專利名稱：一種促進(jìn)甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生 的方法。
背景技術(shù)：
植物界游離小孢子培養(yǎng)是直接從花蕾獲取游離態(tài)的小孢子群體進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)其 胚胎發(fā)生形成單倍體(Haploid)，進(jìn)而加倍形成雙單倍體(DoubleHaploid)植株的過程，這 種雙單倍體植株的自交后代則是DH系。自Lichter于1982年首次從油菜小孢子培養(yǎng)物中 獲得小孢子植株以來，許多重要作物如小麥、玉米、油菜、大白菜等利用小孢子培養(yǎng)都獲得 了小孢子植株或在實(shí)際工作中得到有效利用。甘藍(lán)是結(jié)球甘藍(lán)(Brasscia oleracea var. capitata)的簡(jiǎn)稱，是十字花科蕓薹屬一種重要的蔬菜作物，異花授粉；在甘藍(lán)作物上進(jìn)行 的小孢子培養(yǎng)研究已有報(bào)道，但是因其出胚較其它作物困難，即多數(shù)材料對(duì)常規(guī)培養(yǎng)無反 應(yīng)或出胚材料產(chǎn)胚量很低，成為目前這項(xiàng)技術(shù)有效利用的最大障礙。秋水仙素(C22H25NO6) 是一種水溶性生物堿，它除具有染色體加倍作用外，還能夠促進(jìn)游離小孢子胚狀體的形成； 人們已添加秋水仙素用于甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、小麥等作物小孢子培養(yǎng)研究中，起到了 誘發(fā)小孢子胚胎發(fā)生作用。但甘藍(lán)是植物界很難誘導(dǎo)出小孢子胚狀體的一種作物，在我們 研究中添加了秋水仙素誘發(fā)小孢子胚胎發(fā)生，也起到了一定的作用，但其誘導(dǎo)出胚效果不 理想?；谶@種原因擬想探索出一種在添加秋水仙素的同時(shí)，再添加一種細(xì)胞分裂素(噻 二唑苯基脲(TD^Q^KOS)的方法來提高小孢子胚胎發(fā)生率，結(jié)果獲得了顯著的效果。這 一種方法對(duì)常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)的甘藍(lán)材料，能促使其出胚，對(duì)出胚的甘藍(lán)材料，能提高其胚狀 體產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種促進(jìn)甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生的方法。該方法對(duì)常 規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)的甘藍(lán)材料，能促使其出胚；對(duì)出胚的甘藍(lán)材料，能提高其胚狀體產(chǎn)量。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種促進(jìn)甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生的方法，具 體包括下列步驟1)分別配制秋水仙素和TDZ母液的步驟；2)分別對(duì)秋水仙素母液和TDZ母液的滅菌步驟；3)花蕾選取與消毒步驟；4)小孢子游離與純化步驟；5)誘導(dǎo)胚狀體步驟。所述的秋水仙素和TDZ母液配制包括下列步驟1)秋水仙素母液配制①稱取秋水仙素3克；②在秋水仙素中滴入少許酒精導(dǎo)溶后再加適量蒸餾水振搖使其全部溶解；
③在秋水仙素溶液中繼續(xù)用蒸餾水定容至lOOOmL，即得濃度為3g/L的秋水仙素 母液；2)TDZ母液的配制①稱取TDZ0.3 克；②將稱取的TDZ放進(jìn)lOOmL的小燒杯中，滴入少許lmol/L的NaOH溶液導(dǎo)溶后加 適量蒸餾水振搖使其全部溶解；③將全部溶解后的TDZ定溶到1000mL定量瓶中，即配成0. 3g/L的母液。所述的秋水仙素母液的抽濾滅菌包括下列步驟1)用抽濾器將秋水仙素母液先用0. 45 y m濾膜預(yù)抽濾一遍；2)將滅過菌的抽濾器主要部件安裝和放置在超凈工作臺(tái)上，并用鑷子將滅過菌的 0. 22um濾膜放到濾頭位置安裝好；將預(yù)抽濾的秋水仙素母液在無菌超凈工作臺(tái)上抽濾一 遍，裝入貯藏瓶4°C冰箱中保存，待具體使用時(shí)再按所需要濃度進(jìn)行稀釋。所述的TDZ母液的高壓滅菌包括下列步驟1)將TDZ母液裝入耐壓瓶，封口放入高壓滅菌鍋；2)在1. 5壓力下滅菌30分鐘，隨后冷卻放在4°C冰箱中保存，待具體使用時(shí)再按 所需要濃度進(jìn)行稀釋。所述的花蕾選取與消毒包括下列步驟1)在盛花前期，采集長度3. 5 5. 5mm的花蕾在室內(nèi)用倒置顯微鏡確定單核晚期 至雙核早期的花蕾長度，以此為標(biāo)準(zhǔn)選取一定數(shù)量的花蕾供試；2)將供試花蕾用體積分?jǐn)?shù)70%酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡lOmin，最后用 無菌蒸餾水漂洗3次，每次lmin。所述的小孢子游離與純化包括下列步驟1)將已消毒的花蕾放入無菌試管中，以含蔗糖130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑，用玻 璃棒擠壓花蕾使小孢子游離出來；2)用孔徑50 iim無菌網(wǎng)過濾，收集濾液于離心管中，離心3次，沉在離心管底部的 即為純凈小孢子。所述的誘導(dǎo)胚狀體包括下列步驟1)用微量移液器分別吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13懸浮小孢子的培養(yǎng)皿中，使秋水仙素濃度在0. 1 50mg/L之間，TDZ濃度在0. 01 0. 2mg/L 之間，封口 ；2)將培養(yǎng)皿靜置在32°C下黑暗培養(yǎng)48h ；3)將培養(yǎng)皿內(nèi)含小孢子的培養(yǎng)基裝入離心管置于離心機(jī)中，在2000r/min的速度 下離心三次，第一次離心lOmin，棄去上清液；第二次再向離心管內(nèi)加入10ml NLN-13懸浮 液培養(yǎng)基，繼續(xù)離心lOmin，棄去上清液；第三次再向離心管內(nèi)加入10ml NLN-13懸浮液培 養(yǎng)基，繼續(xù)離心5min，棄去上清液；然后將小孢子懸浮培養(yǎng)在不含有秋水仙素和TDZ的新鮮 6mL NLN-13培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，封口 ；4)將懸浮小孢子的培養(yǎng)皿靜置于25°C、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直到肉眼可見小白 點(diǎn)時(shí)，改換為振蕩培養(yǎng)；5)將肉眼可見小白點(diǎn)的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至60r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)保持適當(dāng)?shù)娜豕鈼l件，繼續(xù)培養(yǎng)直至胚狀體發(fā)育完全。所述的盛花前期是指第一側(cè)枝始花至第三側(cè)枝始花期間。所述的離心3次條件為以含蔗糖130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑，每次5min，2000r/
mirio所述的NLN-13為含130g/L蔗糖的NLN培養(yǎng)基。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、對(duì)常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)的甘藍(lán)材料，能誘導(dǎo)其部分材料出胚，其出胚材料占供試材 料52. 6%，平均產(chǎn)胚量1. 05胚/蕾 6. 57胚/蕾，較單一添加10mg/L秋水仙素提高幅度 0. 85胚/蕾 6. 60胚/蕾，較單一添加0. lmg/LTDZ提高幅度1. 0胚/蕾 6. 67胚/蕾。2、對(duì)常規(guī)培養(yǎng)有反應(yīng)出胚的甘藍(lán)材料，均能夠提高其胚狀體產(chǎn)量，每蕾產(chǎn)胚量 較未添加秋水仙素和TDZ提高幅度21. 8 % 550. 0 % ；較單一添加秋水仙素提高幅度 7. 14%~ 376. 0% ；較單一添加 TDZ 提高幅度 17. 360. 2% 03、在誘導(dǎo)出的胚狀體中，均能夠提高子葉型胚率，其比率較未添加秋水仙素和TDZ 提高幅度6. 8% 69. ；較單一添加秋水仙素提高幅度3. 8% 66. 5% ；較單一添加TDZ 提高幅度0.8% 67. 8%。


圖1是甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)花蕾適宜選取植株生長時(shí)期圖；圖2是用倒置顯微鏡確定選取單核晚期至雙核早期的花蕾不同長度圖；圖3是本發(fā)明的方法對(duì)甘藍(lán)小孢子常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)材料A632M-1S-5-6-3-8誘導(dǎo) 產(chǎn)胚圖；圖4是本發(fā)明的方法對(duì)甘藍(lán)小孢子常規(guī)培養(yǎng)出胚材料633MXYP03誘導(dǎo)產(chǎn)胚圖；圖5是子葉型胚狀體圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、分別配制秋水仙素和TDZ母液的步驟；1)秋水仙素母液配制①稱取秋水仙素3克；②在秋水仙素中滴入少許酒精導(dǎo)溶后再加適量蒸餾水振搖使其全部溶解；③在秋水仙素溶液中繼續(xù)用蒸餾水定溶到1000mL，即得濃度為3g/L的秋水仙素 母液；2)TDZ母液的配制①稱取TDZ0. 3 克；②將稱取的TDZ放進(jìn)100mL的小燒杯中，滴入少許lmol/L的NaOH溶液導(dǎo)溶后加 適量蒸餾水振搖使其全部溶解；③將全部溶解后的TDZ定溶到1000mL定量瓶中，即配成0. 3g/L的母液。2、秋水仙素母液的抽濾滅菌包括下列步驟1)用抽濾器將秋水仙素母液先用0. 45 y m濾膜預(yù)抽濾一遍；
2)將滅過菌的抽濾器主要部件安裝和放置在超凈工作臺(tái)上，并用鑷子將滅過菌的 0. 22um濾膜放到濾頭位置安裝好；將預(yù)抽濾的秋水仙素母液在無菌超凈工作臺(tái)上抽濾一 遍，裝入貯藏瓶4°C冰箱中保存，待具體使用時(shí)再按所需要濃度進(jìn)行稀釋。3、TDZ母液的高壓滅菌包括下列步驟1)將TDZ母液裝入耐壓瓶，封口放入高壓滅菌鍋；2)在1. 5壓力下滅菌30分鐘，隨后冷卻放在4°C冰箱中保存，待具體使用時(shí)再按 所需要濃度進(jìn)行稀釋。4、所述的花蕾選取與消毒包括下列步驟1)在盛花前期，采集長度3. 5 5. 5mm的花蕾在室內(nèi)用倒置顯微鏡確定單核晚期 至雙核早期的花蕾長度，以此為標(biāo)準(zhǔn)選取一定數(shù)量的花蕾供試；2)將供試花蕾用體積分?jǐn)?shù)70%酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡lOmin，最后用 無菌蒸餾水漂洗3次，每次lmin。5、小孢子游離與純化包括下列步驟1)將已消毒的花蕾放入無菌試管中，以含蔗糖130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑，用玻 璃棒擠壓花蕾使小孢子游離出來；2)用孔徑50 iim無菌網(wǎng)過濾，收集濾液于離心管中，離心3次，沉在離心管底部的 即為純凈小孢子。6、誘導(dǎo)胚狀體包括下列步驟1)用微量移液器分別吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13懸浮小孢子的培養(yǎng)皿中，使秋水仙素濃度在0. 1 50mg/L之間，TDZ濃度在0. 01 0. 2mg/L 之間，封口 ；2)將培養(yǎng)皿靜置在32°C下黑暗培養(yǎng)48h ；3)將培養(yǎng)皿內(nèi)含小孢子的培養(yǎng)基裝入離心管置于離心機(jī)中，在2000r/min的速度 下離心三次，第一次離心lOmin，棄去上清液；第二次再向離心管內(nèi)加入10ml NLN-13懸浮 液培養(yǎng)基，繼續(xù)離心lOmin，棄去上清液；第三次再向離心管內(nèi)加入10ml NLN-13懸浮液培 養(yǎng)基，繼續(xù)離心5min，棄去上清液；然后將小孢子懸浮培養(yǎng)在不含有秋水仙素和TDZ的新鮮 6mL NLN-13培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，封口 ；4)將懸浮小孢子的培養(yǎng)皿靜置于25°C、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直到肉眼可見小白 點(diǎn)時(shí)，改換為振蕩培養(yǎng)；5)將肉眼可見小白點(diǎn)的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至60r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)保持適當(dāng)?shù)娜豕鈼l 件，繼續(xù)培養(yǎng)直至胚狀體發(fā)育完全。所述的盛花前期是指第一側(cè)枝始花至第三側(cè)枝始花期間。所述的離心3次條件為以含蔗糖130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑，每次5min，2000r/
mirio所述的NLN-13為含130g/L蔗糖的NLN培養(yǎng)基。下面通過發(fā)明人給出的試驗(yàn)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的作用效果。需要說明的是。 這些實(shí)施例是一些較佳的實(shí)施例。根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明。本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。試驗(yàn)例1 采用本發(fā)明的方法對(duì)甘藍(lán)小孢子常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)材料誘導(dǎo)產(chǎn)胚試驗(yàn)。發(fā)明人研究選用的甘藍(lán)一代雜種5份、高代自交系9份及低代自交系5份，共19份材料為例，對(duì)具體實(shí)施技術(shù)加以說明。1、花蕾選取與消毒1)在田間紗網(wǎng)棚內(nèi)于各試材盛花前期(圖1)，即第一側(cè)枝始花至第三側(cè)枝始花期 間，采集長度4. 5mm的花蕾；帶花蕾在室內(nèi)用倒置顯微鏡確定單核晚期至雙核早期的花蕾 長度(圖2)，以此為標(biāo)準(zhǔn)選取各材料40個(gè)花蕾。2)在超凈臺(tái)上，將供試花蕾用體積分?jǐn)?shù)70%酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡 lOmin，最后用無菌蒸餾水漂洗3次，每次lmin。2、小孢子游離與純化1)將已消毒的花蕾放入無菌試管中，以含蔗糖130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑，用玻 璃棒擠壓花蕾使小孢子游離出來。2)用孔徑50 iim無菌尼龍網(wǎng)過濾，濾液收集于離心管中，離心3次，沉在離心管底 部的即為純凈小孢子。每次離心5min(2000r/min)，以含蔗糖130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑。3、誘導(dǎo)胚狀體第1步分皿。用NLN-13培養(yǎng)基(含130g/L蔗糖的NLN培養(yǎng)基)10mL懸浮小孢子， 平均分到5個(gè)直徑為60mm的玻璃培養(yǎng)皿中(2mL/皿)，每個(gè)培養(yǎng)皿預(yù)先加入NLN-13培養(yǎng)基 lmL,即每皿3mL NLN-13培養(yǎng)基；第2步秋水仙素和TDZ誘導(dǎo)。用微量移液器分別吸取一定 量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13懸浮小孢子的培養(yǎng)皿中，使秋水 仙素濃度為10mg/L，TDZ濃度0. lmg/L,用Paraf ilm封口。第3步熱激處理。將培養(yǎng)皿靜 置在32°C下黑暗培養(yǎng)48h。第4步更換新鮮培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿內(nèi)含小孢子的培養(yǎng)基進(jìn)行離 心，離心后將原培養(yǎng)基棄去，再用NLN-13新鮮培養(yǎng)基3mL懸浮小孢子，培養(yǎng)于直徑為90mm 的玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿預(yù)先加入NLN-13新鮮培養(yǎng)基3mL，即每皿6mL NLN-13新鮮培 養(yǎng)基；用Parafilm封口 ；第5步靜止培養(yǎng)。將懸浮小孢子的培養(yǎng)皿靜置于25°C、黑暗條件 下繼續(xù)培養(yǎng)，直到肉眼可見小白點(diǎn)(胚狀體)時(shí)，改換為振蕩培養(yǎng)；第6步振蕩培養(yǎng)。將肉 眼可見小白點(diǎn)(胚狀體)的培養(yǎng)皿由靜止培養(yǎng)轉(zhuǎn)至振蕩培養(yǎng)(60r/min)，同時(shí)保持適當(dāng)?shù)娜?光條件，繼續(xù)培養(yǎng)直至胚狀體發(fā)育完全。由表1可知，研究結(jié)果得出甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基中未添加秋水仙素和TDZ(常 規(guī)培養(yǎng))無反應(yīng)的19份甘藍(lán)材料，在培養(yǎng)基中添加10mg/L秋水仙素濃度和0. lmg/LTDZ后 有10份甘藍(lán)材料產(chǎn)生胚狀體，產(chǎn)胚材料占供試材料比例為52. 6%，平均產(chǎn)胚量1. 05胚/ 蕾 6. 57胚/蕾(圖3-5)；與對(duì)照比較產(chǎn)胚材料較單一添加10mg/L秋水仙素(CK2)多3 份，較單一添加0. lmg/LTDZ (CK3)多5份；產(chǎn)胚量較單一添加10mg/L秋水仙素(CK2)提高幅 度0. 85胚/蕾 6. 60胚/蕾，較單一添加0. lmg/LTDZ (CK3)提高幅度1. 0胚/蕾 6. 67 胚/蕾。由此說明，本發(fā)明方法在甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)基中添加10mg/L秋水仙素和0. lmg/LTDZ, 對(duì)常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)的一代雜種及不同自交代數(shù)的甘藍(lán)材料，可顯著的能促使其部分材料產(chǎn) 胚，并同時(shí)添加秋水仙素和TDZ誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的效果明顯比單一添加秋水仙素或TDZ任 一種效果都要好。表1 采用本發(fā)明的方法對(duì)甘藍(lán)小孢子常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)材料誘導(dǎo)產(chǎn)胚的結(jié)果
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權(quán)利要求
一種促進(jìn)甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生的方法，其特征在于，包括下列步驟1)分別配制秋水仙素和TDZ母液的步驟；2)分別對(duì)秋水仙素母液和TDZ母液的滅菌步驟；3)花蕾選取與消毒步驟；4)小孢子游離與純化步驟；5)誘導(dǎo)胚狀體步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的秋水仙素和TDZ母液配制包括下列 步驟1)秋水仙素母液配制①稱取秋水仙素3克；②在秋水仙素中滴入少許酒精導(dǎo)溶后再加適量蒸餾水振搖使其全部溶解；③在秋水仙素溶液中繼續(xù)用蒸餾水定容至IOOOmL,即得濃度為3g/L的秋水仙素母液；2)TDZ母液的配制①稱取TDZ0.3克；②將稱取的TDZ放進(jìn)IOOmL的小燒杯中，滴入少許lmol/L的NaOH溶液導(dǎo)溶后加適量 蒸餾水振搖使其全部溶解；③將全部溶解后的TDZ定容到IOOOmL定量瓶中，即配成0.3g/L的母液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的秋水仙素母液滅菌選用抽濾滅 菌，包括下列步驟1)用抽濾器將秋水仙素母液先用0.45 μ m濾膜預(yù)抽濾一遍；2)將滅過菌的抽濾器主要部件安裝和放置在超凈工作臺(tái)上，并用鑷子將滅過菌的 0. 22 μ m濾膜放到濾頭位置安裝好；將預(yù)抽濾的秋水仙素母液在無菌超凈工作臺(tái)上抽濾一 遍，裝入貯藏瓶4°C冰箱中保存，待具體使用時(shí)再按所需要濃度進(jìn)行稀釋。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的TDZ母液滅菌選用高壓滅菌，包括 下列步驟1)將TDZ母液裝入耐壓瓶，封口放入高壓滅菌鍋；2)在1.5壓力下滅菌30分鐘，隨后冷卻放在4°C冰箱中保存，待具體使用時(shí)再按所需 要濃度進(jìn)行稀釋。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的花蕾選取與消毒包括下列步驟1)盛花前期，采集長度3.5 5. 5mm的花蕾在室內(nèi)用倒置顯微鏡確定單核晚期至雙核 早期的花蕾長度，以此為標(biāo)準(zhǔn)選取一定數(shù)量的花蕾供試；2)將供試花蕾用體積分?jǐn)?shù)70%酒精浸泡30s，再用lg/L升汞浸泡lOmin，最后用無菌 蒸餾水漂洗3次，每次Imin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小孢子游離與純化包括下列步驟1)將已消毒的花蕾放入無菌試管中，以含蔗糖130g/L&B5培養(yǎng)基為洗滌劑，用玻璃棒 擠壓花蕾使小孢子游離出來；2)用孔徑50μ m無菌網(wǎng)過濾，收集濾液于離心管中，離心3次，沉在離心管底部的即為 純凈小孢子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)胚狀體包括下列步驟1)用微量移液器分別吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13懸浮小孢子的培養(yǎng)皿中，使秋水仙素濃度在0. 1 50mg/L之間，TDZ濃度在0.01 0. 2mg/L 之間，封口 ；2)將培養(yǎng)皿靜置在32°C下黑暗培養(yǎng)48h；3)將培養(yǎng)皿內(nèi)含小孢子的培養(yǎng)基裝入離心管置于離心機(jī)中，在2000r/min的速度下離 心三次，第一次離心lOmin，棄去上清液；第二次再向離心管內(nèi)加入IOml NLN-13懸浮液培 養(yǎng)基，繼續(xù)離心lOmin，棄去上清液；第三次再向離心管內(nèi)加入IOml NLN-13懸浮液培養(yǎng)基， 繼續(xù)離心5min，棄去上清液；然后將小孢子懸浮培養(yǎng)在不含有秋水仙素和TDZ的新鮮6mL NLN-13培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，封口 ；4)將懸浮小孢子的培養(yǎng)皿靜置于25°C、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直到肉眼可見小白點(diǎn) 時(shí)，改換為振蕩培養(yǎng)；5)將肉眼可見小白點(diǎn)的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至60r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)保持適當(dāng)?shù)娜豕鈼l件，繼 續(xù)培養(yǎng)直至胚狀體發(fā)育完全。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述的盛花前期是指第一側(cè)枝始花 至第三側(cè)枝始花期間。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述的離心3次條件為以含蔗糖 130g/L的B5培養(yǎng)基為洗滌劑，每次5min，2000r/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的NLN-13為含130g/L蔗糖的NLN 培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生的方法，該方法是在含有3mL NLN-13懸浮小孢子的培養(yǎng)皿中直接添加秋水仙素生物堿和噻二唑苯基脲(TDZ)細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。具體包括下列步驟1)分別配制秋水仙素和TDZ母液的步驟；2)分別對(duì)秋水仙素母液和TDZ母液的滅菌步驟；3)花蕾選取與消毒步驟；4)小孢子游離與純化步驟；5)誘導(dǎo)胚狀體步驟。該方法對(duì)常規(guī)培養(yǎng)無反應(yīng)的甘藍(lán)材料，能促使其出胚，對(duì)出胚的甘藍(lán)材料，能提高其胚狀體產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101953297SQ20101015744
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者張恩慧, 楊平安, 王小艷, 程永安, 許忠民, 許念芳, 馬勇斌, 馬青山 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)