專利名稱：對(duì)谷氨酰胺合成酶(gs)進(jìn)行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒產(chǎn)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氮(N)是植物從土壤中攝取的用于生長(zhǎng)和發(fā)育的最豐富的無機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素。玉米的根以硝酸鹽的形式從土壤中吸收大部分的N，并主要運(yùn)輸至葉中以進(jìn)行還原和同化。硝酸鹽在胞質(zhì)溶膠中被硝酸鹽還原酶(NR)還原為亞硝酸鹽，然后亞硝酸鹽被運(yùn)輸至葉綠體中，并在葉綠體中被亞硝酸鹽還原酶(Ni 還原為銨。銨被谷氨酰胺合酶-谷氨酸合酶系統(tǒng)同化為谷氨酰胺(Crawford 和 Glass，(1998)Trends in Plant Science 3 389-395)。此外，長(zhǎng)期以來已知大量的N會(huì)隨著蒸發(fā)而從植物的地上部分損失(Glyan' ko, et al. ， (1980)Agrokhimiya 8 19-26 ；Hooker, et al. ， (1980)Agronomy Journal 72(5) 789-792 ；Silva, et al.，(1981)Crop Science 21(6) :913-916 ；Stutte, et al.，(1981) Crop Science 21 (4) :596-600 ；Foster, et al. , (1986)Annals of Botany 57(3) 305-307 ；Parton, et al. , (1988)Agronomy Journal 80(3) :419-425 ；Kamiji, et al., (1989)Japanese Journal of Crop Science 58(1) :140-142 ；Morgan,et al., (1989)Crop Science 29(3) :726-731 ；0 ' Deen, (1989)Agronomy Journal 81(6) :980-985 ；Guindo, et al. , (1994)Arkansas Farm Research 43(1) :12-13 ；Heckathorn, et al. , (1995) Oecologia 101 (3) :361-365 ；Cabezas,et al. ,(1997)Revista Brasileira de Ciencia do Solo 21(3) :481-487)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明N是通過銨的形式而不是通過N氧化物的形式損失 (Hooker, et al.，1980)。用抑制谷氨酰胺合酶或谷氨酸合酶活性的化學(xué)品進(jìn)行處理，會(huì)增加銨通過蒸發(fā)的損失(Foster，et al.，1986)。N的損失并不僅限于C-3植物，已報(bào)道C-4 植物也會(huì)通過蒸發(fā)而損失N(Heckathorn，et al.，1995)。一些獨(dú)立的證據(jù)表明，谷氨酰胺合成酶(GQ與玉米的產(chǎn)量相關(guān)，并且其表達(dá)水平會(huì)影響玉米中的氮利用效率(NUE)。GS在植物細(xì)胞中主要執(zhí)行兩種功能(1)同化由生物合成過程中硝酸鹽被還原為有機(jī)形式而產(chǎn)生的銨；和( 例如在種子萌發(fā)和葉衰老過程中， 當(dāng)?shù)鞍妆换罨鳛榈椿蚰芰縼碓磿r(shí)，同化由光呼吸作用、脫氨酶和谷氨酸脫氫酶產(chǎn)生的銨鹽。胞質(zhì)溶膠中的GS被稱為GS1，質(zhì)體中的GS被稱為GS2。在最近的研究中(Martinet al. , (2006)The Plant Cell 18(11) :3252-74)，使用逆向遺傳工程方法表明了 GS確實(shí)是玉米籽粒產(chǎn)量(grain yield)的兩個(gè)因素即籽粒數(shù)量和籽粒重量的限制因子。更早的QTL作圖實(shí)驗(yàn)也表明GS同工酶決定了產(chǎn)量和NUE(Gallais和Hirel，(2004) J Exp Bot. 55(396) 295-306)。在其他的實(shí)驗(yàn)中，兩種位于1號(hào)染色體上的GS基因，其中包括一種在根中表達(dá)的基因，在N施用量為ImM和5mM時(shí)表現(xiàn)出與生物量的顯著相關(guān)性(p = 10_4)(數(shù)據(jù)未示出)。 在葉衰老期，從資源組織(葉)到儲(chǔ)存組織(發(fā)育中的籽粒)(sink tissue)中都會(huì)發(fā)生N 的再活化(remobilization)。蛋白質(zhì)降解為氨基酸，所述氨基酸再通過韌皮部被運(yùn)輸至儲(chǔ)存組織。在玉米成熟期時(shí)，籽粒蛋白占植物總含氮量的約60-70%，這意味著仍有30-40% 的N保留在植物的莖葉中。本發(fā)明致力于在不同啟動(dòng)子的控制下在玉米中超表達(dá)胞質(zhì)溶膠GS同種型，從而改善NUE并由此改善籽粒產(chǎn)量。發(fā)明概述本發(fā)明提供了本發(fā)明的GS序列的多核苷酸、相關(guān)多肽和全部保守性修飾變體。本發(fā)明提供了 GS基因的序列。識(shí)別了 6種擬南芥(Arabidopsis)GS基因、6種玉米GS基因、 4種水稻GS基因、3種高粱GS基因和8種大豆GS基因。表1列出了這些基因以及它們的序列標(biāo)識(shí)號(hào)。表 1
序列標(biāo)識(shí)號(hào)命名SEQ ID NO 1AT1G48470多核苷酸SEQ ID NO 2AT1G48470 多肽SEQ ID NO 3AT1G66200多核苷酸SEQ ID NO 4AT1G66200 多肽SEQ ID NO 5AT3G17820多核苷酸SEQ ID NO 6AT3G17820 多肽SEQ ID NO 7AT5G16570多核苷酸SEQ ID NO 8AT5G16570 多肽SEQ ID NO 9AT5G35630多核苷酸SEQ ID NO 10AT5G35630 多肽SEQ ID NO 11AT5G37600多核苷酸SEQ ID NO 12AT5G37600 多肽SEQ ID NO 13Gm0005x00111多核苷酸SEQ ID NO 14Gm0005x00111 多肽SEQ ID NO 15Gm0015x00387多核苷酸SEQ ID NO 16Gm0015x00387 多肽SEQ ID NO 17Gm0030x00147多核苷酸SEQ ID NO 18Gm0030x00147 多肽
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，選自a.與選自SEQID N0:43、45、47、49、51和53的多核苷酸的全長(zhǎng)序列具有通過使用默認(rèn)參數(shù)的GAP算法測(cè)定的至少80%序列同一性的多核苷酸；其中所述多核苷酸編碼具有GS 調(diào)節(jié)劑功能的多肽；b.編碼選自SEQID NO :44、46、48、50、52和54的多肽的多核苷酸；c.選自SEQID NO :43、45、47、49、51和53的多核苷酸；和d.與(a)、(b)或(c)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
2.重組表達(dá)盒，包括權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在有義方向上與啟動(dòng)子可操作地連接。
3.宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
4.轉(zhuǎn)基因植物，包括權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)盒。
5.權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物。
6.權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為雙子葉植物。
7.權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、 小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、黍、花生、柳枝稷、芒草、黑小麥和可可。
8.來自權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。
9.調(diào)節(jié)植物中的GS的方法，所述方法包括下述步驟a.將重組表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中，所述重組表達(dá)盒包含與啟動(dòng)子可操作地連接的權(quán)利要求1所述的多核苷酸；b.在植物細(xì)胞生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；以及c.從所述植物細(xì)胞再生植物；其中所述植物中的所述GS被調(diào)節(jié)。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、苜蓿、大麥、油菜、可可、棉花、黍、芒草、花生、水稻、黑麥、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麥和小麥。
11.降低植物細(xì)胞中GS酶多肽活性的方法，包括a.提供包含SEQID N0:43、45、47、49、51和53的互補(bǔ)體的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；b.提供具有包含SEQID NO :43、45、47、49、51和53所示序列的mRNA的植物細(xì)胞；c.將步驟(a)的核苷酸序列引入所述植物細(xì)胞中，其中所述核苷酸序列抑制所述mRNA 在所述植物細(xì)胞中的表達(dá)。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述單子葉植物為玉米、大豆、苜蓿、大麥、油菜、可可、棉花、黍、芒草、花生、水稻、黑麥、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麥或小麥。
14.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
15.權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物中所述GS酶活性得以提高。
16.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有提高的幼苗活力。
17.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的抽絲增強(qiáng)。
18.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物在根中具有增強(qiáng)的氮同化作用。
19.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有提高的每株植物的種子數(shù)。
20.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有增高的種子大小和質(zhì)量。
21.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的種子中胚的大小增加。
22.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物在葉中具有增強(qiáng)的氮同化作用。
23.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有增加的穗大小。
24.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有增強(qiáng)的氮利用效率。
25.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物在衰老期具有增加的氮再活化作用。
26.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物在籽粒發(fā)育期具有增加的氮再活化作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了蛋白GS的多核苷酸和相關(guān)多肽。本發(fā)明提供了GS基因的基因組序列。GS負(fù)責(zé)控制植物的氮利用效率。提供了谷氨酰胺合酶序列，用于改善籽粒產(chǎn)量和植物生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供了重組表達(dá)盒、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102197137SQ200980143100
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者卡恩沃帕爾·杜卡, 拉杰烏·庫帕塔 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司