專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新疆雪蓮細(xì)胞系的超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)涉及一種中藥材新疆雪蓮的種植保存技術(shù)，特別是新疆雪蓮細(xì)胞 系的超低溫冷凍保存技術(shù)。
背景技術(shù)：
H^ (Saussurea involucrata Kar. et Kir. et Maxim.)胃禾胃Mil胃IM 的草本植物。雪蓮是高山地區(qū)的民間藥用植物，用于散寒除濕、活血通經(jīng)、抗炎鎮(zhèn)痛等，民間 多用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女小腹冷痛、閉經(jīng)，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、陽(yáng)痿、高山不適 應(yīng)癥等癥的治療。近年來(lái)，雪蓮作為民族藥在抗炎鎮(zhèn)痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌細(xì)胞增生 方面的作用倍受關(guān)注。但我國(guó)雪蓮主要分布在4000m以上的高原寒帶地區(qū)，如新疆、甘肅、 四川、云南和西藏。這些地區(qū)氣候多變，冷熱無(wú)常，最高月平均氣溫3-10°C，最低月平均氣溫 則在零下十幾度到幾十度，生長(zhǎng)環(huán)境十分惡劣，只有耐寒的苔草屬、蒿草屬以及少數(shù)高山多 年生草本植物與之伴生，一般在此環(huán)境下的雪蓮植物大多為多年生，生長(zhǎng)緩慢，人工栽培困 難，長(zhǎng)期以來(lái)掠奪性采挖已使雪蓮資源嚴(yán)重匱乏，已使得雪蓮成為瀕危物種，自然資源難以 滿足臨床日益增長(zhǎng)的需要。由于雪蓮資源的緊張，許多科研單位都開(kāi)始研究代替野生種植 方法獲得雪蓮資源的生產(chǎn)方法，其中以雪蓮細(xì)胞的室內(nèi)培養(yǎng)研究的最多，應(yīng)用的也最廣，目 前已經(jīng)有許多公司將雪蓮細(xì)胞用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。超低溫冷凍保存技術(shù)是一種建立在減少或停止生物體的新陳代謝從而減緩或暫 停其生命活動(dòng)的一種生物技術(shù)，其實(shí)現(xiàn)是將生物體投入到液氮中實(shí)現(xiàn)的。由于超低溫保存 可以實(shí)現(xiàn)延緩甚至?xí)和Ｉ顒?dòng)的作用。組織培養(yǎng)技術(shù)是種質(zhì)保存的有效途徑之一，利用這種技術(shù)可迅速建立植物無(wú)性繁 殖系，其缺點(diǎn)在于長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過(guò)程中要發(fā)生細(xì)胞學(xué)變化，導(dǎo)致染色體變異和基因突變，增 加遺傳的不穩(wěn)定性。在超低溫條件(一般指液氮低溫，_196°C)下，幾乎所有的細(xì)胞代謝活 動(dòng)和生長(zhǎng)過(guò)程都停止進(jìn)行，但細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能卻可保存，因而細(xì)胞培養(yǎng)物的遺 傳穩(wěn)定性得以保存。將超低溫冷凍保存技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，可望成為保存植物 種質(zhì)的最佳辦法。植物組織培養(yǎng)物的超低溫保存是指在-80°C以下的超低溫環(huán)境中保存種質(zhì)資源， 是70年代發(fā)展起來(lái)的一套現(xiàn)代生物學(xué)保存技術(shù)。常以液氮為冷源，因此超低溫保存又稱(chēng)液 氮保存。植物材料的特性和材料的預(yù)培養(yǎng)對(duì)超低溫保存植物組織培養(yǎng)物的成活關(guān)系很大。 另外，低溫冰凍會(huì)使細(xì)胞內(nèi)水結(jié)冰，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)不可逆的破壞，導(dǎo)致死亡。組織培養(yǎng)物含 大量的水分，因此，冰凍防護(hù)劑的使用、降溫及解凍方法是植物組織培養(yǎng)物保存的幾個(gè)關(guān)鍵 因素。

發(fā)明內(nèi)容
本專(zhuān)利發(fā)明為一種雪蓮細(xì)胞超低溫冷凍保存技術(shù)，具體方法如下首先是材料準(zhǔn)備用于超低溫冷凍保存的保存材料為固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天的雪蓮細(xì)胞。用于其培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+NAA 0. 1-2. Omg/L+6-BA 0.1-2. Omg/L+蔗糖30g/ L；用于雪蓮超低溫冷凍保存的冷凍保護(hù)劑為含有15% DMS0U5% PEG、30%甘油以 0. 4M蔗糖或山梨醇的細(xì)胞系液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液；用于雪蓮超低溫冷凍保存的前期處理試劑為處 理劑A (其配方為含有0. 2M山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液)和B (含有0. 4M山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液)； 用于保存細(xì)胞洗滌的溶液為含有1. 2M蔗糖的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液。配置好的培養(yǎng)基密封好后，采用 高壓蒸汽的方式進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為15-30min ；當(dāng)材料都準(zhǔn)備好后即可開(kāi)始保存過(guò)程首先是預(yù)處理，將選擇好的細(xì)胞系投入到A處理液中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 (25士 1) 0C，搖床轉(zhuǎn)速為90-130r/min，24-72小時(shí)后取上清，加入b處理液，在同樣條件培養(yǎng) 24-72h預(yù)處理完成后即可進(jìn)行冷凍前的保護(hù)劑處理，處理方法為將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的細(xì)胞系，去掉多余的營(yíng)養(yǎng)液，加入全劑量冷凍保護(hù)劑處理IOmin 后，快速投入到液氮當(dāng)中。冷凍細(xì)胞的解凍取出冷凍管快速投入到37°C的水浴鍋中解凍 2min，當(dāng)其全部融化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到含有1.2M蔗糖的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行洗滌完成后轉(zhuǎn)入
正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)例一冷凍材料的處理方法比較處理方案①固態(tài)培養(yǎng)10天的雪蓮細(xì)胞；25%PVS2常溫處理10min;100%PVS2 0°C脫水 IOmin ；直接投入LN中。②固態(tài)培養(yǎng)12天的雪蓮細(xì)胞；0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ； 25% PVS2常溫處理IOmin ；100% PVS2 0°C脫水IOmin ；直接投入LN中③固態(tài)培養(yǎng)15天的雪蓮細(xì)胞0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ； 5% PVS2 預(yù)處理 24h ；25% PVS2 常溫處理 IOmin ；100% PVS2 0°C脫水 IOmin ；直接投入 LN 中解凍方法37°C快速化凍1.5min后，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到1.2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液 IOml洗滌，完成后去上清余少量液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液導(dǎo)入固態(tài)培養(yǎng)瓶后，倒掉多余營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)固態(tài)
培養(yǎng)結(jié)果三種處理方式下解凍得到的細(xì)胞都有存活細(xì)胞，結(jié)論三種冷凍保存處理方式均可用于雪蓮的超低溫冷凍保存，那一個(gè)更好一些 需要進(jìn)一步優(yōu)化比較實(shí)例二冷凍保護(hù)劑PVS2中利用山梨醇代替蔗糖實(shí)驗(yàn)一①固態(tài)培養(yǎng)10天的雪蓮細(xì)胞；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中。②固態(tài)培養(yǎng)12天的雪蓮細(xì)胞；0. 2M D-山梨醇處理48h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ； 100% PVS2 0°C脫水IOmin ；直接投入LN中③固態(tài)培養(yǎng)15天的雪蓮細(xì)胞0. 2M D-山梨醇處理48h ；0. 4M D-山梨醇處理48h ；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中解凍方法37°C快速化凍1.5min后，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到1.2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液 IOml IOmin ；洗滌完成后，去上清余少量液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液導(dǎo)入固態(tài)培養(yǎng)瓶后，倒掉多余營(yíng)養(yǎng)液培 養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二材料固態(tài)培養(yǎng)12的雪蓮細(xì)胞預(yù)處理方案方案①0. 2M D-山梨醇處理48h ；0. 4M D-山梨醇處理48h方案②不進(jìn)行任何處理冷凍保護(hù)劑PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)處理方法100 % PVS2處理IOmin迅速投入LN中。解凍方法1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；去上清1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；去上 清1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；固態(tài)培養(yǎng)解凍時(shí)間18天結(jié)果PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)處理下的細(xì)胞都有存活結(jié)論P(yáng)VS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)均可用于雪蓮的超低溫冷凍保存，并且差別 不太明顯從成本上看建議用蔗糖組。實(shí)例三洗滌方法的改進(jìn)洗滌方法1. OM蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；去上清1. OM蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；去上 清1. OM蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmn ；實(shí)驗(yàn)一①固態(tài)培養(yǎng)10天的雪蓮細(xì)胞；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中。②固態(tài)培養(yǎng)12天的雪蓮細(xì)胞；0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理24h ； 100% PVS2 0°C脫水IOmin ；直接投入LN中③固態(tài)培養(yǎng)15天的雪蓮細(xì)胞0. 2M D-山梨醇處理24h ;0. 4M D-山梨醇處理 24h ； ；100% PVS2脫水IOmin ；直接投入LN中解凍方法37°C快速化凍1.5min后，迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到1.2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液 IOml IOmin ；洗滌完成后，去上清余少量液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液導(dǎo)入固態(tài)培養(yǎng)瓶后，倒掉多余營(yíng)養(yǎng)液培 養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二材料固態(tài)培養(yǎng)12的雪蓮細(xì)胞預(yù)處理方案方案①0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理24h方案②不進(jìn)行任何處理冷凍保護(hù)劑PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)
處理方法100 % PVS2處理IOmin迅速投入LN中。解凍方法1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；去上清1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin ；去上 清1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液IOmin 洗滌后進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)。解凍時(shí)間18天
結(jié)果該洗滌方法洗滌后得到的細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象結(jié)論該改進(jìn)的洗滌方法完全可用于雪蓮的超低溫冷凍保存實(shí)例四解凍后細(xì)胞培養(yǎng)方式改進(jìn)液態(tài)培養(yǎng)材料固態(tài)培養(yǎng)12的雪蓮細(xì)胞 預(yù)處理方案方案①0. 2M D-山梨醇處理24h ；0. 4M D-山梨醇處理24h冷凍保護(hù)劑PVS2 (蔗糖)與PVS2 (山梨醇)處理方法100% PVS2處理IOmin后，迅速投入LN中。解凍方法1. 2M蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液10搖床培養(yǎng)30min后，調(diào)整逐步調(diào)整洗滌液中 蔗糖的濃度至正常營(yíng)養(yǎng)液狀態(tài)，調(diào)整方法為加入液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整蔗糖濃度至0. 6M后處理 5min,然后繼續(xù)調(diào)整至0. 3M 5min ；調(diào)整至0. 15M 5min,去上清加入新鮮液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液搖床 100r/min搖床培養(yǎng)解凍時(shí)間冷凍4天后結(jié)果解凍后的細(xì)胞無(wú)存活現(xiàn)象結(jié)論液態(tài)培養(yǎng)在該方法下不適合解凍后的細(xì)胞的再培養(yǎng)通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們拿到了可以用于雪蓮超低溫冷凍保存的方法，并得到了冷凍過(guò) 程中的主要注意事項(xiàng)，我們完全可以通過(guò)本方法對(duì)雪蓮細(xì)胞進(jìn)行超低溫冷凍保存1保存材料固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天的雪蓮細(xì)胞2 試劑DMSO,甘油，乙二醇，d-山梨醇，蔗糖常規(guī)MS培養(yǎng)基所用物品3儀器與耗材液氮罐，三角瓶，2ml螺口冷凍管，燒杯，制冰機(jī)或冷凍冰箱4冷凍保護(hù)劑PVS2(15% DMS0+30%甘油 +15% 乙二醇 +0. 4M 蔗糖或山梨醇)5預(yù)處溶劑0. 2M d-山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液，0. 4M d_山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液6處理方案0. 2M d-山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處理24_72h，0. 4M d_山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處 理24-72h，100% PVS2處理IOmin后，迅速投入液氮。7解凍與解凍后的培養(yǎng)方案從液氮罐中取出冷凍管后迅速投入37°C的水浴鍋中解凍90-120S，擦凈表面的水 分后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)開(kāi)蓋，倒入1. 2M的蔗糖液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液，常溫洗滌10min-30min ；最后倒入 到固態(tài)培養(yǎng)瓶中，去掉洗滌液轉(zhuǎn)入正常固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)。
權(quán)利要求
新疆雪蓮細(xì)胞系的超低溫冷凍保存其特征包括細(xì)胞系營(yíng)養(yǎng)液的制備，超低溫冷凍保護(hù)劑的選擇，超低溫冷凍保存程序，保存材料的選擇，保存后材料的解凍方式
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新疆雪蓮細(xì)胞系的超低溫冷凍保存過(guò)程主要包括以下幾個(gè) 特征(1)細(xì)胞系液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液為MS+0.1-2. Omg/L NAA+0. 1-2. Omg/L 6_BA+30g/L 蔗糖(2)冷凍保護(hù)劑的配置所用冷凍保護(hù)劑為含有15%DMS0U5% PEG、30%甘油以及 0. 4M蔗糖或山梨醇的細(xì)胞系液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液；(3)冷凍保護(hù)前期處理試劑為含有0.2M山梨醇的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液A和含有0. 4M山梨醇的 液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液B(4)細(xì)胞洗滌液為含有0.8-1. 2M蔗糖的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液(5)配置好的培養(yǎng)基密封好后，采用高壓蒸汽的方式進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為15-30min;(6)用于超低溫保存的細(xì)胞系為經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)10-15天的新疆雪蓮細(xì)胞
3.根據(jù)權(quán)利要求所述的新疆雪蓮超低溫冷凍保存的程序如下(1)預(yù)處理將選擇好的細(xì)胞系按IOg/瓶投入到A處理液中搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 (25士 1)°C，搖床轉(zhuǎn)速為80-130r/min。24-72小時(shí)后取上清，加入B處理液同樣條件培養(yǎng) 24-72h(2)保護(hù)劑處理加入全劑量冷凍保護(hù)劑0°C處理IOmin后，快速投入到液氮當(dāng)中(3)冷凍細(xì)胞的解凍取出冷凍管快速投入到37°C的水浴鍋中解凍2min，當(dāng)其全部融 化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入到含有1. 2M蔗糖的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行洗滌，完成后轉(zhuǎn)入固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明為一種中藥材新疆雪蓮細(xì)胞系的超低溫冷凍保存技術(shù)。在保存中首先選擇合適的細(xì)胞系，然后分別用0.2M山梨醇溶液和0.4M山梨醇溶液進(jìn)行保存前的預(yù)處理，最后再用冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行包埋，包埋完成后即可直接投入到液氮中進(jìn)行超低溫冷凍保存，冷凍好的細(xì)胞在1.2M蔗糖溶液中洗滌之后即可進(jìn)行正常培養(yǎng)，成活率可達(dá)60％以上。
文檔編號(hào)A01N1/02GK101884321SQ20101022486
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者劉漢石 申請(qǐng)人:大連普瑞康生物技術(shù)有限公司;金銀兵