專利名稱：一種芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，屬于飼料添加劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
作為抗生素的替代品，微生態(tài)制劑憑借其獨特的調(diào)節(jié)腸道菌群的功能，正越來越受到飼料業(yè)界人士的關(guān)注，目前市場上已有微生態(tài)制劑產(chǎn)品。但是，市場上的微生態(tài)制劑存在以下幾個方面的主要質(zhì)量問題(1)活菌含量低；( 水分含量偏高，這是影響微生態(tài)制劑質(zhì)量的重要因素之一；C3)不耐抗生素；(4)對胃酸和膽鹽不穩(wěn)定，致使只有少數(shù)菌株進入腸道后仍具有活性，達不到發(fā)揮作用所需的活菌數(shù)量。由于微生態(tài)制劑存在的這些質(zhì)量問題，從而影響了其在動物上的應用效果，限制了微生態(tài)制劑的廣泛應用。微膠囊包被法可提高產(chǎn)品中活菌的數(shù)量，但通過此法得到的產(chǎn)品價格昂貴。因此，只有找到一種既有良好的生物學功能又具有很強抗性的菌株，同時，找出一種制備工藝簡單，成本低，但能很好保持菌株活性的制備工藝，才能從根本上解決微生態(tài)制劑存在的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，該工藝制備過程簡單，所用的菌株有優(yōu)良的生物學活性，本發(fā)明的制備工藝所制得的飼料添加劑具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫、耐受常用抗生素等抗逆性能及抑制病原菌等益生功能，能夠和抗生素聯(lián)用；產(chǎn)品活菌含量高、保存時間長，應用效果明顯且穩(wěn)定。本發(fā)明的發(fā)明點在于1、地衣芽孢桿菌，為大北農(nóng)自己分離得到，與現(xiàn)有該類菌株相比，有良好的抗逆性能和抑制病原菌等益生功能；2、制備工藝工藝簡單，制得產(chǎn)品活菌含量的提高；3、本發(fā)明的含地衣芽孢桿菌的飼料添加劑。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，該工藝包括下述步驟1)地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)，得種子液；幻地衣芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)，種子液的接種量為3 10%，發(fā)酵至菌數(shù)達HXKTcfu/ml ；3)離心收集菌體；4)菌體凍干將收集的菌體中加入凍干保護劑，移入凍干機中進行冷凍真空干燥，成為凍干菌粉力)凍干菌粉中加入輔料，得芽孢桿菌的飼料添加劑。其中，本發(fā)明所用的芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，此菌為大北農(nóng)公司從健康動物腸道中分離，選育得到，具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫、耐受常用抗生素等抗逆性能和抑制病原菌等益生功能，已于2008年3月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國科學院微生物研究所)保藏(簡稱CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 2384。本發(fā)明中所用的凍干機為真空冷凍干燥機。本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)為三級培養(yǎng)，一級培養(yǎng)將菌種接種于BPY平板培養(yǎng)基上，于30-37°C培養(yǎng)12-Mh，使地衣芽孢桿菌復壯，并形成單菌落，挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于30-37°C培養(yǎng)對-3他；二級培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌接種于一級BPY斜面培養(yǎng)基上，于30 37°C培養(yǎng)12 16h，使其處于對數(shù)中后期，得一級種子；三級液體培養(yǎng)一級種子用無菌水制成菌懸液，接種到BPY種子培養(yǎng)基中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速200 250rpm,罐壓 0. 05Mpa,通風比1 0. 6 0. 8 (14. 4 19. 2M3/h)，培養(yǎng) 10 14h,得二級種子液。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，溫度為30 37°C，轉(zhuǎn)速220 300rpm，罐壓0. 05Mpa，通風比1 0. 6 0. 8，培養(yǎng)16 20h，至芽孢形成率90%以上，活菌數(shù)為1 2X101(lCfU/ml，則中止發(fā)酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液。所用的培養(yǎng)基為麩皮 1 2%，豆粕1 2%，氯化鈉0. 2 0. 8%，硫酸鎂0. 01 0. 05%。地衣芽孢桿菌的離心過程中，轉(zhuǎn)速控制在5000rpm以下。本發(fā)明的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，所用的凍干保護劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和谷氨酸鈉的混合物，按照脫脂奶粉甘油蔗糖麥芽糊精谷氨酸鈉=2 0.5 1.0 0.5 1.0 0.5 1.5 0. 5 1. 0的比例混合而成。本發(fā)明的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝中，凍干菌粉中加入的輔料可為玉米芯粉、脫脂米糠、玉米蛋白粉、變性淀粉、葡萄糖中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明的另一目的是提供該芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝所制得的飼料添加劑。本發(fā)明的制備工藝簡單，所用的地衣芽孢桿菌菌株具有優(yōu)良的生物學活性，人工模擬胃液(pH2.0 4.0)中處理他，存活率在49.5%以上；在豬膽鹽溶液(濃度0. 3_3g/ kg)處理6h，存活率為100% ；50 80°C處理15 30min，存活率為100% ；對青霉素G、阿莫西林、大觀霉素、紅霉素、吉他霉素、桿菌肽鋅、林可霉素7種抗生素有耐藥性；對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌三種致病菌均有較好的抑制作用，抑菌圈直徑在 12 20mm ；產(chǎn)蛋白酶活力為1000u/ml ；產(chǎn)淀粉酶活力為800u/ml。本發(fā)明的制備藝所制得的飼料添加劑具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫、耐受常用抗生素等抗逆性能和抑制病原菌等益生功能，能夠和抗生素聯(lián)用；產(chǎn)品活菌含量高、保存時間長，應用效果明顯且穩(wěn)定。通過以下實施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例11)將地衣芽孢桿菌的菌種接種到BPY種子培養(yǎng)基中活化，370C 200rpm培養(yǎng)18h， 得到芽孢率在95%以上的培養(yǎng)物；2)耐酸性測定將上述制備的培養(yǎng)物按5%接種量分別接種于pH值2.0、3.0、4.0 的人工模擬胃液中，Oh計數(shù)作對照，2h Ah取樣用磷酸緩沖液按10倍系列稀釋，進行平板活菌計數(shù)，計算存活率。人工模擬胃液的制備量取9. 5% -10. 5%濃鹽酸16. 4毫升，加蒸餾水至1000毫升，做基礎人工胃液，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)PH值2. 0、3. 0、4. 0，各取10mL(9mL)，分裝于試管中，100°C下蒸汽滅菌15分鐘，在無菌條件下，每IOmL液體中加入0. IOOg胃蛋白酶。
表1菌種在人工模擬胃液中的存活率
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，其特征在于所述的芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌，保藏編號為CGMCC No. 2384，該工藝包括下述步驟1)地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)，得種子液；幻地衣芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)，種子液的接種量為3 10%，發(fā)酵至菌數(shù)達1-2 X IOltlCfuAil ；3)離心收集菌體；4)菌體凍干將收集的菌體中加入凍干保護劑，移入凍干機中進行冷凍真空干燥，成為凍干菌粉力)凍干菌粉中加入輔料，得芽孢桿菌的飼料添加劑。
2.如權(quán)1所述的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，其特征在于地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)為三級培養(yǎng)，一級培養(yǎng)將菌種接種于BPY平板培養(yǎng)基上，于30-37°C培養(yǎng)12-Mh，使地衣芽孢桿菌復壯，并形成單菌落，挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于30-37°C培養(yǎng)； 二級培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌接種于一級BPY斜面培養(yǎng)基上，于30 37°C培養(yǎng)12 16h， 使其處于對數(shù)中后期，得一級種子；三級液體培養(yǎng)一級種子用無菌水制成菌懸液，接種到 BPY種子培養(yǎng)基中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速200 250rpm，罐壓0. 05Mpa，通風比1 0. 6 0. 8 (14. 4 19. 2M3/h)，培養(yǎng)10 14h，得二級種子液。
3.如權(quán)1所述的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，其特征在于地衣芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速220 300rpm，罐壓0. 05Mpa，通風比1 0.6 0.8， 培養(yǎng)16 20h，至芽孢形成率90%以上，活菌數(shù)為1 2X101(lCfU/ml，則中止發(fā)酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液。
4.如權(quán)1所述的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，其特征在于所述的凍干保護劑為 脫脂奶粉、甘油、蔗糖、麥芽糊精和谷氨酸鈉的混合物，按照脫脂奶粉甘油蔗糖麥芽糊精谷氨酸鈉=2 0. 5 1. 0 0. 5 1. 0 0. 5 1. 5 0. 5 1. 0的比例混合而成。
5.如權(quán)1所述的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，其特征在于所述的輔料包括玉米芯粉、脫脂米糠、玉米蛋白粉、變性淀粉、葡萄糖中的一種或幾種的混合物。
6.一種如權(quán)1至權(quán)5所述的芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝所制得的飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌飼料添加劑的制備工藝，屬于飼料添加劑領(lǐng)域。本發(fā)明的制備工藝主要包括下述步驟1)芽孢桿菌的培養(yǎng)，得種子液；2)芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)，種子液的接種量為3～10％，發(fā)酵至菌數(shù)達1-2×1010cfu/ml；3)離心收集菌體；4)菌體凍干將收集的菌體中加入凍干保護劑，移入凍干機中進行冷凍真空干燥，成為凍干菌粉；5)凍干菌粉中加入輔料，得芽孢桿菌的飼料添加劑。本發(fā)明的制備工藝所制得的飼料添加劑具有良好的耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫、耐受常用抗生素等抗逆性及抑制病原菌等益生功能，能夠和抗生素聯(lián)用；制得的飼料添加劑活菌含量高、保存時間長，應用效果明顯且穩(wěn)定。
文檔編號A23K1/17GK102232479SQ20101016414
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者張玳華, 彭藝, 贠桂玲, 趙愛平 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 湖南大北農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司