛹汁，20g，磷酸二氫鉀1.(^，硫酸鎂0.58，水1000ml。培養(yǎng)條件PH 6.0 7.0，搖 床100 200rpm，15 20°C，培養(yǎng)時(shí)間7 15天；c，種子發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基每(1000ml)葡萄糖10g，蔗糖20g，麥皮汁 20g，酵母粉10g，蠶蛹汁30g，磷酸二氫鉀1. 0g，硫酸鎂0. 5g，水1000ml。培養(yǎng)條件:ΡΗ6· 5，培養(yǎng)溫度15 20°C，通氣量1 1(V/V)，接種量5 20%，培養(yǎng)時(shí)間7 15天。3)將所得菌液中的菌絲體搗碎，用50 100目濾網(wǎng)濾過，濾液即為菌體和孢子的 混懸液。用現(xiàn)有技術(shù)公開的方法制備得到的菌體和孢子的混懸液含有的孢子少，而用上述 方法制備得到的菌體合孢子的混懸液含有的孢子多。菌體和孢子的混懸液中含有的孢子越 多，其對(duì)蝠蛾幼蟲的侵染率越高，因此，上述制備菌體和孢子的混懸液的方法更有利于中國(guó) 被毛孢對(duì)蝠蛾幼蟲的侵染。三、中國(guó)被毛孢對(duì)蝠蛾幼蟲的侵染取培養(yǎng)得到的中國(guó)被毛孢混懸液，用針尖直徑小于0. 2mm的不銹鋼空心針或者實(shí) 心針沾取混懸液針刺蝠蛾幼蟲，完成侵染。針剌蝠蛾幼蟲的尾部流出的體液少，死亡率低，侵染率和產(chǎn)座率高。本發(fā)明侵染方法突破表皮屏障直接把中國(guó)被毛孢菌體帶入寄主體內(nèi)，大量的中國(guó) 被毛孢菌絲段，分生孢子涌入幼蟲體內(nèi)，直接破壞了寄主的免疫系統(tǒng)，比中國(guó)被毛孢一個(gè)個(gè) 孢子和菌絲段芽管侵染表皮具有巨大的侵染優(yōu)勢(shì)。大幅度的提高了侵染率，使侵染率從 60%以下提高到80 90%，使冬蟲夏草的工業(yè)化生產(chǎn)效率大幅度提高。四、繼續(xù)飼養(yǎng)將步驟三侵染后的幼蟲繼續(xù)飼養(yǎng)至僵化，飼養(yǎng)溫度8 20°C，相對(duì)濕度60 90% ；幼蟲僵化后，經(jīng)低溫4 8°C，光照處理，長(zhǎng)出子實(shí)體，直至子實(shí)體抽生到3 5厘米 長(zhǎng)度，進(jìn)行收獲，干燥處理。綜上，本發(fā)明提供的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法可以實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的大規(guī)模、產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)，進(jìn)一步滿足市場(chǎng)對(duì)冬蟲夏草的需求。
權(quán)利要求
1.一種冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于包括下列步驟a、中國(guó)被毛孢混懸液的制備取保藏號(hào)為CCTCCNO.M87101的中國(guó)被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，制備菌體和孢子的混懸液;b、寄主昆蟲的采集、繁殖和飼養(yǎng)首次采集不同產(chǎn)地的冬蟲夏草寄主蝠蛾蛹；在人工 條件下，對(duì)寄主蝠蛾進(jìn)行蛹的養(yǎng)護(hù)、羽化、交尾、產(chǎn)卵、卵的養(yǎng)護(hù)、孵化、幼蟲飼養(yǎng)，且循環(huán)進(jìn) 行；C、侵染取步驟b所述的蝠蛾幼蟲，用一端直徑小于0. 2mm的針狀器具沾取步驟a的混 懸液刺中蝠蛾幼蟲完成侵染；d、繼續(xù)飼養(yǎng)將步驟c經(jīng)侵染后的幼蟲繼續(xù)飼養(yǎng)至僵化，經(jīng)低溫4 8°C，光照處理，長(zhǎng) 出子實(shí)體，直至子實(shí)體抽生到3 5厘米長(zhǎng)度，收獲，干燥處理，即得冬蟲夏草。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于步驟a所述的制 備菌體、孢子的混懸液的方法，包括下列步驟①，取保藏號(hào)為CCTCC No. M87101 的中國(guó)被毛孢Hirsutella Sinensis Liu,Guo, Yu et Zeng.依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌液；②，將所得菌液中的菌絲體搗碎，用50-100目濾網(wǎng)濾過，濾液即為菌體和孢子的混懸 液，所述混懸液至少含有IO3個(gè)/ml孢子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于步驟①所述的斜 面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基每IOOOml中含有碳源20g 50g,氮源IOg 45g，磷酸二氫鉀1. Og,硫酸鎂0. 5g，水IOOOml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述的碳源為葡 萄糖、蔗糖或者葡萄糖和蔗糖；所述的氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、蠶蛹粉中的一種或者 兩種以上的配合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于步驟b中所述蛹 的養(yǎng)護(hù)和羽化溫度為10-18°C，相對(duì)濕度為70-95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于步驟b中所述蛹 的養(yǎng)護(hù)過程采用養(yǎng)護(hù)床，所述養(yǎng)護(hù)床為透氣隔離裝置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟b中所述交尾過程采用交 尾帳，其由網(wǎng)眼布制成，體積為IM3 6M3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟c中的 針狀器具是一端直徑小于0. 2mm的不銹鋼實(shí)心針或空心針。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述的步驟c中 刺中蝠蛾幼蟲的部位為蝠蛾幼蟲尾部背線或近尾部背線。
全文摘要
一種全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法，本發(fā)明涉及冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)方法，包括下列步驟a，中國(guó)被毛孢混懸液的制備；b，寄主昆蟲的采集、繁殖和飼養(yǎng)；c，侵染取步驟b得到的蝠蛾幼蟲，用一端直徑小于0.2mm的針狀器具沾取步驟a的混懸液刺中蝠蛾幼蟲完成侵染；d，繼續(xù)飼養(yǎng)。本發(fā)明提供的方法可以降低蝠蛾蛹的不當(dāng)死亡率，提高蝠蛾蛹的羽化率；提高蝠蛾的交尾率；大幅度的提高中國(guó)被毛孢對(duì)寄主蝠蛾幼蟲的侵染率，實(shí)現(xiàn)全人工冬蟲夏草的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102106235SQ201010604460
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者王梅平 申請(qǐng)人:王梅平