專(zhuān)利名稱(chēng)：一種改良麥類(lèi)作物耐低氮性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及以種子作為繁殖方式的麥類(lèi)作物的耐低氮性 狀的改良方法。
背景技術(shù)：
小麥和大麥?zhǔn)鞘澜缟隙蠊阮?lèi)作物，小麥?zhǔn)俏覈?guó)的主要糧食作物，大麥?zhǔn)侵圃炱?酒的主要原料，也是優(yōu)良飼料。氮素是作物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，為了保證了作物高產(chǎn)和穩(wěn) 產(chǎn)，就必須大量施用氮肥。近年來(lái)，隨著氮肥的大量使用，在促進(jìn)作物增產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的同時(shí)，也 帶來(lái)了諸多弊端，如經(jīng)濟(jì)效益下降、氮肥利用率降低、環(huán)境污染等等，不僅造成了巨大的經(jīng) 濟(jì)損失，而且嚴(yán)重污染了環(huán)境，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了潛在的威脅。啤酒大麥要求籽粒蛋白質(zhì)含 量的優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為10% 12%，但生產(chǎn)上往往為了追求產(chǎn)量而增大氮肥施用量或生育中后 期重施追肥，結(jié)果籽粒蛋白質(zhì)含量超標(biāo)，因而降低了制啤質(zhì)量。因此，培育新的耐低氮作物、 提高作物的耐低氮性研究顯得日益重要。以種子作為繁殖方式的禾谷類(lèi)作物，小麥的耐低氮性較差，大麥的耐低氮性一般， 培育耐低氮新品種是克服上述問(wèn)題的主要途徑。在缺乏耐低氮種質(zhì)資源的情況下，麥類(lèi)作 物的耐低氮育種的策略主要建立在種質(zhì)創(chuàng)新和加快有效基因積累的基礎(chǔ)上。目前通常利用 各類(lèi)誘變手段，使供試材料發(fā)生變異，通過(guò)低氮脅迫篩選選育出耐低氮新種質(zhì)；通過(guò)雜交育 種方法，使位于不同品種中的耐低氮基因聚合到一個(gè)材料上，通過(guò)耐低氮脅迫，篩選出耐低 氮新品種。因此。低氮脅迫的篩選和耐低氮基因的聚合效率在很大程度上決定了種質(zhì)創(chuàng)新 和新品種培育的效果。小孢子培養(yǎng)是真正意義上的單倍體細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)低氮脅迫的反應(yīng)更為敏感，在小 孢子培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行低氮脅迫，可以對(duì)雜交后代中豐富多樣的小孢子重組體進(jìn)行篩選，存 活的耐低氮的小孢子形成胚狀體，在胚狀體的萌發(fā)過(guò)程中進(jìn)行進(jìn)一步的低氮脅迫。小孢子 在低氮脅迫下經(jīng)過(guò)脫分化與分化二個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育程序再生成株，經(jīng)過(guò)染色體加倍后其攜 帶的所有基因均一次性純合，成為加倍單倍體植株，收獲種子后即成遺傳穩(wěn)定的株系。通過(guò) 該技術(shù)二年內(nèi)就可以獲得耐低氮性提高的純合株系。本領(lǐng)域仍需要獲得以種子作為繁殖方式的麥類(lèi)作物耐低氮性狀的種質(zhì)材料，在我 國(guó)貧瘠土上能夠大量種植，有效利用有限資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)麥類(lèi)作物中現(xiàn)有種質(zhì)材料中缺乏耐低氮材料的不足，提供一種新的麥 類(lèi)耐低氮株系的獲得及離體篩選的方法，且篩選條件易于統(tǒng)一控制，不受外界自然條件的 限制。因此，本申請(qǐng)第一方面提供一種改良麥類(lèi)作物耐低氮性狀的方法，該方法包括1)取麥類(lèi)作物孕穗期花藥游離小孢子，置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L的不含無(wú)機(jī)氮源的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀體；
2)將步驟1)所得的胚狀體置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L的 不含無(wú)機(jī)氮源2/3MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取再生植株；和3)將再生植株置于添加NAA 0. 03 1. 00mg/L、多效唑3. 0 10. Omg/L和蔗糖 10 40g/L，pH5. 5 6. 2的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、葉完整 的再生植株；由此獲得具備耐低氮性狀的再生植株。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述麥類(lèi)作物是大麥和小麥。在一優(yōu)選實(shí)施例中，步驟1)、2)中所述不含無(wú)機(jī)氮源指不含KNO3和(NH4)2S04。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基還添加有2，4，5_Τ 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 3 0. 8mg/L 和麥芽糖 70 120g/L。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述2/3MS分化培養(yǎng)基6-BA 0. 3 0. 8mg/L、KT 1 ang/L、 NAA 0. 02 0. 08mg/L 和麥芽糖 10 50g/L。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法還包括4)將步驟幻所得再生植株培養(yǎng)成為完整植株，移栽生長(zhǎng)至成熟，獲取成熟后的種 子；5)培養(yǎng)所收獲的種子，獲取幼苗，去胚乳后用按Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液配方配制的營(yíng) 養(yǎng)液于15士5°C培養(yǎng)，培養(yǎng)在正常供氮和1/4供氮2個(gè)水平下進(jìn)行，3-5周后收苗，從而獲得 耐低氮株系。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述正常供氮以1 1. 8mmol/L的濃度供氮，所述1/4供氮中 氮的濃度為正常供氮水平的1/4。本申請(qǐng)另一方面還包括用于實(shí)施本申請(qǐng)方法的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基 和1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。用于權(quán)利要求1所述方法的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加有谷 氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，且不含無(wú)機(jī)氮源。用于權(quán)利要求1所述方法的2/3MS分化培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中 MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變，所述2/3MS分化培養(yǎng)基 添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，且不含無(wú)機(jī)氮源。用于權(quán)利要求1所述方法的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 其中MS培養(yǎng)基的大量元素減半，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變。本申請(qǐng)?jiān)僖环矫孢€包括含有本申請(qǐng)所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基和/或 1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基的套盒。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)涉及一種改良麥類(lèi)作物耐低氮性狀的方法，該方法包括1)取麥類(lèi)作物孕穗期花藥游離小孢子，收集后置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各 400 800mg/L的無(wú)KNO3和(NH4)2SO4的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀體；2)將步驟1)所得的胚狀體置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L的 無(wú)KNO3和NH4NO4的2/3MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取再生植株；和3)再生植株置于添加NAA 0. 03 1. 00mg/L、多效唑(MET) 3. 0 10. 0mg/L和蔗糖10 40g/L，pH5. 5 6. 2的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、葉完整的再生植 株。在實(shí)施本申請(qǐng)時(shí)，可從大田選取中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗子， 放入冰箱冷藏10 25天左右，例如冷藏15天左右。接種前消毒穗子?？刹捎贸Ｒ?guī)的方法消毒，例如飽和的漂白粉溶液消毒15min。然 后用無(wú)菌水沖洗2 4次。每個(gè)試管接5 15個(gè)穗子(例如大約10個(gè)穗子)，倒入10 25ml 含有甘露醇 50 70g/L (優(yōu)選 55,60 或 65g/L)、CaCl2O. 9 1. 3g/L (優(yōu)選 1. lg/L)、 MES 0. 95 1. Og/L (優(yōu)選0. 976g/L)的提取液，用高速分散器超速旋切(2500 4000rpm， 優(yōu)選3000rpm)，150目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液以600 800rpm(優(yōu)選800rpm)低速離心，重復(fù)幾次 (例如3次左右)，收集小孢子。小孢子用提取液于室溫(優(yōu)選25V )、黑暗預(yù)處理2 3 天。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以不含無(wú)機(jī)氮源的N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有谷氨酰胺和水解 干酪素各400 800mg/L，pH 5. 5 6. 2。培養(yǎng)前將小孢子用培養(yǎng)基洗滌1 2次，然后用 該培養(yǎng)基將小孢子密度調(diào)節(jié)至1. 0 1. 2X 105/ml，取約1 2ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng) 皿(例如，30X 15mm)，Parafilm封口，室溫(例如25°C )暗培養(yǎng)15 25天。在一具體實(shí)施例中，所述N6培養(yǎng)基中不含有KNO3和(NH4) 2S04。N6培養(yǎng)基中還可添加有2，4，5-T 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 3 0. Sng/L和麥芽糖 70 120g/L。N6培養(yǎng)基中所含的2，4，5-T較佳為0. 8 1. 2mg/L,更佳為約1. Omg/L。KT 較佳為 0. 4 0. 6mg/L，更佳為約 0. 5mg/L。麥芽糖較佳為80 100g/L，優(yōu)選為90g/L。谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，更佳為約500 600mg/L。pH優(yōu)選為約5. 6 5. 8。2,4, 5-T可用2，4-D代替，濃度為0. 5 1. 5mg/L，優(yōu)選為0. 8 1. 2mg/L,更佳為 約 1. Omg/L?；蛘呖赏瑫r(shí)使用2，4，5-T和2，4-D，兩者的總濃度范圍為0. 5 1. 5mg/L，優(yōu)選為 0. 8 1. 2mg/L,更佳為約 1. 0mg/L。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，培養(yǎng)基N6的配方為如下表1所示(單位mg/L)表 1N6大量元素CaCl2 · 2H20MgSO4 · 7H20KH2PO4N6微量元素H3BO3KIMnSO4 · 4H20ZnSO4 · 7H20N6 鐵鹽
166 185 400
1. 6 0. 83 5. 0 1. 5
Na2EDTA37. 3
FeSO4 · 7H2027. 8
N6有機(jī)元素
鹽酸硫胺素1. 0
鹽酸吡多辛0. 5
甘氨酸2. 0
煙酸0. 5
肌醇100. 0
N6培養(yǎng)基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)成品，然后按
照上述配方添加所需的成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對(duì)上述表1所示的濃度作出適當(dāng) 的變動(dòng)，例如有大約5% (例如3%左右、2%左右、左右，或更低的變動(dòng)范圍)或更低的 變動(dòng)，由此配制得到的培養(yǎng)基仍然具有所需的生物學(xué)功能，仍能用于實(shí)施本發(fā)明。例如，以 肌醇為例，每升N6培養(yǎng)基中可含有大約95 105mg的肌醇(5%的變動(dòng)幅度)。其它成分 的濃度也如此變動(dòng)。此外，N6培養(yǎng)基中的成分也可使用功能和性質(zhì)相同或相似的成分加以 替換。誘導(dǎo)培養(yǎng)后將胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基以無(wú)KNO3和NH4NO4的 2/3MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中加有谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，PH為5. 5 6. 2。 在25士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下分化脅迫培養(yǎng)25 30天，直至分化出綠色再 生植株。分化培養(yǎng)基中還可添加有6-BA 0. 3 0. ang/L、KT 1 2mg/L、NAA 0. 02 0. 08mg/L 和麥芽糖 10 50g/L。6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)的濃度優(yōu)選為0. 4 0. 6mg/L,更優(yōu)選為約0. 5mg/L。KT (6-糠氨基嘌呤)的濃度優(yōu)選為1. 2 1. 8mg/L,更優(yōu)選為約1. 5mg/L。NAA (萘乙酸)的濃度優(yōu)選為0. 04 0. 06mg/L,更優(yōu)選為約0. 05mg/L。麥芽糖的濃度優(yōu)選為20 40g/L，更優(yōu)選為約30g/L。谷氨酰胺和水解干酪素的濃度優(yōu)選分別為400 500mg/L，更優(yōu)選分別為400mg/ L0培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約為5. 6 5. 8。選取分化出的再生植株，轉(zhuǎn)入添加有多效唑(MET) 3. 0 10. Omg/L和蔗糖10 30g/L，pH5. 5 6. 2的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在25士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件 下進(jìn)行25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。該V2MS生根壯苗培養(yǎng)基中，NAA的優(yōu)選濃度為0. 03 0. lmg/L,更優(yōu)選濃度為 0. 05mg/L。MET的濃度優(yōu)選為4. O 6. Om/L,更優(yōu)選為約5. Omg/L。蔗糖的濃度優(yōu)選分別為 15 25g/L，更優(yōu)選分別為20g/L。pH優(yōu)選為約5. 6 5. 8。經(jīng)過(guò)生根壯苗培養(yǎng)的耐低氮植株成為根莖葉齊全的完整植株，移栽前1天先將培 養(yǎng)瓶打開(kāi)，在實(shí)驗(yàn)室中煉苗。煉苗結(jié)束后，用鑷子小心地把植株從培養(yǎng)瓶中移出，盡量保持 根系的完整，洗去附著的培養(yǎng)基，將苗移入育苗缽中，澆水后用塑料薄膜罩住，保濕2 4天 左右。去掉塑料薄膜后在20士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下生長(zhǎng)至成熟。成熟后的 種子按株收獲。
所收獲的種子用溶液培養(yǎng)法培養(yǎng)。種子先用例如1 % NaClO消毒30分鐘，用清水 沖洗干凈，觀 32°C浸種3 6小時(shí)，室溫例如25 催芽過(guò)夜，露白后播種到經(jīng)高溫 高壓滅菌的蛭石中，兩葉一心時(shí)，挑選整齊一致的幼苗，去胚乳后用海綿條固定在打孔的泡 沫板上，然后放入盛有清水的周轉(zhuǎn)箱(40CmX27CmX10Cm)中，恢復(fù)兩天后換上營(yíng)養(yǎng)液，每 塊泡沫板上平均分布30個(gè)孔(6X0，每個(gè)處理7 10株。營(yíng)養(yǎng)液配置方法參照Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液配方，設(shè)正常供氮和1/4供氮2個(gè)水平。
正常供氮時(shí)氮的濃度為1 1. 8mmol/L，優(yōu)選 1. 2 1. 6mmol/L，更優(yōu)選 1. 4 1. 5mmol/L,例如可以為約1. 44mmol/L。
1/4供氮時(shí)氮的濃度為正常供氮水平的1/4，例如，當(dāng)正常供氮為1.44mm0l/L時(shí)，1/4 供氮為 0. 36mmol/L0
可以各種形式供氮，例如以NH4NO3形態(tài)供應(yīng)，每周更換一到兩次營(yíng)養(yǎng)液，每天補(bǔ)充水分，調(diào)pH為5. 5 5. 7左右，生長(zhǎng)期間溫度為15士5°C，病、蟲(chóng)害按常規(guī)方法管理，約5周后收苗。收獲的植株先用自來(lái)水沖洗干凈，再用去離子水沖洗，從而可獲得耐低氮株系。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS的配方為如下表2所示(單位mg/L)
表2
MS大量元素
NH4NO41650
KNO31900
CaCl2 · 2H20440
MgSO4 · 7H20370
KH2PO4170
MS微量元素
H3BO36. 2
KI0. 83
MnSO4 · 4H2022. 3
ZnSO4 · 7H208. 6
Na2MoO4 · 2H200. 25
CuSO4 · 5H200. 025
CoCl2 · 6H200. 025
MS鐵鹽
Na2EDTA37. 3
FeSO4 · 7H2027. 8
MS有機(jī)元素
鹽酸硫胺素0. 1
鹽酸吡多辛0. 5
煙酸0. 5
甘氨酸2. 0
肌醇100. 0
MS培養(yǎng)基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)成品，并根據(jù)上述配方加入所需的成分。1/2MS培養(yǎng)基則是將MS培養(yǎng)基的大量元素減半，2/3MS培養(yǎng)基 則是將MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變。1/2MS和2/3MS 培養(yǎng)基的PH通常在5. 4 6. 0的范圍內(nèi)，例如可以是5. 6 5. 8。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對(duì)上述表2所示的濃度作出適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)，例如有大約 5% (例如3%左右、2%左右、左右，或更低的變動(dòng)范圍)或更低的變動(dòng)，由此配制得到的 培養(yǎng)基仍然具有所需的生物學(xué)功能，仍能用于實(shí)施本發(fā)明。例如，以肌醇為例，每升N6培養(yǎng) 基中可含有大約95 105mg的肌醇(5%的變動(dòng)幅度)。其它成分的濃度也如此變動(dòng)。此 外，2/3MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的成分也可使用功能和性質(zhì)相同或相似的成分加以替換。與傳統(tǒng)育種方法相比，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，易于掌握、實(shí)施；耐低氮株系的獲得和耐 低氮性狀的篩選都在實(shí)驗(yàn)室完全一致的條件下進(jìn)行，不受外界條件的影響；利用小孢子作 為起始材料，可獲得大量的胚狀體，在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行耐低氮性狀離體篩選，可嚴(yán)格 篩選，大膽淘汰；整個(gè)過(guò)程都在培養(yǎng)室中進(jìn)行，同時(shí)又降低了勞動(dòng)力和農(nóng)田的使用，且可周 年重復(fù)試驗(yàn)，不斷提供篩選材料，既縮短了育種時(shí)間，又能獲得大量的種質(zhì)材料；采用胚狀 體誘導(dǎo)和再生植株分化二個(gè)階段分別進(jìn)行離體耐低氮篩選，并結(jié)合耐低氮株系種子苗期生 長(zhǎng)過(guò)程中的回復(fù)篩選，篩選結(jié)果真實(shí)可信。申請(qǐng)人:的實(shí)驗(yàn)表明，利用本發(fā)明可在不到二年的時(shí)間內(nèi)完成麥類(lèi)耐低氮株系獲得 及篩選。本發(fā)明可大大縮短育種時(shí)間。所得材料是經(jīng)過(guò)二步脅迫篩選，經(jīng)過(guò)染色體加倍后 耐低氮性狀得以純合、固定，同一株系的后代，表現(xiàn)統(tǒng)一。利用本發(fā)明，在二年時(shí)間內(nèi)，已離 體篩選獲得3份耐低氮株系。因此，本申請(qǐng)另一方面還包括采用本發(fā)明方法獲得的各步驟所產(chǎn)生的胚狀體、最 后所獲得的耐低氮株系等。本申請(qǐng)的麥類(lèi)作物可包括大麥和小麥。本申請(qǐng)還包括用于改良麥類(lèi)作物耐低氮性狀的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根壯
苗培養(yǎng)基。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，不含無(wú)機(jī)氮源，例如KNO3和(NH4) 2S04，而添加 了谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，pH 5. 5 6. 2。N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分如 上述表1所示。所述培養(yǎng)基還可含有2，4，5-T 0. 5 1. 5mg/L、KT 0. 3 0. 8mg/L，和麥芽糖70 120g/L。2，4，5-T的濃度較佳為0. 8 1. 2mg/L，更佳為約1. Omg/L。KT的濃度較佳為0. 4 0. 6mg/L，更佳為約0. 5mg/L。麥芽糖的濃度較佳為80 100g/L，優(yōu)選為90g/L。谷氨酰胺和水解干酪素的濃度更佳為約500 600mg/L。2，4，5-T(2，4，5-三氯苯氧乙酸)可用2，4_D0，4_二氯苯氧基乙酸)代替，濃度為 0. 5 1. 5mg/L，優(yōu)選為 0. 8 1. 2mg/L，更佳為約 1. Omg/L?；蛘呖赏瑫r(shí)使用2，4，5-1~和2，4-0，兩者的總濃度范圍為0.5 1.511^/1，優(yōu)選為 0. 8 1. 2mg/L,更佳為約 1. Omg/L。誘導(dǎo)培養(yǎng)基基的pH優(yōu)選約為5. 6 5. 8。所述分化培養(yǎng)基以不含無(wú)機(jī)氮源(例如KNO3和NH4NO4)的2/3MS為基本培養(yǎng)基，其
8中加有谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，pH為5. 5 6. 2。MS培養(yǎng)基的基本成分如 上表2所示。2/3MS培養(yǎng)基則是將MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī) 元素不變。分化培養(yǎng)基還可含有6-BA0. 3 0. 8mg/L、KT 1 2mg/L、NAA 0. 02 0. 08mg/ L和麥芽糖10 50g/L。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，分化培養(yǎng)基中6-BA的濃度優(yōu)選為0. 4 0. 6mg/L,更優(yōu)選為 約 0. 5mg/L。KT的濃度優(yōu)選為1. 2 1. 8mg/L,更優(yōu)選為約1. 5mg/L。NAA的濃度優(yōu)選為0. 04 0. 06mg/L,更優(yōu)選為約0. 05mg/L。麥芽糖的濃度優(yōu)選為20 40g/L，更優(yōu)選為約30g/L。谷氨酰胺和水解干酪素的濃度優(yōu)選分別為400 600mg/L，更優(yōu)選分別為400mg/ L0分化培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約為5. 6 5. 8。生根壯苗培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加有NAA 0. 03 1. 00mg/L,多效唑 (MET) 3. 0 8. Omg/L 和蔗糖 10 30g/L, ρΗ5· 5 6. 2。NAA的優(yōu)選濃度為0. 03 0. lmg/L,更優(yōu)選濃度為0. 05mg/L。MET的濃度優(yōu)選為4. 0 6. Om/L，更優(yōu)選為約5. Omg/L。蔗糖的濃度優(yōu)選分別為15 25g/L，更優(yōu)選分別為20g/L。生根壯苗培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約5. 6 5. 8。須知，可對(duì)表1和2中所示的成分作出適當(dāng)?shù)淖儎?dòng)，只要由此變動(dòng)得到的培養(yǎng)基仍 發(fā)揮與原始培養(yǎng)基一樣的作用即可。本申請(qǐng)還包括含有本申請(qǐng)所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基和1/2MS生根壯 苗培養(yǎng)基的套盒。任選地，該套盒還可包括指導(dǎo)使用其中所包含的試劑實(shí)施獲得抗赤霉病 性狀穩(wěn)定的材料的方法的說(shuō)明書(shū)。在一具體實(shí)施例中，所述套盒含有所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2/3MS分化培養(yǎng)基和1/2MS 生根壯苗培養(yǎng)基。在另一具體實(shí)施例中，所述套盒還含有本文所述的提取液，該提取液含有甘露醇 50 70g/L、CaCl2O. 9 1. 3g/L、MES (2-嗎啉乙磺酸)0· 95 1. 0g/L(優(yōu)選 0. 976g/L)。 在一優(yōu)選實(shí)施例中，甘露醇的優(yōu)選濃度為陽(yáng) 65g/L，更優(yōu)選為60 65g/L。CaCl2的優(yōu) 選濃度為1. 0 1. 2g/L，更優(yōu)選為1. lg/L。MES的優(yōu)選濃度為0. 96 0. 99g/L，更優(yōu)選為 0. 97 0. 98g/L。下文將以大麥為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情 況下可對(duì)本發(fā)明做出各種修改和變動(dòng)。且也可采用本發(fā)明的方法用于其它禾谷類(lèi)作物，并 能產(chǎn)生相同的效果。以下實(shí)施例僅僅是闡述性的，本發(fā)明的范圍由本申請(qǐng)的權(quán)利要求加以 限定。如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明所用的百分比為重量體積百分比。此外，應(yīng)理解，上述各培養(yǎng) 基中各成分的優(yōu)選范圍可任意組合，只要其能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的即可。實(shí)施例實(shí)施例1 大麥小孢子的耐低氮脅迫培養(yǎng)以“花30”為供試材料，從大田選取中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗 子，放入冰箱冷藏15天。接種時(shí)，穗子用飽和的漂白粉溶液消毒15min，無(wú)菌水沖洗3 4次。每個(gè)試管接10個(gè)穗子，倒入15ml甘露醇60g/L、CaCl2l. lg/L、MES 0. 976g/L的提取液， 用3000rpm的高速分散器超速旋切，150目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液以SOOrpm低速離心，重復(fù)3次， 收集小孢子。小孢子用提取液于25°C、黑暗預(yù)處理2d。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以無(wú)1(而3和(NH4)2SO4 的N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有2，4，5-T 1.0mg/L、KT 0. 5mg/L，麥芽糖90g/L，谷氨酰 胺和水解干酪素各600mg/L，pH 5.8。培養(yǎng)前將小孢子用培養(yǎng)基洗滌1次，然后用培養(yǎng)基將 小孢子密度調(diào)節(jié)至1. 0 1. 2X 105/ml，取1. 5ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(30 X 15mm)， Parafilm 封口，25°C暗培養(yǎng) 2Id。實(shí)施例2 耐低氮再生植株的獲取誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后將胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基以無(wú)KNOjPNH4NO4的 2/3MS 為基本培養(yǎng)基，其中加有 6-BA 0. 5mg/L、KT 1. 5mg/L、NAAO. 05mg/L 和麥芽糖 30g/L， 谷氨酰胺和水解干酪素各400mg/L，PH為5. 8。在25 士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件 下分化脅迫培養(yǎng)25 30天，直至分化出綠色再生植株。實(shí)施例3 耐低氮再生植株的生根培養(yǎng)選取分化出的再生植株，轉(zhuǎn)入添加谷氨酰胺和水解干酪素各400mg/L、多效唑 (MET) 5. Omg/L和蔗糖20g/L, ρΗ5· 8的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在25士 1°C，每天10 12 小時(shí)光照的條件下進(jìn)行25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。實(shí)施例4 耐低氮植株的移栽及種子收獲經(jīng)過(guò)生根壯苗培養(yǎng)的耐低氮植株成為根莖葉齊全的完整植株，移栽前1天先將培 養(yǎng)瓶打開(kāi)，在實(shí)驗(yàn)室中煉苗。煉苗結(jié)束后，用鑷子小心地把植株從培養(yǎng)瓶中移出，盡量保持 根系的完整，洗去附著的培養(yǎng)基，將苗移入育苗缽中，澆水后用塑料薄膜罩住，保濕3d。去掉 塑料薄膜后在20 士 1°C，每天10 12小時(shí)光照的條件下生長(zhǎng)至成熟。成熟后的種子按株收獲。實(shí)施例5 耐低氮株系的苗期篩選溶液培養(yǎng)法的種子用NaClO消毒30分鐘，用清水沖洗干凈，30°C浸種5 小時(shí)，25 °C催芽過(guò)夜，露白后播種到經(jīng)高溫高壓滅菌的蛭石中，兩葉一心時(shí)，挑選整齊 一致的幼苗，去胚乳后用海綿條固定在打孔的泡沫板上，然后放入盛有清水的周轉(zhuǎn)箱 (40cmX27cmX10cm)中，恢復(fù)兩天后換上營(yíng)養(yǎng)液，每塊泡沫板上平均分布30個(gè)孔(6X5)， 每個(gè)處理7 10株。營(yíng)養(yǎng)液配置方法參照Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液配方，設(shè)正常供氮(1. 44mmol/ L)和1/4供氮(0. 36mmol/L) 2個(gè)水平，以NH4NO3形態(tài)供應(yīng)，每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液，每天補(bǔ)充 水分，調(diào)PH為5. 5左右，生長(zhǎng)期間溫度為15士5°C，病、蟲(chóng)害按常規(guī)方法管理，5周后收苗。收 獲的植株先用自來(lái)水沖洗干凈，再用去離子水沖洗，測(cè)定株高和根長(zhǎng)，然后分成地上部和根 兩部分，分別在105°C下殺青30分鐘，70°C下烘至恒重，測(cè)定莖葉和根的干物質(zhì)重量。實(shí)施例6按實(shí)施例1收集大麥品種“花30”的小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體，按實(shí)施例2獲取耐低 氮的再生植株，按實(shí)施例3進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，按實(shí)施例4移栽并收獲種子，收獲后的種子 按實(shí)施例5進(jìn)行進(jìn)一步的耐低氮株系篩選。以原始材料的種子作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行耐低氮苗期篩選。實(shí)驗(yàn)證明，在含1/4N的營(yíng)養(yǎng)液中，3份耐低氮株系自交一代株高下降率在 22. 89% 沘.32%、主根長(zhǎng)度下降率10. 99% 25. 12%、莖葉干重下降率在33. 96 % 36. 44%、根干重下降率在31. 45% 39. 58%，而起始材料花30的株高下降率為37. 35%, 主根長(zhǎng)度下降率36. 25%、莖葉干重下降率為58. 19%、根干重下降率為61.66%。由此可 見(jiàn)，篩選出的株系較原始品種的耐低氮性狀十分明顯。結(jié)果見(jiàn)下表3。表3中，下降率=(正常供氮-1/4供氮)/正常供氮X 100%。實(shí)施例7以大麥品系“BI-49”為供試材料，按實(shí)施例1獲得胚狀體，按實(shí)施例2獲得再生植 株，按實(shí)施例3獲得生根的再生植株，按實(shí)施例4收獲種子，按實(shí)施例5進(jìn)行苗期篩選，獲得 2個(gè)耐鹽株系，結(jié)果見(jiàn)表4。表4中，下降率=(正常供氮-1/4供氮)/正常供氮X 100%。
權(quán)利要求
1.一種改良麥類(lèi)作物耐低氮性狀的方法，該方法包括1)取麥類(lèi)作物孕穗期花藥游離小孢子，置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L的不含無(wú)機(jī)氮源的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取胚狀體；2)將步驟1)所得的胚狀體置于添加谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L的不含 無(wú)機(jī)氮源的2/3MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取再生植株；和3)將再生植株置于添加NAA0. 03 1. 00mg/L、多效唑3. 0 10. Omg/L和蔗糖10 40g/L, pH5. 5 6. 2的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲取根、莖、葉完整的再生植株；由此獲得具備耐低氮性狀的再生植株。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述麥類(lèi)作物是大麥和小麥。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述不含無(wú)機(jī)氮源指不含KNO3和 (NH4)2SO40
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基還添加有2，4，5-T0.5 1. 5mg/L、KT 0. 3 0. 8mg/L 和麥芽糖 70 120g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述2/3MS分化培養(yǎng)基還添加有6-BA 0. 3 0. 8mg/L、KT 1 2mg/L、NAA 0. 02 0. 08mg/L 和麥芽糖 10 50g/L。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括4)將步驟幻所得再生植株培養(yǎng)成為完整植株，移栽生長(zhǎng)至成熟，獲取成熟后的種子；5)培養(yǎng)所收獲的種子，獲取幼苗，去胚乳后用按Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液配方配制的營(yíng)養(yǎng)液 于15士5°C培養(yǎng)，培養(yǎng)在正常供氮和1/4供氮2個(gè)水平下進(jìn)行，3-5周后收苗，從而獲得耐低 氮株系。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述正常供氮以1 1.8mmol/L的濃度供 氮，所述1/4供氮中氮的濃度為正常供氮水平的1/4。
8.用于權(quán)利要求1所述方法的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，且不含無(wú)機(jī)氮源。
9.用于權(quán)利要求1所述方法的2/3MS分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以MS培養(yǎng) 基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變， 且所述2/3MS分化培養(yǎng)基添加有谷氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L，且不含無(wú)機(jī)氮 源。
10.用于權(quán)利要求1所述方法的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中MS培養(yǎng)基的大量元素減半，且所述2/3MS分化培養(yǎng)基添加有谷 氨酰胺和水解干酪素各400 800mg/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種麥類(lèi)作物耐低氮性狀改良的方法，該方法包括在小孢子離體培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)、胚狀體的分化培養(yǎng)階段分別給予有機(jī)氮的低氮脅迫篩選，獲得再生植株。本發(fā)明的單倍體細(xì)胞水平有機(jī)氮低氮脅迫篩選所獲得耐低氮性提高的再生植株的所有性狀可以一次性純合，提高了耐低氮育種的效率。本發(fā)明實(shí)施方法簡(jiǎn)便，易于掌握，整個(gè)篩選過(guò)程都在實(shí)驗(yàn)室完全一致的可控條件下進(jìn)行，使結(jié)果真實(shí)可靠。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102106258SQ20091020060
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者何婷, 王亦菲, 陸瑞菊, 陳志偉, 黃劍華 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？屏⑻剞r(nóng)科(集團(tuán))有限公司, 上海綠劍農(nóng)業(yè)科技有限公司