專利名稱：BGIos228基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，特別是涉 及BGIOS228基因，及其促進(jìn)植物、特別是單子葉 植物快速分化出苗的用途。
背景技術(shù)：
水稻是世界上食用人口最多、歷史最悠久的農(nóng)作物。全球25億以上的人口主食大 米。近半個(gè)世紀(jì)來，“綠色革命”的稻作科技進(jìn)步促進(jìn)了亞洲乃至世界糧食生產(chǎn)的大幅度增 長(zhǎng)，大大提高了亞洲主要產(chǎn)稻國(guó)的稻米生產(chǎn)能力，為這些國(guó)家的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和社會(huì)穩(wěn)定、緩和 人口增長(zhǎng)對(duì)糧食、資源、環(huán)境壓力起著重要的作用。但由于稻屬種質(zhì)資源的有限性和常規(guī)育 種方法在時(shí)間，空間等多方面的局限性，制約了水稻進(jìn)一步的遺傳改良。隨著水稻基因組 測(cè)序工作的完成，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展，水稻作為單子葉模式植物來研 究，其基因的分離、克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)已日益成熟，許多具有重要農(nóng)藝性狀的外源基因已被 導(dǎo)入到水禾S基因組中(Gahakwa D et al.，Transgenic rice as a system to study the stability of transgene expression multiple heterologus transgenes show similar behavior in diverse genetic backgrounds. Thero Appl Genet，2000，101 :388_399 ；項(xiàng)友 斌，梁竹青，高明尉等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘇云金桿菌抗蟲基因cryIAb和cryIAc在水稻中的遺 傳轉(zhuǎn)化及蛋白表達(dá).生物工程學(xué)報(bào)，1999，15 (4) :494-500;翟文學(xué)等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)將白葉 枯病抗性基因Xa21轉(zhuǎn)入我國(guó)的5個(gè)水稻品種，中國(guó)科學(xué)，2000，30 (2) :200_206)，遺傳轉(zhuǎn)化 成為水稻遺傳改良的一種有效手段。新一代測(cè)序技術(shù)(如SoleXa、Solid測(cè)序儀)的出現(xiàn)，為廉價(jià)高效地獲得水稻性狀 相關(guān)基因和基因家族提供了前所未有的機(jī)會(huì)，利用水稻野生與栽培的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)和 技術(shù)，能夠比較各栽培種及其野生種基因組結(jié)構(gòu)的異同，運(yùn)用進(jìn)化基因組學(xué)的理論和方法， 使獲得性狀相關(guān)的基因或基因組功能元件成為可能。研究水稻分化出苗基因有助于水稻育種，比如根據(jù)氣候，根據(jù)水稻分化出苗的時(shí) 間來推算適宜水稻種植的時(shí)間，可以減免自然災(zāi)害的不利影響。但目前未見從事水稻分化 出苗相關(guān)基因的研究。因此尚需進(jìn)一步研究并獲得植物分化相關(guān)基因，以提高植物分化出 苗效率、縮短分化時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以水稻愈傷分化出苗過程相關(guān)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)，通 過基因的遺傳轉(zhuǎn)化，挖掘分化出苗快的相關(guān)基因，并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所述基因具有促進(jìn)植物 快速分化出苗的功能。具體地，本發(fā)明包括以下幾方面本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種具有促進(jìn)植物快速分化出苗功能的核苷酸序列，所述 核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，即BGIos228基因，所述基因的序列如下ATGTCCGCCGCCGCGGTCACCGCCACGCCGCGCCACGCCCGGCCGTCTCCTCTCAACCCGAACGCCAGGGCCGCGGCGGCGGCGGCCGCCGCGGCGCCGCCGAACGCCGTGTCCACCACCAGGACGCACCTCGCCAACCTCGACCG CCTCCTCGTCCGGCCGCCGCCGCTCCCCCTGCCGCTCCAGAACAAGGGGGCGCCGCCGGCCGATGACCTCGGCGACG GCGGCGGCGCCGCCACCACCGACGACCGGAGCGGCCGCTGCGGGCTGCTCAACGCGCTCAACCTGTCCACGTTCCTG CCCTTCGTCCGCAAGCCGGCCGTCGACGAGATGTCGCCGCGCAGCCTCGCGCACCTGCAGCGCCTCCTCACGCTGTC GCCGCGGCCCTCGCCGAAAGGCTCCATCGCCGGCGAGTGGCGGAGGTATCACAGCGAGGGCGGCTGGGACGGGCTGC TCGACCCGCTCGACCAGAACCTCCGCCGCGAGGTCCTCCGCTACGGCGACTTCGTGCAGGCCGCGTACACGGCGTTC CACTCCATGCCGTCG TCGTCGTCGGCGGCGGCGTCGCAGCACAGCCAGCACCGGACGCTCGTGCTCCCCGACCGGTC GTACCGGCCGACGCGCAGCCTGTTCGCCACGTCGTCGCTGTCCATCCCGGCGTGGGCGCGGCGGCGGTCGGCGCCCG GGTGGCTCACGCAGCGCTCCAGCTTCGTCGGCTACGTCGCCGTCTGCGACAACGAGGGCGAGGTCCAGCGCATGGGC CGCCGGGACATCGCCATCGTCCTGCGCGGCACGGCGACGTGCCCCGAGTGGGCGGAGAACCTCCGCGCCGGCCTCGT GCCGGTCGACGACGACGACGACGACGACGTCGGCTCGCCGCAGAACGCGCCGAAGGTGGCGAAGGGGTTCTTGAGCC TGTACAAGACGGCCGGCGACCACGTCCCCAGCCTCTCCGACGCCATAGTCGACGAGGTGAGGCGCCTCGTCGAGGTC TTCGAGGGGGAGGAGCTGAGCATCACGGTGGTGGGACACAGCCTCGGCGCGTCGCTCGCCGTCCTCGCCGCCGACGA GCTCAGCGCTTGCCTGTCCGCGGACGTGGCTGAACATCGCCGGCGGCCACCGCCGATCGCCGTGGTGTCCTTCGGCG GCCCGAAGACCGGGAACCGCGCGTTCGCCGACCGCCTCCAGAACGGCCGCGGCGTGAACGTGCTCCGCGTGGTGAAC GCCGGCGACGTGGTGACGCGGGTGCCGGCGCCGGCGATGGCGCGGGAGGGGGAGGGGCACGTGCACGCCGGCGCGGA GCTGAGGCTGGACAGCCGCGACTCGCCGTGCCTCCGCCCGGACGCCGGGCCGGCGTGCTGCCACGACCTGGAGGCGT ACCTCCACCTGCTCGACGGCTTCGCCGGCTCCGGCCGGCCGTTCCGCGCCGACGCGAGCCGCAGCGTGGCGCGGCTG CTGACCTACCAGCGTCCCAACGTGAGGGGCGCCTACGTCGAGCGCGCCAGGGTGCTCGGCTTCGAGCCGGCGACGCC GCGGACCGCCACCGCCAACGGCGCCGGCGGCGGAGCCGAGGGGCATTACGGCTACTTGGCTAGCCCAACATGA(SEQ ID NO 1)本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO 1所示序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或其具有促進(jìn)植物快 速分化出苗功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性 程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典 型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10°C;“中等 嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替 代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗 滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性； 0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一 或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。 為便于說明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物分化出苗活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20個(gè)，或者不超 過4-15個(gè)，或者不超過5-10個(gè)，或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 促植物分化出苗活性。通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的參考核苷酸序列之每100個(gè) 核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核 苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些 核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參 考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間 的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參 考序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可 以通過國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本 文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物分化出苗活性。
在本發(fā)明中，所述的BGIos228基因來源于普通野生稻元江(其種子于2010年9 月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC P201011)。本發(fā)明的另一方面涉及一種載體，其特征在于，所述載體含有本發(fā)明所述的核苷 酸序列，所述載體可以通過例如將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達(dá)載體而得到，或者 可以通過人工合成得到。本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其特征在于所述重組載體含有本發(fā)明所述 的核苷酸序列，所述重組載體可以通過將上述核苷酸序列插入克隆載體或表達(dá)載體而得 到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體為p6+BGIos228載體。本發(fā)明的另一方面涉及一種含有本發(fā)明所述載體的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞可以 通過將含有本發(fā)明所述的載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-p6+BGIos228。本發(fā)明的還一方面涉及一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn) 化有本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或感染有本發(fā)明的重組細(xì)胞。本發(fā)明的還一方面涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有本 發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或感染本發(fā)明的重組細(xì)胞。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體和/或重組細(xì)胞用于促進(jìn) 植物快速分化出苗的用途，以及用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種 的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種促進(jìn)植物快速分化出苗的方法，所述方法包括將本發(fā) 明的核苷酸序列和/ 或載體轉(zhuǎn)化入植物，或用本發(fā)明的重組細(xì)胞感染植物。所述方法包括用本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明核苷酸序列的重 組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了前述 的重組農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS228。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單子葉植物的 愈傷組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng) 桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周 知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技 術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達(dá)單元的植株。本發(fā)明的還一方面涉及一種產(chǎn)生快速分化出苗的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包 括以下步驟1)將本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用本發(fā)明的重組細(xì) 胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物。 在本發(fā)明中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，所述單子葉植物包括但不限于水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、臺(tái) 北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu) 128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公 司)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明中，所述促進(jìn)植物快速分化出苗是指加快了植物從種子到發(fā)芽、出苗的 時(shí)間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明人從水稻元江中擴(kuò)增得到基因BGIos228，將該 基因重組入新構(gòu)建的p6載體中得到含有該基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，利用重 組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，通過水稻愈傷組織的GUS染色、轉(zhuǎn)基因小苗根、葉GUS染色 及轉(zhuǎn)基因小苗分化出苗的性狀觀察，并與未轉(zhuǎn)入BGIos228基因的組織或植物相比，證明 BGIos228基因能夠促進(jìn)植物快速分化出苗。發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用高通量測(cè)序技術(shù)，通過基因的遺傳轉(zhuǎn)化，挖掘出分化出苗快的相關(guān)基 因BGIos228，所述基因能夠縮短分化時(shí)間，促進(jìn)植物快速分化出苗，同時(shí)為其他物種在分化 難和分化慢上提供了研究基礎(chǔ)。關(guān)于牛物材料保藏的說明本發(fā)明涉及以下生物材料普通野生稻元江種子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC P201011。


圖1ρ6載體示意圖。圖2經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的⑶S染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述BGIos228 基因的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS228轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(右)經(jīng)⑶S染色后呈 現(xiàn)藍(lán)色；陰性對(duì)照(左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖3經(jīng)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的根的⑶S染色結(jié)果。其中，經(jīng)含有p6+BGIos228重 組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(圖3右)、經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，陰性對(duì)照(圖 3左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖4經(jīng)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻苗的葉的⑶S染色結(jié)果。其中，經(jīng)含有p6+BGIos228重組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉(圖4右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，陰性對(duì)照(圖 4左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖5含有p6+BGIos228重組載體愈傷組織的分化出苗結(jié)果。其中，陰性對(duì)照愈傷 組織的分化出苗時(shí)間晚，出苗慢(圖5左)，含有BGIos228基因的愈傷組織，其分化出苗時(shí) 間比對(duì)照早，出苗快(圖5右)
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 :BGIos228基因的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+BGIos228重組載體的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號(hào)DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)的基因組DNA (gDNA)， 根據(jù)該基因在gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1，力口 限制性酶切位點(diǎn)BamHI和保護(hù)堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn)Xba I和保護(hù)堿基)。 以上述提取的元江的gDNA為模板，高保真Ex Taq(TaKaRa,DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 如表1所示。表1目的基因擴(kuò)增的PCR體系_組成體積(μ )_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)210 X Ex Buffer (含鎂離子)2. 5引物 Fl (50 μ Μ)1引物 Rl (50 μ Μ)1Ex taq0. 2ddH20補(bǔ)充至總體積25 μ 1_PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸90s，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min。其中，上游引物Fl :CGCGGATCC AGTGCACTGTCTGTGCGTT(SEQ ID NO 2)；下游引物 Ri :TGCTCTAGA TGTTGGGCTAGCCAAGTAG(SEQ ID NO :3)。帶下劃線部分分別表示 BamHI 和 XbaI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小約1600bp左右的條帶，使用 TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)進(jìn)行純化回收。pMD18-T+BGIos228 重組載體的構(gòu)建
將上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，挑取陽性克隆測(cè)序，證明準(zhǔn)確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12氺solution I5μ 1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(回收插入片段)10-20ng，根據(jù)其濃度定ddH20補(bǔ)齊至 10 μ 1于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 pMD18-T+BGIos228重組載體。將經(jīng)過上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯化 鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞100μ 1 DH5a (中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從例 如上海生工購得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+BGIos228 重組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預(yù)冷的SOC培 養(yǎng)基(具體配方詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C 220rpm復(fù)蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物，輕輕吹 勻，玻璃珠涂布LB(加卡那霉素，Kan)平板(具體配方詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版， 科學(xué)出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16-24h。獲得含有pMD18-T+BGIos228克隆載體的重組大腸桿 菌，命名為DH5a-BGIos228。深圳華大基因科技有限公司對(duì)pMD18_T+BGIos228克隆載體中 的BGIos228進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO=I的結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的pMD18_T+BGIos228克隆載體中BGIos228基因序列正確。實(shí)施例2 :p6重組載體的構(gòu)建1)玉米Ubiquitin啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+Ubi重組載體的構(gòu)建Ubi啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目 錄號(hào)DP320-02)提取玉米品種 B73(Zea mays mays cv. B73)的基因組 DNA (http://www. maizegdb. org/)，根據(jù)該啟動(dòng)子在玉米B73gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性 擴(kuò)增引物(上游引物F2 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT (SEQ ID NO :4)，加限制性酶切位 點(diǎn)Pst I和保護(hù)堿基，下游引物R2 :GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO :5)，加限制性酶 切位點(diǎn)Pst I和保護(hù)堿基)。以上述提取的玉米B73的gDNA為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表2所示。表2 Ubi啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系_組成體積(μ )_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)210 X Ex Buffer (含鎂離子)2. 5引物 F2(50yM)1
引物 R2 (50 μ Μ)1Ex taq0. 2ddH20補(bǔ)齊至 25 μ 1_
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55退火50s，72°C延伸 90s，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)純化回收。pMD18~T+Ubi重組載體的構(gòu)津?qū)⑸鲜龅玫降腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，挑取陽性克隆由深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，證明準(zhǔn)確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I 5μ 1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10-20ng，根據(jù)其濃度定ddH20補(bǔ)齊至 10 μ 1于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 pMD18-T+Ubi重組載體。將經(jīng)過上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯 化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞100μ 1 DH5a (中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從 例如上海生工購得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+Ubi重 組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C預(yù)冷的SOC培養(yǎng) 基(具體配方詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C 220rpm復(fù)蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重懸沉淀后的混合物，輕輕 吹勻，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板(具體配方詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué) 出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16-24h。獲得含有pMD18-T+Ubi克隆載體的重組大腸桿菌，命名為 DH5a -Ubi02)pCAMBIA-1301+Ubi 重組載體的構(gòu)建按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊(cè)，從步驟1)構(gòu) 建的轉(zhuǎn)化有啟動(dòng)子Ubi的大腸桿菌DH5d-Ubi中提取帶有玉米Ubi啟動(dòng)子序列的克隆載體 pMD18-T+Ubi ；純化后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶Pst I (NEB)進(jìn)行酶切，然后用TIANGEN瓊脂糖 凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)回收相應(yīng)的啟動(dòng)子片段。同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301質(zhì)粒(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究 所董楊提供；或者可從例如上海國(guó)瑞基因科技有限公司購得)并回收。酶切體系50 μ 1ddH2034. 9 μ 1IOXbuffer 35μ 1Pst I0. 1 μ I(IOU)
克隆載體pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 質(zhì)粒 10 μ 1 ( < IOOOng)將回收的啟動(dòng)子片段Ubi與回收的載體片段根據(jù)T4連接酶(TaKaRa，D2011A)操 作說明，按照如下條件進(jìn)行連接連接體系10 μ 110ΧΤ4 buffer1 μ 1回收的 pCAMBIA-1301 質(zhì)粒1 μ 1 (20ng)回收的 啟動(dòng)子Ubi插入片段10-20ng，根據(jù)其濃度定ddH20補(bǔ)齊至 9. 5μ1Τ4 ligase (TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1于16°C節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上。將100 μ 1氯化鈣法制得的感受態(tài)細(xì)胞DH5 α從超低溫冰箱取出，冰上融化后，力口 入10 μ 1上面的連接產(chǎn)物，輕輕攪勻，冰浴3011^11，421熱激608，冰浴51^11，加入60(^1 4°C預(yù)冷的S0C，37°C下220rpm復(fù)蘇45min，8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，輕輕吹 勻，玻璃珠涂布LB(Kan)，37 °C倒置培養(yǎng)16_24h。得到重組載體pCAMB IA-1301+Ub i。分別以步驟1)中的F2和R2為引物對(duì)所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以確證所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需啟動(dòng)子Ubi0 3) NOS終止子的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+N0S重組載體的構(gòu)建根據(jù)pCAMBIA-1301質(zhì)粒中NOS終止子的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò) 增引物(上游引物 F3 GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA (SEQ ID NO 6),加限制性酶切位 點(diǎn) Sac I 和保護(hù)堿基，下游引物 R3 GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT (SEQ ID NO 7)，加限 制性酶切位點(diǎn)EcoR I和保護(hù)堿基)。以上述提取的pCAMBIA-1301質(zhì)粒為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表3所示。表3 NOS終止子的PCR擴(kuò)增體系_組成體積(μ )_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)2IOXEx Buffer (含鎂離子) 2.5引物 F3(50yM)1引物 R3 (50 μ Μ)1Extaq0.2ddH20補(bǔ)齊至 25 μ 1_將上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Τ/Α克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，獲得含有PMD18-T+N0S克隆載體的重組大腸桿菌，命名為DH5 α -NOS0挑取陽性克 隆由深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，證明準(zhǔn)確。4) pCAMB IA-1301+Ubi+NOS 即 p6 重組載體的構(gòu)建按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊(cè)，提取步驟3構(gòu)建的克隆載體PMD18-T+N0S ；純化后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶Sac I (NEB)和EcoR I (NEB) 進(jìn)行酶切，然后用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)回收相應(yīng)的NOS 終止子片段。同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi質(zhì)粒并回收。酶切體系50 μ 1
ddH2034. 9 μ 1IOXbuffer 15μ 1Sac I0. 1 μ I(IOU)EcoR I0. 1 μ 1 (IOU)載體 pMD18_T+N0S 或 pCAMBIA-1301+Ubi 質(zhì)粒 10 μ 1 ( < IOOOng)將回收的終止子片段NOS與回收的載體片段用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞DH5 α得到重組載體pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6 (參見圖1)。實(shí)施例3 :p6+BGIos228重組載體的構(gòu)建提取pMD18_T+BGIos228質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶BamHI/Xbal酶切后回收 BGIos228基因片段，同時(shí)提取p6質(zhì)粒，并用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶BamHI/Xbal酶切后回收大 片段，將回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α得到重組載體p6+BGIos228。篩選 陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)后測(cè)序確定。實(shí)施例4 重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIos228細(xì)胞的制備將如實(shí)施例3所述方法構(gòu)建的p6+BGIos228重組載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化按照《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)中所述氯化鈣方法制備的根癌農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì) 胞，具體方法如下將根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感受態(tài)細(xì)胞EHA105 (根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105 已在申請(qǐng)?zhí)枮?200910238992. O、發(fā)明名稱為“一種 啟動(dòng)子BgIosP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開， 保藏編號(hào)為CCTCC M 209315)于超低溫冰箱中取出，至于冰上解凍。融化后，加入5μ1的 p6+BGIos228重組載體，輕輕混勻，冰浴lOmin，放入液氮中冷凍5min，37°C解凍5min，加 入800 μ 1常溫的LB液體培養(yǎng)基，28°C 160rpm復(fù)蘇3h，8000rpm離心30s，吸去上清，留下 200 μ 1吹勻，涂布于加有kan-rif (卡那霉素-利福平)雙抗的YM培養(yǎng)基平板上(50mg/l Kan, 10mg/l Rif，具體配方參見表4)。28°C倒置培養(yǎng)2_3天。以Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)和通過BamHI/Xba I酶切篩選轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增 并酶切出約1600bp左右條帶的為含有重組載體p6+BGIos228的重組根癌農(nóng)桿菌。本發(fā)明中，按照如上述方法得到的帶有重組載體p6+BGIos228的重組農(nóng)桿菌，命 名為重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS228 ；同時(shí)設(shè)立帶有空載體p6的重組根癌農(nóng)桿菌，即 EHA105-p6作為本發(fā)明的陰性對(duì)照，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例5 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化按照如下步驟誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS228 轉(zhuǎn)化所述愈傷組織。1)將水稻日本晴種子(已在申請(qǐng)?zhí)枮?00910238992. 0、發(fā)明名稱為“一種啟動(dòng)子 BgIosP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開，保藏編號(hào)為 CCTCC P200910)去殼，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1. 5%的次氯酸鈉消毒30min，期間劇烈搖動(dòng)，消毒后用滅菌水清洗5次；將消毒后的種子置于N6D培養(yǎng)基(具體配方參見 表4)上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培養(yǎng)3-4周；2)選取活躍生長(zhǎng)的愈傷組織(黃白色，干燥，直徑l_3mm)，在新N6D培養(yǎng)基上 29. 5°C光照培養(yǎng)3天；3)分別挑取如實(shí)施例4所構(gòu)建的重組根癌農(nóng)桿菌單菌落(重組根癌農(nóng)桿菌 EHA105-p6+BGIos228)，于添加抗生素(50mg/l Kan，1 Omg/IRif)的YM培養(yǎng)基(具體配方參 見表5、表6)上劃線培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度28V ；分別刮取上述重組根癌農(nóng)桿菌置于添加了 30 μ 1 IOOmM的AS (Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培養(yǎng)基(具體配方參見表 7)中，溫和重懸所述重組根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞EHA105-p6+BGIos228 ；4)將繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于滅菌培養(yǎng)皿中；將如步驟4制備的重組根癌農(nóng)桿菌 懸液倒入培養(yǎng)皿中，將愈傷組織浸入其中15min ；5)倒掉重組根癌農(nóng)桿菌懸液，將愈傷組織用滅菌吸水紙吸掉多余的液體；于 N6-AS培養(yǎng)基(配方參見表8)上放一張滅菌濾紙，加Iml如上述含AS的AAM培養(yǎng)基，將愈 傷組織轉(zhuǎn)移至濾紙上；密封培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)48-60h ；6)將受感染的愈傷組織置于50ml滅菌管中，用滅菌水搖動(dòng)清洗，直至上清 液變 澄清；將愈傷組織浸泡于含500mg/l羧芐青霉素(Carb)的無菌水中以殺死重組根癌農(nóng)桿 菌；用滅菌吸水紙除去愈傷組織上多余的水分，然后將其轉(zhuǎn)移至含lmg/1潮霉素B (HmB)和 50mg/l Carb的N6-AS培養(yǎng)基上；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3_4周。實(shí)施例6 水稻愈傷組織中的⑶S的表達(dá)為檢測(cè)經(jīng)過實(shí)施例5所述轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織中目的基因⑶S的表達(dá)情況，按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742_751 所述的方 法，對(duì)用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS228轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織進(jìn)行染色。GUS 染色液的配方(Iml) :610μ1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(ρΗ = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc。將用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIoS228轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織浸泡在⑶S染色 液中，37°C保溫至出現(xiàn)藍(lán)色，拍照記錄，結(jié)果如圖2所示，含有p6+BGIos228重組載體的根癌 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(圖2右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，陰性對(duì)照(圖2左)經(jīng)⑶S 染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯示，本發(fā)明p6+BGIos228已轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因水稻苗中⑶S的表達(dá)將實(shí)施例5中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培養(yǎng) 基(具體配方見表9)分化苗；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3-4周；待幼苗長(zhǎng)至 3-4cm時(shí)轉(zhuǎn)移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培養(yǎng)基(具體配方參見表10)進(jìn)行 生根篩選。轉(zhuǎn)基因水稻苗的GUS染色過程同實(shí)施例6中愈傷組織的染色過程。結(jié)果如圖3、 圖4所示，經(jīng)含有p6+BGIos228重組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根(圖3右)、 葉(圖4右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，陰性對(duì)照(圖3左、圖4左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變 化。結(jié)果顯示，本發(fā)明p6+BGIos228轉(zhuǎn)入水稻苗中。實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因小苗的性狀觀察將實(shí)施例5制備的經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織和對(duì)照愈傷組織轉(zhuǎn)移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培養(yǎng)基分化苗；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)20天；性 狀觀察了 36株，其中31株轉(zhuǎn)化了 BGIos228基因的愈傷組織出苗快(圖5右)，沒有轉(zhuǎn)入 BGIos228基因的陰性對(duì)照愈傷組織出苗慢(圖5左)。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的相關(guān)培養(yǎng)基配方說明如下以下有關(guān)培養(yǎng)基中所稱的“常規(guī)滅菌”是指如下條件的滅菌121°C下蒸氣滅菌 20mino表4 N6D培養(yǎng)基
L 2
L 5
O^
L 1
N6macro 母液(20X)50 ml25 ml100 mlFe2EDTA 貯存液(IOOX )10 ml5 ml20 mlN6Iiiicro 母液(1 000X)1 ml0. 5 ml2 mlN6維生素貯存液(1000X)1 ml0. 5 ml2 ml肌醇(500X)2 ml1 ml4 ml2, 4-D 貯存液(1 mg/ml )2 ml1 ml4 ml脯氨酸(Proline)2. 88 g1.44 g5. 76 g水解酪蛋白(CH)0. 30 g0. 15 g0. 6 g篇糖(sucrose )30 g15 g60 g植物凝膠(Phytagel )3 g1.5 g6 g用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8，封口后按常規(guī)方法滅菌。N6 macro母液(20X)硝酸鉀56. 60g,磷酸二氫鉀8. OOg,硫酸銨9. 26g，硫酸鎂 3. 70g，氯化鈣3. 32g，蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。N6 micro 母液(1000X)碘化鉀 0. 80g，硼酸 1. 60g，硫酸錳 3. 33g，硫酸鋅 1. 50g， 蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)將3. 73g 乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20)和 2. 78g FeSO4. 7H20分別溶解，混合并用。用蒸餾水定容至1000ml，70°C溫浴2h，冷卻后4°C 保存不超過1個(gè)月。N6維生素貯存液(1000X)維生素B1 0. 10g，維生素B6 0. 05g，煙酸0. 05g，甘氨酸 0. 20g，加蒸餾水定容至100ml，過濾除菌，4°C保存不超過1周。表5YM 液體培養(yǎng)基(含有 50mg/L Kan, 10mg/L Rif)
1 L0. 5 LYM Broth 干粉21 g10. 5 g常規(guī)滅菌，冷卻至室溫后加入卡那霉素(Kan) ( 50rag/ral)1 ml0. 5 ml利福平(Rif) ( 50rag/ml )0. 2 ml0. 1 ml表 6YM 固體培養(yǎng)基(含有 50mg/L Kan，10mg/L Rif)
權(quán)利要求
1.一種具有促進(jìn)植物快速分化出苗功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列，或其具有促進(jìn)植物快速分化出苗功能 的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQID NO :1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的 核苷酸序列，和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，例如所述載體 為 p6+BGIos2^ 載體。
3.一種含有權(quán)利要求2所述載體的重組細(xì)胞，例如所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌 EHA105-p6+BGIos228o
4.一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1的核苷酸 序列和/或權(quán)利要求2的載體和/或感染有權(quán)利要求3的重組細(xì)胞；具體地，所述單子葉植 物為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米；更具體地，所述單子葉植物為水稻，例如為日本晴。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1的核苷酸序列和 /或權(quán)利要求2的載體和/或感染有權(quán)利要求3的重組細(xì)胞；具體地，所述植物為單子葉植 物，特別是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米；更具體地，所述單子葉植物為水稻，例如為日本晴。
6.權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求2的載體和/或權(quán)利要求3的重組細(xì)胞用 于促進(jìn)植物快速分化出苗的用途；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、 高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
7.權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求2的載體和/或權(quán)利要求3的重組細(xì)胞用 于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷 子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
8.權(quán)利要求4的愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途；所述植物優(yōu)選 是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
9.一種促進(jìn)植物快速分化出苗的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1的核苷酸序列和/ 或權(quán)利要求2的載體轉(zhuǎn)化入植物，或用權(quán)利要求3的重組細(xì)胞感染植物；所述植物優(yōu)選是單 子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻，例如為日本晴。
10.一種產(chǎn)生快速分化出苗的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將權(quán)利要求1的核苷酸序列和/或權(quán)利要求2的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用權(quán) 利要求3的重組細(xì)胞感染植物愈傷組織；2)利用所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻， 例如為日本晴。
全文摘要
本發(fā)明涉及BGIos228基因及其用途。本發(fā)明的BGIos228基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有促進(jìn)植物快速分化出苗功能的變體。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化有BGIos228基因或其變體的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及所述BGIos228基因或其變體用于促進(jìn)植物快速分化出苗的用途以及促進(jìn)植物快速分化出苗的方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102127534SQ20101056574
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者張豐豐, 張耕耘, 束禮平, 蔡雪梅 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司