專利名稱：一種篩選麥類作物耐赤霉病菌毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及以種子作為繁殖方式的麥類作物的抗赤 霉病性狀的改良方法。
背景技術(shù)：
小麥是我國人民的主要食糧，大麥是制造啤酒的主要原料。麥類赤霉病不僅能導(dǎo) 致產(chǎn)量嚴重下降，更嚴重的是，由于病原菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等毒素積累于病麥 粒，影響人類健康。由于目前尚缺乏有效的防治技術(shù)，加之化學(xué)防治造成環(huán)境污染，因而，培 育抗性品種是防止麥類赤霉病最有效的方法。國內(nèi)外多年來麥類抗赤霉病育種的實踐表 明，傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)選育高抗材料的效率低，并且需要大量雜交后代群體作依托。所以， 研發(fā)一種有效的實驗室抗赤霉病篩選方法，必將提高大、小麥抗赤霉病育種的效率。國內(nèi)外研究表明，赤霉病菌毒素作為小麥抗赤霉病性的篩選劑已得到肯定(陸維 忠等，2001)，組織水平耐赤霉病毒素的能力與供體植株水平耐赤霉病能力存在明顯的相關(guān) 性(陸維忠，1998)。在不同耐赤霉病類型品種間雜交的Fl小孢子群體中，無疑含有豐富的 抗赤霉病重組配子體。通過適當(dāng)?shù)某嗝共【舅孛{迫篩選，可以選擇獲得多抗源的抗病重 組體(歐陽俊聞，1990 ；Fadel等，1993)。相對于花藥培養(yǎng)而言，游離小孢子培養(yǎng)提供了一個單倍體、單倍體細胞的實驗操 作系統(tǒng)，它對脅迫的反應(yīng)更為敏感，脅迫存活的胚狀體和再生植株所攜抗性基因及所有基 因經(jīng)染色體自然或人工加倍后，全部一次性純合，基因所控性狀遺傳穩(wěn)定性極高。相對傳統(tǒng) 雜交育種的田間選擇而言，本發(fā)明的選擇效率更高，勞動強度大大降低，更易在短時間內(nèi)獲 得抗病性提高的多抗源基因重組體。本發(fā)明依據(jù)的科學(xué)原理是植物細胞全能性理論，植株水平的性狀與細胞水平的 表達存在一致性的理論和植物對逆境的適應(yīng)與抵抗有多種形式，其中通過交叉適應(yīng)獲得抗 逆性是一種普遍而有效的方式的理論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對麥類作物現(xiàn)有種質(zhì)材料中缺乏抗赤霉病品種的不足，提供一種新的麥 類單倍體細胞水平耐赤霉病粗毒素再生株系的獲得及離體篩選的方法，且篩選條件易于統(tǒng) 一控制，不受外界自然條件的限制?；ㄋ幣囵B(yǎng)形成的再生植株基本上源于小孢子脫分化、分化而來，所以在很大程度 上，花藥對脅迫的培養(yǎng)反應(yīng)可以視為小孢子的反應(yīng)。植物對脅迫的反應(yīng)通常存在交叉適應(yīng)。 已有研究證明植物對生物脅迫和非生物脅迫的反應(yīng)之間存在交叉適應(yīng)。NaCl脅迫篩選也是 一種對毒素脅迫存活苗的再次逆境選擇。因此，本申請第一方面提供一種篩選麥類作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，該方法 包括1)取麥類作物幼穗花藥置于添加3. 9X 10_5 1. 95X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素的0. 2-0. 5M甘露醇提取液中培養(yǎng)1-3天；2)由步驟1)處理后的花藥分離獲得小孢子；3)將步驟2)獲得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0. 50-1. 0X10_4mol/L、2，4，5-T 0. 3-0. 8mg/L、KT 0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60_120g/L，pH 5. 5-6. 2 的 N6 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得胚 狀體；4)將步驟 3)獲得的胚狀體置于添加 NaCl 200-500mg/L、6_BA 0. 3-1. 2mg/L, KT 0. 5-2. Omg/L、NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 10_50g/L，PH 為 5. 5-6. 2 的 2/3MS 分化培養(yǎng)基 中，獲得再生植株，該再生植株為耐赤霉病菌粗毒素的麥類作物。在一優(yōu)選實施例中，在所述步驟1)前，先在0_8°C下處理所述麥類作物幼穗花藥 15-30 天。在另一優(yōu)選實施例中，在3_5°C下處理所述麥類作物幼穗花藥20天。在一優(yōu)選實施例中，所述方法還包括5)將步驟4)所得的再生植株轉(zhuǎn)入添加有NAA 0. 02-0. 08mg/L、多效唑 2. 0-10. Omg/L和蔗糖10-40g/L, ρΗ5· 6-6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基中，在25 士 1°C，每天 10 12小時光照的條件下進行25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。在一優(yōu)選實施例中，所述方法包括1)從供體植株上取幼穗在5°C的低溫下處理20d，滅菌后在超凈臺上分離出花藥；2)將步驟1)所得花藥置于添加1. 5X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素的0. 3M甘露醇預(yù) 處理/提取液中培養(yǎng)2d，獲得粗毒素脅迫處理過的花藥；3)將步驟2)獲得的花藥在超凈臺上進行旋切分離，獲得游離小孢子；4)將步驟3)獲得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.75X10_4mol/L、2，4， 5-TO. 5mg/L、KT 0. 5mg/L,麥芽糖90g/L, pH 5. 8的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得胚狀體；5)將步驟 4)獲得的胚狀體置于添加 NaCl 300mg/L、6_BA 0. 5-1. 5mg/L、KT 0. 5-2. Omg/L、NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 30g/L, PH 為 5. 8 的 2/3MS 分化培養(yǎng)基中，獲得 再生植株。在一優(yōu)選實施例中，所述麥類作物選自大麥和小麥。在一優(yōu)選實施例中，步驟1)中所述甘露醇提取液為含有0. 8-1. 6X 10_4mOl/L赤霉 病菌毒素的0. 3-0. 4M甘露醇溶液。在一優(yōu)選實施例中，步驟4)中所述NaCl含量為300_500mg/L。本申請還包括一種用于實施本申請所述的方法的套盒，其特征在于，該套盒含有 本申請所述的甘露醇提取液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或2/3MS分化培養(yǎng)基。在一優(yōu)選實施例中，所述甘露醇提取液為添加3. 9X 10_5 1. 95X 10_4mOl/L赤霉 病菌毒素的0. 2-0. 5M甘露醇提取液。在一優(yōu)選實施例中，所述套盒含有甘露醇提取液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基和2/3MS分化培養(yǎng) 基，所述甘露醇提取液為添加3. 9X 10_5 1. 95X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素的 0. 2-0. 5M甘露醇提取液；所述N6 培養(yǎng)基添加有赤霉病菌毒素 0. 50-1. OX 10Λιο1/1、2，4，5-Τ0· 3-0. 8mg/L、 KT 0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60_120g/L，pH 5. 5-6. 2 ；
所述2/3MS 分化培養(yǎng)基添力Π NaCl 200-500mg/L、6_BA 0· 3-1. 2mg/L、 KTO. 5-2. Omg/L、NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 10_50g/L，pH 為 5. 5-6. 2。
具體實施例方式本申請?zhí)峁┮环N篩選麥類作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，該方法包括1)取幼穗在低溫下處理15-25d，滅菌后在超凈臺上分離出花藥；2)將步驟1)所得花藥置于添加3. 9X 10_5 1. 95X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素的 0. 2-0. 5M甘露醇預(yù)處理/提取液中培養(yǎng)l-3d，獲得粗毒素脅迫處理過的花藥；3)分離步驟2)獲得的花藥，獲得游離小孢子；4)將步驟3)獲得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0. 50-1. OX 10_4mol/L、2，4，5-T 0. 3-0. 8mg/L、KT 0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60_120g/L，pH 5. 5-6. 2 的 N6 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得胚 狀體；5)將步驟 4)獲得的胚狀體置于添加 NaCl 200-500mg/L、6_BA 0. 3-1. 2mg/L, KT 0. 5-2. Omg/L、NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 10_50g/L，PH 為 5. 5-6. 2 的 2/3MS 分化培養(yǎng)基 中，獲得再生植株。實施本申請時，可從大田選取中部小花，其小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗 子，放入冰箱冷藏10-30天，例如15天左右。冷藏的溫度可以在0-8°C范圍之間，例如可以 為3-8°C。通?？稍诩s5 °C冷藏。接種時，穗子先消毒，例如用飽和的漂白粉溶液消毒10-20min，無菌水沖洗2_4 次。每個培養(yǎng)皿中置30-40枚花藥，用含3. 9X 10_5 1. 95X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素 的0. 2-0. 5M的甘露醇提取液黑暗預(yù)處理1-3天后，倒入15-20ml0. 2-0. 5M的甘露醇提 取液，用高速分散器超速(例如3000-4000rpm)旋切，150目篩網(wǎng)過濾，濾液低速(例如 800-1000rpm)離心，重復(fù)2-3次，收集小孢子。用于預(yù)處理花藥的甘露醇提取液可含有1. 0-1. 6X 10_4mol/L的赤霉病菌毒素，優(yōu) 選 0. 8-1. 6 X ΙθΛιοΙ/L，更優(yōu)選 1. 0-1. 5 X l(T4mol/L，更優(yōu)選 1. 4-1. 5 X l(T4mol/L 的赤霉病 菌毒素。用于預(yù)處理花藥的甘露醇提取液的濃度可以為約0.3-0. 4M，優(yōu)選為約0.3M。高速 分散器旋切花藥時所使用的甘露醇提取液的濃度可以為0. 3-0. 4M，優(yōu)選為0. 3M。提取液用作預(yù)處理液處理花藥時添加有3. 9 X 10_5 1. 95X 10_4mol/L的赤霉病菌 毒素。提取液用于提取小孢子時則不含赤霉病菌毒素。提取獲得的游離小孢子可置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常以N6 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有赤霉病菌毒素0. 50-1. 0X10_4mol/L、2，4，5-T 0. 3-0. 8mg/ L、KT 0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60_120g/L，pH 5. 5-6. 2。N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基中赤霉病菌毒素的濃度為0. 65-0. 85 X 10_4mol/L，更優(yōu)選為 0. 75-0. 80Xl(T4mol/L。2，4，5-T (2，4，5-三氯苯氧乙酸)的優(yōu)選濃度為0. 4-0. 7mg/L,更優(yōu)選為 0.4-0. 5mg/L?？梢杂?，4-DQ，4-二氯苯氧基乙酸)替代2，4，5-T。2，4-D的濃度0. 4-0. 7mg/ L，更優(yōu)選為0.4-0.5mg/L?；蛘呖墒褂?，4，5_T和2，4_D的混合物，兩者的總濃度為 0. 4-0. 7mg/L,更優(yōu)選為 0. 4-0. 5mg/L。
KT 的優(yōu)選濃度為 0. 4-0. 65mg/L,更優(yōu)選為 0. 4-0. 5mg/L。麥芽糖的濃度優(yōu)選為80-100g/L，更優(yōu)選為80_90g/L。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 6-5. 9，更優(yōu)選為5. 7-5. 8。培養(yǎng)前將先用該N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌小孢子1到2次，然后用培養(yǎng)基將小孢子密 度調(diào)節(jié)至1.0 1.2X105/ml，取大約1. 5_3ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(30X15mm)， Parafilm封口，室溫下(例如約2548°C)暗培養(yǎng)15-25天。通常情況下是在25°C暗培養(yǎng) 大約21天左右。N6培養(yǎng)基的配方如下表1所示(單位mg/L)表 1N6大量元素(NH4) 2S044 6 3KNO32830CaCl2 · 2H20166MgSO4 · 7H20185KH2PO4400N6微量元素H3BO31. 6KI0. 83MnSO4 · 4H205.0ZnSO4 · 7H201. 5N6 鐵鹽Na2EDTA37. 3FeSO4 · 7H2027. 8N6有機元素鹽酸硫胺素1. 0鹽酸吡多辛0. 5甘氨酸2. 0煙酸0. 5肌醇100.0N6培養(yǎng)基可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化學(xué)試劑公司購買成品。然后 根據(jù)本文所述配方配制本文的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對上述表1所示 的濃度作出適當(dāng)?shù)淖儎?，例如有大約5% (例如3%左右、2%左右、左右，或更低的變動 范圍)或更低的變動，由此配制得到的培養(yǎng)基仍然具有所需的生物學(xué)功能，仍能用于實施 本發(fā)明。例如，以肌醇為例，每升N6培養(yǎng)基中可含有大約95-105mg的肌醇(5%的變動幅 度)。其它成分的濃度也如此變動。此外，N6培養(yǎng)基中的成分也可使用功能和性質(zhì)相同或 相似的成分加以替換。誘導(dǎo)培養(yǎng)后，將所得胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基以2/3MS為基本培 養(yǎng)基，其中加有 NaCl 200-500mg/L、6-BA 0. 3-1. 2mg/L、KT 0. 5-2. 0mg/L、NAA 0. 01-0. lmg/ L 和麥芽糖 10-50g/L，PH 為 5. 5-6. 2。
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分化培養(yǎng)基中所添加的NaCl優(yōu)選為200_400mg/L，更優(yōu)選300_400mg/L。6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)的優(yōu)選濃度為0. 4-0. 8mg/L,更優(yōu)選為0. 5-0. 6mg/L。KT (6-糠氨基嘌呤)的優(yōu)選濃度為1. 0-1. 8mg/L,更優(yōu)選為1. 2-1. 5mg/L。NAA (萘乙酸)的優(yōu)選濃度0. 02-0. 08mg/L,更優(yōu)選為0. 03-0. 06mg/L。在一具體實 施方式中，NAA的濃度為0. 05mg/L。麥芽糖的濃度為20_40g/L，更優(yōu)選為20_30g/L。分化培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 7-5. 8。MS培養(yǎng)基的配方如下表2所示(單位mg/L)
0081]表 2
0082]MS大量元素
0083]NH4NO41650
0084]KNO31900
0085]CaCl2 · 2H20440
0086]MgSO4 · 7H20370
0087]KH2PO4170
0088]MS微量元素
0089]H3BO36. 2
0090]KI0. 83
0091]MnSO4 · 4H2022. 3
0092]ZnSO4 · 7H208. 6
0093]Na2MoO4 · 2H200. 25
0094]CuSO4 · 5H200. 025
0095]CoCl2 · 6H200. 025
0096]MS 鐵鹽
0097]Na2EDTA37. 3
0098]FeSO4 · 7H2027. 8
0099]MS有機元素
0100]鹽酸硫胺素0. 1
0101]鹽酸吡多辛0.5
0102]煙酸0.5
0103]甘氨酸2.0
0104]肌醇100.0 MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化學(xué)試劑公司購買成品。2/3MS培養(yǎng) 基則是將MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機元素不變。然后根據(jù)本文 所述配方配制本文的2/3MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可對上述表1所示的濃 度作出適當(dāng)?shù)淖儎?，例如有大約5 % (例如3 %左右、2 %左右、1 %左右，或更低的變動范圍) 或更低的變動，由此配制得到的培養(yǎng)基仍然具有所需的生物學(xué)功能，仍能用于實施本發(fā)明。 例如，以肌醇為例，每升MS培養(yǎng)基中可含有大約95-105mg的肌醇(5%的變動幅度)。其它 成分的濃度也如此變動。此外，2/3MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的成分也可使用功能和性質(zhì)相同或相似的成分加以替換。在25士 1°C，每天10 12小時光照的條件下分化脅迫培養(yǎng)25 30天，直至分化
出綠色再生植株。分化出的再生植株可轉(zhuǎn)入添加有NAA 0. 02-0. 08mg/L、多效唑(MET) 2. 0-10. Omg/ L和蔗糖10-40g/L, ρΗ5· 6-6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在25士 1°C，每天10 12小時 光照的條件下進行25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。生根壯苗培養(yǎng)基中，NAA的優(yōu)選濃度范圍為0. 03-0. 06mg/L,更優(yōu)選為
0.04-0.05mg/L。MET的優(yōu)選濃度范圍為3. 0-8. Omg/L,更優(yōu)選為4. 0-6. Omg/L。在一具體實施例中， MET的濃度為5. Omg/L。蔗糖的優(yōu)選濃度范圍為20-30g/L。在一具體實施例中，蔗糖的濃度為20g/L。生根壯苗培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 8-5. 9。1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基是將表2所示的MS培養(yǎng)基的大量元素減半，并加入本申請 所述的添加成分后而配制得到。上述成分可從市場上購得。例如，赤霉菌粗毒素DON購買于Sigma公司。本申請也包括用于本申請篩選麥類作物耐赤霉病菌毒素的方法的上述各種提取 液和培養(yǎng)基。本申請另一方面提供甘露醇提取液，其可含有3.9X10—5 1.95X10-4mol/L的赤 霉病菌毒素。該甘露醇提取液的濃度可以為約0. 2-0. 6M，優(yōu)選為約0. 3-0. 5M。甘露醇提取液優(yōu)選含有0. 8-1. 6X10_4mol/L，更優(yōu)選1. 0-1. 5 X 10_4mol/L，更優(yōu)選
1.4-1. 5Xl(T4mol/L的赤霉病菌毒素。在一具體實施例中，所使用的甘露醇提取液為含1. 5X10_4mOl/L的赤霉病菌毒素 0. 3M甘露醇提取液。本申請也包括一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用于實施本申請所述的篩選方法。該誘導(dǎo)培 養(yǎng)基為N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以表1所示的N6培養(yǎng)基的成分為基礎(chǔ)，添加了赤霉病菌毒素 0. 50-1. 0Xl(T4mol/L、2，4，5-T 0. 3-0. 8mg/L、KT 0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60_120g/L，pH 5. 5~6. 2。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，赤霉病菌毒素的濃度為0.65-0.85X10_4mOl/L，更優(yōu)選為 0. 75-0. 80Xl(T4mol/L。2,4,5-T 的優(yōu)選濃度為 0. 4-0. 7mg/L，更優(yōu)選為 0. 4-0. 5mg/L。
KT 的優(yōu)選濃度為 0. 4-0. 65mg/L,更優(yōu)選為 0. 4-0. 5mg/L。麥芽糖的濃度優(yōu)選為80-100g/L，更優(yōu)選為80_90g/L。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 6-5. 9，更優(yōu)選為5. 7-5. 8。在一具體實施例中，隊誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加赤霉病菌毒素0.75\10_411101/1、2，4，5-1 0. 5mg/L、KT 0. 5mg/L，麥芽糖 90g/L, pH 5. 8。本申請也包括一種分化培養(yǎng)基，用于實施本申請的篩選方法。該分化培養(yǎng)基以 2/3MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加有 NaCl 200-500mg/L、6_BA 0. 3-1. 2mg/L,KT 0. 5-2. Omg/L, NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 10-50g/L, PH 為 5. 5-6. 2。分化培養(yǎng)基中所添加的NaCl優(yōu)選為200_400mg/L，更優(yōu)選300_400mg/L。
6-BA 的優(yōu)選濃度為 0. 4-0. 8mg/L，更優(yōu)選為 0. 5-0. 6mg/L。KT 的優(yōu)選濃度為 1. 0-1. 8mg/L，更優(yōu)選為 1. 2-1. 5mg/L。NAA的優(yōu)選濃度0. 02-0. 08mg/L,更優(yōu)選為0. 03-0. 06mg/L。在一具體實施方式
中， NAA的濃度為0. 05mg/Lo麥芽糖的濃度為20_40g/L，更優(yōu)選為20_30g/L。分化培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 7-5. 8。2/3MS培養(yǎng)基是指將表2所示的MS培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽 和有機元素不變。本申請還包括一種生根壯苗培養(yǎng)基，用于實施本申請的篩選方法。該生根壯 苗培養(yǎng)基是添加有 NAA 0. 02-0. 08mg/L、多效唑(MET) 2. 0-10. Omg/L 和蔗糖 10_40g/L， pH5. 6-6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。生根壯苗培養(yǎng)基中，NAA的優(yōu)選濃度范圍為0. 03-0. 06mg/L,更優(yōu)選為 0.04-0. 05mg/L。MET的優(yōu)選濃度范圍為3. 0-8. Omg/L,更優(yōu)選為4. 0-6. Omg/L。在一具體實施例中， MET的濃度為5. Omg/L。蔗糖的優(yōu)選濃度范圍為20_30g/L。在一具體實施例中，蔗糖的濃度為20g/L。生根壯苗培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為5. 7-5. 9，更優(yōu)選約為5. 8。1/2MS培養(yǎng)基是將表2所示的MS培養(yǎng)基的大量元素減半所得的培養(yǎng)基。在一具體實施例中，生根壯苗培養(yǎng)基是添加有NAA 0. 05mg/L、多效唑 (MET) 5. Omg/L 和蔗糖 20g/L, ρΗ5· 8。本申請還包括含有上述甘露醇提取液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根壯苗培養(yǎng) 基的套盒。各提取液和培養(yǎng)基可分裝在不同的容器中。任選地，該套盒還可包括指導(dǎo)使用 其中所包含的試劑實施獲得抗赤霉病性狀穩(wěn)定的材料的方法的說明書。本申請中，所述麥類作物包括大麥和小麥。因此，本申請也包括采用本申請方法篩 選得到的麥類作物的植株、幼苗、種子等。與傳統(tǒng)育種方法相比，本發(fā)明方法簡便，易于掌握、實施；抗赤霉病株系的獲得和 抗赤霉病性狀的篩選都在實驗室完全一致的條件下進行，不受外界條件的影響；利用小孢 子作為起始材料，可獲得大量的胚狀體，在小孢子培養(yǎng)過程中進行抗赤霉病性狀離體篩選， 可嚴格篩選，大膽淘汰；整個過程都在培養(yǎng)室中進行，同時又降低了勞動力和農(nóng)田的使用， 且可周年重復(fù)試驗，不斷提供篩選材料，既縮短了育種時間，又能獲得大量的種質(zhì)材料。申請人:的實驗表明，利用本發(fā)明可在不到半年的時間內(nèi)完成麥類作物株系篩選， 獲得抗赤霉病性狀穩(wěn)定的材料，種植后獲得種子可用于進一步的田間檢測。本發(fā)明可大大 縮短育種時間。下文將以大麥為例對本發(fā)明進行描述。應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情 況下可對本發(fā)明做出各種修改和變動。且也可采用本發(fā)明的方法用于其它禾谷類作物，并 能產(chǎn)生相同的效果。以下實施例僅僅是闡述性的，本發(fā)明的范圍由本申請的權(quán)利要求加以 限定。如無特別說明，本發(fā)明所用的百分比為重量體積百分比。此外，應(yīng)理解，上述各培養(yǎng) 基中各成分的優(yōu)選范圍可任意組合，只要其能實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的即可。實施例1 大麥花藥的耐赤霉病毒素處理及小孢子提取
從大田選取中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏15 天。接種時，穗子用飽和的漂白粉溶液消毒15min，無菌水沖洗3-4次。每個培養(yǎng)皿中置40 枚花藥，用含1. 5X 10_4mol/L赤霉病菌毒素的0. 3M的甘露醇提取液黑暗預(yù)處理3d后，倒 入15ml 0.3M的甘露醇提取液，用3000rpm的高速分散器超速旋切，150目篩網(wǎng)過濾，濾液以 800rpm低速離心，重復(fù)3次，收集小孢子。實施例2 耐赤霉病毒素胚狀體的獲取誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其中加有赤霉菌粗毒素0. 75X 10_4mol/L、 2,4,5-T 0.5mg/L、KT 0. 5mg/L，麥芽糖90g/L，pH 5. 8。培養(yǎng)前將小孢子用培養(yǎng)基洗滌1次， 然后用培養(yǎng)基將小孢子密度調(diào)節(jié)至1. 0 1. 2X 105/ml，取1. 5ml小孢子懸浮液接種于培養(yǎng) 皿(30 X 15mm)，Parafilm 封 口，25°C 暗培養(yǎng) 2Id。實施例3 耐赤霉病毒素再生植株的獲取誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后將胚狀體轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基以2/3MS為基本培養(yǎng) 基，其中加有 NaCl 300mg/L、6-BA 0. 5mg/L、KT 1. 5mg/L、NAA 0. 05mg/L 和麥芽糖 30g/L，PH 為5. 8。在25士 1°C，每天10 12小時光照的條件下分化脅迫培養(yǎng)25 30天，直至分化 出綠色再生植株。實施例4 耐赤霉病毒素再生植株的生根培養(yǎng)選取分化出的再生植株，轉(zhuǎn)入添加有NAA 0. 05mg/L、多效唑(MET) 5. Omg/L和蔗糖 20g/L，pH5. 8的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基。在25士 1°C，每天10 12小時光照的條件下進行 25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。實施例5 再生植株種子的耐赤霉病毒素的測定以大麥新品系B06-5為材料，經(jīng)實施例1-4后，收獲再生植株的種子，繁殖一代后 取其種子置于添加濃度為1. 5X10_4mOl/L赤霉菌粗毒素DON(純品，購于sigma公司)的培 養(yǎng)基上(6%瓊脂)進行萌發(fā)，以原始材料的種子為對照品種，每瓶10粒，重復(fù)3次。以不添加DON培養(yǎng)基上種子的胚芽/胚根長度為對照，計算其胚芽/胚根影響率 (胚芽/胚根生長影響率=(處理胚芽/胚根平均長度-對照胚芽/胚根平均長度)/對照 胚芽/胚根平均長度X100%)。統(tǒng)計結(jié)果表明經(jīng)本方法篩選獲得的再生植株，它們的胚芽/胚根生長影響率明 顯小于對照材料，表明本方法獲得的再生植株的耐赤霉病毒素能力可以經(jīng)種子繁殖傳遞給 后代。結(jié)果見表3。表3
胚芽鞘長度cm 對照 處理影響率％胚根長度 對照cm 處理影響率％株系12.582.52-2.333.312.51-24.17株系22.22.08-5.454.083.67-10.05株系32.912.55-12.372.992.12-29.1B06-52.681.83-31.725.282.46-53.41
實施例6以大麥品系B06-6為材料，利用本發(fā)明方法，進行了三次重復(fù)試驗，從每次重復(fù)試 驗中均獲得一批經(jīng)赤霉病菌毒素脅迫后形成的胚狀體和經(jīng)NaCl脅迫后形成的再生植株。 再生植株的種子經(jīng)繁殖一代后的種子置于添加赤霉病菌純毒素的培養(yǎng)基上進行萌發(fā)，所有 供測試種子的胚芽和胚根影響率都不同程度地小于原始材料的種子，結(jié)果見表4。影響率％如實施例5所述計算。表 權(quán)利要求
1.一種篩選麥類作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，該方法包括1)取麥類作物幼穗花藥置于添加3.9X10—5 1.95X10-4mol/L赤霉病菌毒素的 0. 2-0. 5M甘露醇提取液中培養(yǎng)1-3天；2)由步驟1)處理后的花藥分離獲得小孢子；3)將步驟2)獲得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.50-1.0X10_4mol/L、2，4，5-T 0. 3-0. 8mg/L、KT 0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60_120g/L，pH 5. 5-6. 2 的 N6 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得胚 狀體；4)將步驟3)獲得的胚狀體置于添加NaCl200-500mg/L、6-BA 0. 3-1. 2mg/L、KT 0. 5-2. Omg/L、NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 10_50g/L，PH 為 5. 5-6. 2 的 2/3MS 分化培養(yǎng)基 中，獲得再生植株，該再生植株為耐赤霉病菌粗毒素的麥類作物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟1)前，先在0_8°C下處理所述麥 類作物幼穗花藥15-30天。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括5)將步驟4)所得的再生植株轉(zhuǎn)入添加有NAA0. 02-0. 08mg/L、多效唑2. 0-10. Omg/L 和蔗糖10-40g/L, ρΗ5· 6-6. 0的1/2MS生根壯苗培養(yǎng)基中，在25士 1°C，每天10 12小時 光照的條件下進行25 30天的生根壯苗培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括1)從供體植株上取幼穗在5°C的低溫下處理20d，滅菌后在超凈臺上分離出花藥；2)將步驟1)所得花藥置于添加1.5 X 10-4mol/L赤霉病菌毒素的0. 3M甘露醇預(yù)處理/ 提取液中培養(yǎng)2d，獲得粗毒素脅迫處理過的花藥；3)將步驟2)獲得的花藥在超凈臺上進行旋切分離，獲得游離小孢子；4)將步驟3)獲得的小孢子置于添加赤霉病菌毒素0.75X10_4mol/L、2，4，5-T0. 5mg/L、 KT 0. 5mg/L,麥芽糖90g/L，pH 5. 8的N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得胚狀體；5)將步驟4)獲得的胚狀體置于添加NaCl300mg/L、6-BA 0. 5-1. 5mg/L、KT 0. 5-2. Omg/L、NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 30g/L, PH 為 5. 8 的 2/3MS 分化培養(yǎng)基中，獲得 再生植株。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述麥類作物選自大麥和小麥。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述甘露醇提取液為含有·0.8-1. 6X l(T4mol/L赤霉病菌毒素的0. 3-0. 4M甘露醇溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述NaCl含量為300_500mg/L。
8.一種用于實施權(quán)利要求1所述的方法的套盒，其特征在于，該套盒含有權(quán)利要求1中 所述的甘露醇提取液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或2/3MS分化培養(yǎng)基。
9.如權(quán)利要求8所述的套盒，其特征在于，所述甘露醇提取液為添加3.9X 10_5 ·1.95X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素的0. 2-0. 5M甘露醇提取液。
10.如權(quán)利要求8所述的套盒，其特征在于，所述套盒含有甘露醇提取液、N6誘導(dǎo)培養(yǎng) 基和2/3MS分化培養(yǎng)基，所述甘露醇提取液為添加3. 9X 10_5 1. 95X 10_4mOl/L赤霉病菌毒素的0. 2-0. 5M甘 露醇提取液；所述N6培養(yǎng)基添加有赤霉病菌毒素0. 50-1. 0X10_4mol/L、2，4，5-T0. 3-0. 8mg/L、KT·0. 3-0. 8mg/L，麥芽糖 60-120g/L, pH 5. 5-6. 2 ；所述 2/3MS 分化培養(yǎng)基添加 NaCl 200-500mg/L、6_BA 0. 3-1. 2mg/L、KTO. 5-2. Omg/L、 NAA 0. 01-0. lmg/L 和麥芽糖 10_50g/L，pH 為 5. 5-6. 2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種篩選麥類作物耐赤霉病菌粗毒素的方法，該方法包括在小孢子培養(yǎng)前對花藥給予赤霉病粗毒素的脅迫處理，從經(jīng)粗毒素脅迫處理后的花藥中分離出小孢子，置于添加赤霉病菌粗毒素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得胚狀體后置于添加NaCl的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得再生植株。本發(fā)明的整個篩選過程都在實驗室可控條件下進行，使篩選結(jié)果真實可靠，篩選所得再生植株攜帶的抗性基因以及其他所有基因一次性純合，基因所控性狀的遺傳穩(wěn)定性高。
文檔編號A01H4/00GK102106257SQ20091020060
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者何婷, 王亦菲, 陸瑞菊, 陳志偉, 黃劍華 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？屏⑻剞r(nóng)科(集團)有限公司, 上海綠劍農(nóng)業(yè)科技有限公司