專利名稱：蘇云金芽孢桿菌cry8Nal基因,表達(dá)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是進(jìn)一步，本發(fā)明涉及對鞘翅目害蟲具有高 毒力的Bt CrySNal基因及由該基因所編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏 陽性細(xì)菌，是一種對害蟲毒力強(qiáng)且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒 性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有 活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775_806.]。自 1981 年 Schn印f 等克隆了 Bt 的第一個 ICPs 基 因，并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前(2010年7 月)已發(fā)現(xiàn)種殺蟲晶體蛋白530種，被分為67類cry蛋白和2類cyt蛋白。當(dāng)今，采用噴 施化學(xué)農(nóng)藥防治手段固然可以減輕害蟲對農(nóng)作物的為害，但化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，長期 以來，大量噴施化學(xué)殺蟲劑，不僅會增強(qiáng)害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞， 而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲 效果好、安全、高效等優(yōu)點而被廣泛的應(yīng)用于蟲害防治。蘇云金芽胞桿菌除了直接作為生 物農(nóng)藥以外，1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在美國獲準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來自Bt crylAc。在接下來的幾年里，轉(zhuǎn)cryIAb基因的抗蟲玉米，轉(zhuǎn)cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距 問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有cry lAc/cry IAb基因的抗蟲棉以來，已經(jīng)被普遍 種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個12年(1996-2007)中，由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益， 農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年增加。2009年，25個國家種植了 1.34億公頃的轉(zhuǎn)基因作物，比 2008年增長了 %。美國仍然是最大的生物技術(shù)作物種植國，種植面積為6400萬公頃，中 國，370萬公頃。第一個12年，轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化給工業(yè)化國家和發(fā)展中國家的農(nóng)民都帶來 了經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。蘇云金芽胞桿菌及其基因發(fā)掘已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中重要課題。蘇云金芽胞桿菌cry8類基因?qū)瘕斪涌啤⑾蠹卓?、葉甲科等多種鞘翅目害蟲 具有特異的殺蟲活性。cry8類基因由1160-1210個氨基酸組成，分子量在128-137kDa 之間。1992年，Ohba等人首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的 新菌株(B. thuringiensis subsp. japonensis BuiBui)(Ohba Μ. , Iwahana H. , Asano S. , Sato R. and Hori H. . A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeidbeetles, Letters in Applied Microbiology 1992，14 :54 57)，該菌株主要對赤銅麗金龜、日 本金龜子等麗金龜科的害蟲有毒殺作用。1994年，Hori等證明菌株的毒性來自細(xì)菌內(nèi) 的130kDa的蛋白質(zhì)，Sato等從中克隆了一種新的殺蟲基因cry8Cal (Sato R.，TakeuchiK.，Ogiwara K.，Masayosi Minami，Kaji Y.，Suzuki N.，Hor H. i，Asan S. 0，Ohba Μ. and Iwahana H. . Cloning, heterologous expression, and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensisserovar japonensis strain Buibui toxic to Scarabaeid insects. Current Microbiology 1994，28 :11 15)，該 基因已經(jīng)用于生物殺蟲劑的開發(fā)。由于cry8類基因具有很大的潛在應(yīng)用價值，大多數(shù) 基因都已經(jīng)申請專利，美國Mycogen公司分離的cry8Aal和cry8Bal對金龜科的多種害 蟲具有明顯的殺蟲活性；美國杜邦公司克隆的crySBbl、crySBcl基因?qū)ξ鞣接衩赘~甲 (ffesterncorn rootworm)具有顯著殺蟲效果(Abad, Andre, R. , Duck Nicholas, B. , Feng, Xiang, FlannaganRonald, D. , Kahn, Theodore, W. , Sims, Lynne,Ε. . Genes encoding novel proteins with pesticidalactivity against Coleopterans. 2002, WO 02/34774A2),并 已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的開發(fā)；日本Asano等克隆的cry8Dal、cry8Da2和cry8Da3也已 在日本申請專禾丨J (Asano S. , Yamashita C. , Iizuka Τ. , Takeuchi K. , Yamanaka S. , Cerf D. and Τ. Yamamoto. . A strain of Bacillus thuringiensissubsp. Galleriae containing a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea(Coleoptera :Scarabaeidae). Biological Control 2003，28 :191 196)。目前，我國河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究 所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)近年來先后篩選獲得多株對黃褐麗金龜(Anomala exoleta)和銅綠麗金 龜(A. corpulenta)幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株(馮書亮等.一株對金龜子類幼蟲具 有殺蟲活性的蘇云金桿菌新分離株.中國生物防治，2000，16 (2) :74 78)。2006年，中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所發(fā)現(xiàn)了對暗黑鰓金龜具有殺蟲活性的第一株Bt菌株Btl85，隨 后他們克隆了分別對暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)和大黑鰓金龜(Holotrichia obIita)有特異的殺蟲活性的 cry8EaU cry8Fal (Yu H.，Zhang J.，Huang D.，Gao J. and Song F. . Characterization ofBacillus thuringiensis strain Btl85 toxic to the Asian cockchafer :Holotrichia parallela. CurrentMicrobiology 2006,53:13 17。 Shu C. ,Yu H. , Wang R. , Fen S. ,Su X. , Huang D. , Zhang J. , Song F. . Characterization of two novel cry8 genes from Bacillus thuringiensis strain BT185. Current Microbiology 2009，58 (4) :389_92.)和 cry8Gal 基因(Shu C. L.，Yan G. X.，Wang R. Y.， ZhangJ. , Feng S. L. , Huang D. F. , Song F. P. . Characterization of first cry8 gene specific to Melolonthidaepests :Holotrichia oblita and Holotrichia parallela. Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. 3. 17)。目前，全球克隆的 cry8 類基因 已有33種。由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的 基因組合來避免害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因， 可以豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 的抗蟲效果，并且可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重 要的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種對金龜甲科害蟲暗黑鰓金龜高毒力蘇云金芽胞桿菌Q52-7，及其
4殺蟲新基因crySNal基因和其晶體殺蟲蛋白，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對 相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52-7，其保藏編號為CGMCC No. 4188。蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52-7在殺滅鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。一種從蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52-7中分離得到的crySNal基因，其核苷酸序列 如SEQ IDNOl所示。編碼該基因的殺蟲蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。一種表達(dá)載體，其特征是含有上述基因。所述表達(dá)載體為pEB 8，其骨架載體為pEB，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。一種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有上述基因。上述基因在抗鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是將該基因表達(dá)的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分。所述應(yīng)用是將該基因轉(zhuǎn)入到微生物或植物，使之表達(dá)對鞘翅目的毒性蛋白。本發(fā)明從遼寧千山圓通觀附近土壤中分離得到一株蘇云金芽孢桿菌菌株 BTQ52-7，其保藏編號為CGMCC No. 4188，該菌株生物學(xué)特性為在生長周期中可以產(chǎn)生芽胞， 并且同時產(chǎn)生有毒殺鞘翅目害蟲作用的伴胞晶體，其對暗黑鰓金龜具有很強(qiáng)的殺滅能力； 從該菌株中得到一個新基因的陽性克隆，即PEB8(見圖6)，對其進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)克隆 pEB 8中含有3519個堿基，見SEQ ID NOl，編碼1174個氨基酸，見SEQ ID N02。與已發(fā)表 的基因相比，與crySCa相似性最高，相似性為70%，是一個新基因；從上述陽性克隆提取質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)入受體菌，得到表述菌株，測定基因的表達(dá)蛋白的活性，基因crySNal表達(dá)的蛋白對 暗黑鰓金龜?shù)某鹾Y生測結(jié)果為校正死亡率為100%見表1，對華北大黑鰓金龜幼蟲有一定 活性見表2，對鞘翅目害蟲榆藍(lán)葉甲幼蟲和銅綠麗金龜幼蟲無殺蟲活性見表3，表4。crySNal基因可按生物技術(shù)的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化微生物、植物，表現(xiàn)出對相關(guān)鞘翅目害 蟲的毒性。將上述基因轉(zhuǎn)化菌株，表達(dá)得到的蛋白可以制成生物農(nóng)藥用于殺死鞘翅目害蟲。 同時，可以轉(zhuǎn)入植物構(gòu)建抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，用于害蟲的防治。本發(fā)明分離克隆的Bt crySNal基因序列及其基因表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)η食崮亢οx產(chǎn) 生強(qiáng)毒力，特別是對暗黑鰓金龜有高活性，是很好的生物殺蟲基因，有很廣泛的應(yīng)用前景。 通過該cry8Nal基因與crylAb、crylBa、cry2Ab等基因表達(dá)產(chǎn)物組合，可擴(kuò)大對鱗翅目、鞘 翅目害蟲的殺蟲譜。通過應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使它們表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，可克 服或延緩昆蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。菌株保藏信息菌種分類命名蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏日期2010年09月20日保藏編號CGMCCNo. 4188


圖1光學(xué)顯微鏡下觀察菌株BTQ52-7菌體的形態(tài)，
圖2電鏡下菌株BTQ52-7菌體形態(tài)圖3含有目的基因的基因組PCR鑒定，其中1 陰性對照2 菌株BTQ52-7 S5un8/S3un8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M:Marker(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500bp圖4cry8Nal基因全長PCR結(jié)果1 陰性對照 M:Marker(300、500、800、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、 8000、10000bp)2 :cry8類基因全長擴(kuò)增產(chǎn)物圖5cry8Nal基因在大腸桿菌中表達(dá)蛋白的SDS-PAGEM 蛋白高分子量 marker (200，116，97，66，44kDa)l :BTQ52_7 菌株的晶體蛋白 2 PEB8在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白3 :pEB空載體圖6pEB8結(jié)構(gòu)示意圖， 圖7同源性分析圖。
具體實施例方式實施例1、分離得到蘇云金芽孢桿菌菌株BTQ52-7本申請人的實驗室工作人員從遼寧千山圓通觀附近土壤中分離的得到一株蘇云 金芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌的芽孢由外向內(nèi)依次為芽孢外壁、芽孢衣、皮層、芽孢內(nèi)壁，原 生質(zhì)膜和原生質(zhì)體。其中皮層的主要成分是肽聚糖，不含營養(yǎng)細(xì)胞的多聚糖磷壁酸，它保持 著芽孢的脫水狀態(tài)和耐熱性，另一方面，芽孢形成過程中，會產(chǎn)生大量DPA-Ca鰲合物，使 得芽孢中的生物大分子形成耐熱凝膠，在80°C下熱處理20min，蘇云金芽孢桿菌芽孢也不 會死亡并且休眠的芽孢在75°C的亞致死溫度下處理15min，活化效果最好，不但促其快速 萌發(fā)，還可提高芽孢的成活率(喻子牛1990)。依據(jù)這一特性，可實施溫度篩選(Knowles B H, EllarD J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillusthuringiensis d-endotoxins with different specificity[J]. Biochimica et biophysicaacta，1987，924 :509_518.；戴蓮韻，王學(xué)聘等.中國八個自然 保護(hù)區(qū)森林土壤中蘇云金芽孢桿的分布[J].微生物學(xué)報，1994，30 (2) 117-121)。1、1菌株的分離1)取分裝的土樣加入到50ml大離心管中，至錐形管錐形處。2)加滅菌水至15ml處，放入玻璃珠5 10顆。3)用振蕩器將土樣打碎。 4)放入水浴鍋中80°C，20分鐘。5)取1. 5ml的EP管，每個管中加Iml滅菌水，再從50ml管中取10微升菌液加入 到EP管中混勻。6)從EP管中取100微升噴到1/2LB培養(yǎng)基中，涂勻。7)放入到30°C溫箱中培養(yǎng)2 3天。8)鏡檢觀察。晶體觀察光學(xué)顯微鏡將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色3min， 清水沖洗，IOOx油鏡進(jìn)行鏡檢，石炭酸復(fù)紅染液配制方法參見文獻(xiàn)(Baroy F，Lecadet M
6M, Deleluse A. Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridiumbifermentans[J], Gene, 1998,211 :293_295)。見圖 1 所示。在 1/2LB 培養(yǎng)基 上培養(yǎng)48h后形成單菌落，光學(xué)顯微鏡下觀察到菌株BTQ52-7菌體為長桿狀，芽孢為長圓棒 狀，晶體為球形。電鏡顯微觀察掃描電鏡制樣孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，經(jīng)鋨酸固定，而后經(jīng)酒精梯度脫 水，臨界點干燥，離子濺射噴金(2nm厚)，New Bio-TEM H-7500掃描電鏡觀察拍照。如圖2 所示。生物學(xué)測定表明，對暗黑鰓金龜?shù)某鹾Y生測結(jié)果為校正死亡率為100%見表1，對 華北大黑鰓金龜幼蟲有一定的生物活性見表2。對鞘翅目害蟲榆藍(lán)葉甲、銅綠麗金龜無殺蟲 活性。實施例2.獲得新基因2. 1利用cry8類基因通用引物檢測菌株BTQ52-7，引物如下
權(quán)利要求
蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52 7，其保藏編號為CGMCC No.4188。
2.權(quán)利要求1所述的蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52-7在殺滅鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。
3.一種從權(quán)利要求1所述的蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52-7中分離得到的crySNal基 因，其核苷酸序列如SEQ ID N01所示。
4.權(quán)利要求3所述的crySNal基因編碼的殺蟲蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO 2所7J\ o
5.一種表達(dá)載體，其特征是含有權(quán)利要求3所述的cryS類基因。
6.權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體為pEB8，其骨架載體為pEB。
7.—種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有權(quán)利要求3所述的crySNal基因。
8.權(quán)利要求3所述的crySNal基因在抗鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，是將權(quán)利要求3所述的crySNal基因表達(dá)的蛋白作為生物 殺蟲劑的有效成分。
10.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，是將權(quán)利要求3所述的crySNal基因轉(zhuǎn)入到微生物或植 物，使之表達(dá)對鞘翅目的毒性蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及“蘇云金芽孢桿菌cry8Na1基因，表達(dá)蛋白及其應(yīng)用”，屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。蘇云金芽胞桿菌菌株BTQ52-7，其保藏編號為CGMCC No.4188。殺蟲蛋白，具有如SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，優(yōu)選所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。上述基因?qū)η食崮亢οx具有高毒力，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。
文檔編號A01P7/04GK101984045SQ201010295118
公開日2011年3月9日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者劉榮梅, 宋福平, 張 杰, 李海濤, 赫福霞, 高繼國 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)