專利名稱：檸條erf轉(zhuǎn)錄因子及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物ERF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，其功能是提高植物的抗逆性， 屬于植物生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
各種非生物脅迫包括干旱、鹽漬、低溫等非生物逆境脅迫，是制約農(nóng)作物、林草和 蔬菜等生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。我國(guó)的干旱、半干旱耕地共計(jì)5. 7億畝，占全國(guó)耕地面積的 38%，我國(guó)每年因缺水造成糧食減產(chǎn)700-800億公斤。培育和推廣抗逆植物品種是提高其 產(chǎn)量與質(zhì)量，保證國(guó)家糧食安全和改善生態(tài)環(huán)境的最有效途徑。雖然利用植物自身抗病基 因和一些抗逆相關(guān)基因，在抗逆育種方面取得了一些進(jìn)展。但目前可利用的抗逆相關(guān)基因 資源有限，并且存在著抗逆品種不理想等問題，難以滿足目前生產(chǎn)與生態(tài)改良的需求。近 年來，有關(guān)植物抗逆反應(yīng)機(jī)制特別是相關(guān)反應(yīng)途徑研究的進(jìn)展以及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā) 展，為運(yùn)用基因工程手段提高植物抗病性與抗逆性展示出誘人的前景。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中發(fā)生了一系列應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物逆境脅迫的反應(yīng)機(jī) 制，以保證其生長(zhǎng)發(fā)育。大量研究結(jié)果表明，植物能通過基因感知和識(shí)別逆境脅迫信號(hào)，然 后啟動(dòng)級(jí)聯(lián)式的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列下游的具有功能的抗逆基因表達(dá)。生物體 的細(xì)胞能夠?qū)ν饨绛h(huán)境條件的變化做出相應(yīng)的反應(yīng)，在植物中，AP2/EREBP家族中的ERF類 轉(zhuǎn)錄因子能夠接受環(huán)境脅迫信號(hào)，啟動(dòng)一系列脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)逆境 的耐受力。檸條是能在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的干旱沙漠地區(qū)生長(zhǎng)的灌木建群樹種，在 我國(guó)“三北”地區(qū)廣泛分布。作為天然的抗逆性極強(qiáng)的典型植物，檸條的抗逆性已引起國(guó)際 學(xué)術(shù)界的重視。研究、開發(fā)和利用檸條抗逆性基因資源，對(duì)于深入研究植物抗逆性機(jī)理以及 定向培育抗逆植物新品種具有重要的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檸條中的一種與抗逆性相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因， 該轉(zhuǎn)錄因子首次在檸條中克隆，該基因的表達(dá)受干旱、寒冷誘導(dǎo)在抗寒和抗旱反應(yīng)中具有 調(diào)控作用。本發(fā)明所提供的ERF類轉(zhuǎn)錄因子來源于檸條，是EREB家族中的一個(gè)，是具有與序 列表3氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者是將序列表3氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或者幾 個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與序列表3氨基酸殘基相同活性衍生的蛋白質(zhì) 序列，表中序列氨基酸殘基序列是由256個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約28. 8KD，等 電點(diǎn)9. 37?；蛉L(zhǎng)1343，開放閱讀框從222bp到995bp計(jì)774bp，如序列表1所述是基因 的全長(zhǎng)序列，序列表2是完整編碼框。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之點(diǎn)在于(1)首次從擰條中克隆了 ERF基因；(2)經(jīng)過BLAST，該轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥ERF的氨基酸相似性47%，該蛋白含有ERF/AP2DNA結(jié)合域，是一個(gè)新ERF基因。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、擰條葉片全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建檸條植株栽培在培養(yǎng)缽中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)60天，進(jìn)行干旱處理，至全株出現(xiàn) 萎蔫取幼嫩葉片于液氮中速凍、研磨，TRIzole抽提總RNA，溶于水中。經(jīng)mRNA純化試劑盒 處理得到mRNA。取mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后再合成第二鏈。均一化后與pDNR-LIB載體 連接(具體步驟詳見 Creator SMART cDNA Library Construction Kit (ClontechCat. No. 634903)。實(shí)施例2、cDNA文庫的隨機(jī)EST測(cè)序從文庫中隨機(jī)選取3000個(gè)單克隆進(jìn)行5'端EST測(cè)序，將測(cè)序成功的序列進(jìn)行 BLAST,選擇與經(jīng)驗(yàn)證抗旱相關(guān)基因相似的EST。實(shí)施例3選擇經(jīng)BLAST與抗旱相關(guān)的EST，將它們對(duì)應(yīng)的克隆測(cè)通，得到候選抗逆 基因的全長(zhǎng)DNA序列。實(shí)例4ERF基因的干旱誘導(dǎo)表達(dá)取干旱處理的檸條葉片提取RNA,同時(shí)提取正常生長(zhǎng)的葉片提取RNA為對(duì)照，反轉(zhuǎn) 錄成⑶NA，根據(jù)本發(fā)明的序列2設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物引物1為5 ‘ CTCAACTTCCCTAAACTCCG 3'；引物 2 為 5‘ TCAGCCAAGCCTTCACAA 3‘該引物對(duì)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為157bp的核苷酸片段，以SYBR GREENI作為熒光染料，用 Roche LightCycler 480進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析，采用2_AGt法發(fā)現(xiàn)干旱誘導(dǎo)下本發(fā)明所 涉及的基因的表達(dá)比對(duì)照提高5倍，足以證明其在抗旱中可發(fā)揮重要作用。序列1ERF基因的全長(zhǎng)DNAGGGTAAAAACTTACTATAGGGCGCTAGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCAGTCGACGGTACCGGACATATGCCCG
GGAATTCGGCCATTACGGCCGGGGAACCAACTAACCCTCTCTCTCCACACCACCACAAAGTACCTTTAATTTAGAATTATGCAAACCTTTGAATCAAGCTTCAATTTTTGCACCTCAAACAATAATCCCCTAGAAATTCAAAGTTCAATTTCAGAAAGCCTCAATTTTAGCATGCCACCACCAAACAATAATTCTTGTTCAACCCACACCCAATTTCAAATCCCTCAAACCTCTTTCTCCAAACCTCCAAGATCATCCTCAAACCTAAGCAACCGCAAACCCTCCTTGAACATCACAATCCCTTCCATAACCAAAGCCCTCTCACAAAACATGGAAAAAACCATTAATTACAATCAAAGTTTATCTTTAGATCACAGTGGCAACACCACCAACAACAAAGAGGATAAGCACTATAGAGGTGTTAGAAGGAGACCATGGGGAAAATTTGCTGCAGAAATACGTGACCCTAATAGAAAAG
GGTCAAGAGTGTGGCTTGGAACATTTGACACAGCAATAGAAGCTGCAAAAGCTTATGATAGAGCTGCTTTTAAGATGAGAGGAAGCAAAGCCATACTGAATTTCCCTTTAGAAGTTGCCGATTCTGAAGAATATTCAGTTTCTAGAAGCATCAATATTGGAGAGAAGAGGAAAAGAGATATTGAAGAGA
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GTGAAGGGAATAATAATAATAATAAGAAGAAGAAGAAGCAGGTGAAGAAGGAAGAGTGTTCACCAGCAACAACAGTTTGTCCTTTGACTCCTTCATGTTGGAAAGGGTTTTGGGATACTGATGTCATTGGAACTATCTTTAGCGTACCTCCTTTGTCACCTTTATCTCCACTCATGGTTGTTTGAGGTTATGATGGCCCTTTTACTCTTTCAGTGATGTTTTGAGATTATGGAGGTGCAAATAGCAACCTCCTTAAGGCTTGACTATAGCACAAGTAAAGAAAC
ATGGAGGGAGATGATGGTAGTTATCCTCTCTGACTTTGCTTCACTTATTAGTTATTATTGAAATAGGAGTGTTAATAGTATATTTTTGCAGCTGGTTTTAGTGTAAATATAGGAGAGTTTGAAGCTAGATATTTTTTTTTTTATTTCTAAAATTTTATAATGTTTGTTTATTTCCCTTGTTTATGTTCATTTGGTCAGAGAATATTGAAATTTGATTATTCGTTTATTGGATAAAAAAAAAAAAAAAAA序列2基因的編碼區(qū)ATGCAAACCTTTGAATCAAGCTTCAATTTTTGCACCTCAAACAATAATCCCCTAGAAATTCAAAGTTCAATTTCAGAAAGCCTCAATTTTAGCATGCCACCACCAAACAATAATTCTTGTTCAACCCACACCCAATTTCAAA
TCCCTCAAACCTCTTTCTCCAAACCTCCAAGATCATCCTCAAACCTAAGCAACCGCAAACCCTCCTTGAACATCACAATCCCTTCCATAACCAAAGCCCTCTCACAAAACATGGAAAAAACCATTAATTACAATCAAAGTTTATCTTTAGATCACAGTGGCAACACCACCAACAACAAAGAGGATAAGCACTATAGAGGTGTTAGAAGGAGACCATGGGGAAAATTTGCTGCAGAAATACGTGACCCTAATAGAAAAGGGTCAAGAGTGTGGCTTGGAACATTTGACACAGCAATAGAAGCTGCAAAAGCTTATGATAGAGCTGCTTTTAAGATGAGAGGAAGCAAAGCCATACTGAATTTCCCTTTAGAAGTTGCCGATTCTGAAGAATATTCAGTTTCTAGAAGCATCAATATTGGAGAGAAGAGGAAAAGAGATATTGAAGAGAGTGAAGGGAATAATAATAATAATAAGAAGAAGAAGAAGCAGGTGAAGAAGGAAGAGTGTTCACCAGCAACAACAGTTTGTCCTTTGACTCCTTCATGTTGGAAAGGGTTTTGGGATACTGATGTCATTGGAACTATCTTTAGCGTACCTCCTTTGTCACCTTTATCTCCACTCATGGTTGTTTGA序列3基因編碼的氨基酸序列“ MQTFESSFNFCTSNNNPLEIQSSISESLNFSMPPPNNNSCSTHTQFQIPQTSFSKPPRSSSNLSNRKPSLNITIPSITKALSQNMEKTINYNQSLSLDHSGNTTNNKEDKHYRGVRRRPWGKFAAEIRDPNRKGSRVWLGTFDTAIEAAKAYDRAAFKMRGSKAILNFPLEVADSEEYSVSRSINIGEKRKRDIEESEGNNNNNKKKKKQVKKEECSPATTVCPLTPSCWKGFWDTDVIGTIFSVPPLSPLSPLMVV.“
權(quán)利要求
檸條的ERF類轉(zhuǎn)錄因子，它具有與序列表中序列3的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代，缺失或添加且具有與序列3的氨基酸殘基序列相同活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
2.檸條ERF轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，序列表中序列1的DNA序列，包括該基因的全部序列 及部分序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
3.序列表中序列2的DNA序列是基因的讀碼框，是權(quán)利要求的重點(diǎn)。
4.將序列表中序列1限定的DNA序列作適當(dāng)突變或偏愛密碼子改造后的基因，編碼相 同功能蛋白質(zhì)，亦在本專利權(quán)利要求之內(nèi)。
5.權(quán)利要求2所述的基因，其開放閱讀框是自5’端第222到第995位堿基。
6.含有權(quán)利要求3所述的基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3所述的基因的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求2所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了檸條((Caragana korshinskii)的一個(gè)干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ERF及其基因。該基因全長(zhǎng)1343bp，包括一個(gè)774bp開放閱讀框，編碼產(chǎn)物為由256個(gè)氨基酸殘基組成的干旱誘導(dǎo)的ERF類轉(zhuǎn)錄因子，具有EREB/DNA結(jié)合區(qū)，能與一些干旱相關(guān)下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域的干旱反應(yīng)元件相結(jié)合，從而調(diào)控耐旱、耐寒相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，是植物耐旱機(jī)制的關(guān)鍵元件。該基因與擬南芥ERF基因的氨基酸序列相似性為47％，如構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體，并將此耐旱基因?qū)敫黝愔参镏?，將可以提高植物的抗旱耐寒性能?br> 文檔編號(hào)A01H5/00GK101863967SQ20091025037
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者喬慧蕾, 孫國(guó)琴, 李曉東, 白晨, 郭九峰 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院