專利名稱：：一類新型保幼激素合成抑制劑－苯丙-甘-亮三肽酰胺類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類全新結(jié)構(gòu)的保幼激素抑制劑——苯丙-甘-亮三肽酰胺類似物。技術(shù)背景昆蟲神經(jīng)肽是由昆蟲腦內(nèi)特異性神經(jīng)分泌細胞周期性地合成、分泌并通過神經(jīng)或體液傳遞的一類活性小肽。昆蟲神經(jīng)肽相互協(xié)調(diào)，控制和調(diào)節(jié)著昆蟲某些器官或腺體的活動，影響昆蟲的生長、發(fā)育、變態(tài)、生殖和代謝等重要的生理過程。近三十年來，隨著化學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，尤其是先進的分析測試手段的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)了大量的昆蟲神經(jīng)肽，如促前胸腺素(prothoracicotropichormone,PTTH)、抑前胸腺肽(prothoracicostaticpeptide,PTSP)、促咽側(cè)體素(allatotropin,AT)、抑咽側(cè)體素(allatostatin，AST)、滯育激素(di即ausehormone,DH)、性信息素合成激活肽(pheromonebiosynthesisactivatingneurop印tide，PBAN)、羽化激素(eclosionhormone,EH)等。昆蟲神經(jīng)肽作為昆蟲激素的一種，具有極高的生理活性。抑咽側(cè)體素(Allatostatin，簡稱AST)是一類最早從蜚蠊中分離得到的具有抑制咽側(cè)體合成保幼激素功能的昆蟲神經(jīng)肽，AST從結(jié)構(gòu)功能上可分為三類A型AST是首先從蟑螂中分離得到的一類抑咽側(cè)體素，其結(jié)構(gòu)特征是C末端為Y/FXFGL-,2結(jié)構(gòu)；B型AST首先從蟋蟀中分離得到，C末端為W(X)J-NH2;從煙草天蛾ManducaSexta中得到的AST被認為是C型AST。這三類肽中，A型AST的研究最多，大量的數(shù)據(jù)表明高度保守的C末端Y/FXFGL-NH2是關(guān)鍵的活性片斷。在蟑螂體內(nèi)，A型AST以皮摩爾級別高效地抑制保幼激素的合成，從而起到調(diào)控蟑螂生長發(fā)育的功能。盡管抑咽側(cè)體素具有很高的體外抑制保幼激素合成的生物活性，但是它具有活體活性差，容易被降解，合成成本高等缺點，迄今尚未在害蟲治理中得到實際應(yīng)用(GarsideCS,NachmanRJ，TobeSS.InjectionofDip-allatostatinorDip-allatostatinpseudopeptidesintomatedfemaleZ)^/o;fen7/w"ctotoinhibitsendogenousratesofJHbiosynthesisandbasaloocytegrowth.InsectBiochemMolBiol2000;30:703-710.)。為了克服天然多肽的種種缺陷，許多研究者對其結(jié)構(gòu)進行修飾改造，發(fā)現(xiàn)了一些具有較好活性的AST類似物?，F(xiàn)有一些A型AST類似物公開于下列文獻中如1994年Hayes等(Structure-activitystudiesofallatostatin4ontheinhibitionofjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallata:theimportanceofindividualsidechainsandstereochemistry.P印tides1994,15，1165-1171.)，1998年Nachman等(Synthesis,biologicalactivity,andconformationalstudiesofinsectallatostatinneuropeptideanaloguesincorporatingturn-promotingmoieties.Bioorg.Med.Chem.1998,6,1379-1388.)，1997年P(guān)iulachs等(KetomethyleneandmethyleneaminopseudopeptideanaloguesofinsectallatostatinsinhibitjuvenilehormoneandvitellogeninproductioninthecockroachBlattellagermanica.InsectBiochem.Molec.Biol.1997，27，851-858.)，1999年Nachman等(Hemolymphandtissue-boundpeptidase-resistantanalogsoftheinsectallatostatins.Peptides1999，20，23-29.)，1991年Feyereisen等(Allatostatinswhichinhibitinsectjuvenilehormonebiosynthesis.美國專利US5039792),2007年Nachman等(Mimeticinsectallatostatinanalogsforinsectcontrol.美國專利US7208476B2)。這些文獻通過模擬肽學(xué)對AST進行結(jié)構(gòu)改造，大部分類似物的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜(模擬了五肽以上的活性肽)，合成成本高，不適合作為新農(nóng)藥進行開發(fā)。本發(fā)明正是針對上述缺點，從A型AST的結(jié)構(gòu)特點出發(fā)，開發(fā)了一系列小分子模擬肽類化合物，并發(fā)現(xiàn)它們對蟑螂的保^J激素合成具有較好的抑制活性。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)有的文獻報道認為抑咽側(cè)體素的核心五肽Y/FXFGLa是產(chǎn)生生物活性必要的片段。本發(fā)明僅以C-末端三肽Phe-Gly-Leu-NH2為先導(dǎo)物，釆用酪氨酸、芳香酸等替代先導(dǎo)結(jié)構(gòu)中的苯丙氨酸和甘氨酸的方法，得到一類結(jié)構(gòu)新穎的保幼激素合成抑制劑，其結(jié)構(gòu)通式為式B:R-Leu-NH2式B式B中，R為Phe-Gly-，Tyr-Gly-，PhCH2CH2CO-Gly-，PhCH=CHC0-Gly-，Ph(CH2)5CO-,Ph(CH2)4C0-，PhCH2NHC0(CH2)2C0-，PhCH2NHC0(CH2)3C0-，PhCHWHCOCH^O-。優(yōu)選的式B化合物，其中R為Phe-Gly-,PhCH2CH2C0-Gly-，PhCH=CHC0-Gly-，PhCH2NHCO(CH2)2C0-。本發(fā)明所提供的式B化合物，均按照多肽固相合成法得到(參考文獻ChanWG,WhitePD.FmocsolidphasepeptidesynthesisAPracticalApproach,OxfordUniversityPress,2000;p.9-74.)。本發(fā)明采用Tobe等人的離體放射化學(xué)測定方法(a.Tobe，S.S.;Clarke,N.Theeffectof^-methionineconcentrationonjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthecockroachDiplopterapunctata.InsectBiochem.1985，15，175-179.b.Tobe,S.S.;Pratt,G.E.Theinfluenceofsubstrateconcentrationsontherateofinsectjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthedesertlocustinvitro.Biochem.J.1974，144，107-113.)，測定了式B化合物抑制太平洋折翅蠊(歷'p7optera/W77Cte^)保幼激素合成的離體活性。本發(fā)明進一步采用體表測試方法，測試了部分化合物對太平洋折翅蠊(Z^^o/^erap"""s&)的活體活性。生測結(jié)果表明，部分式B化合物在活體水平上可以高效地抑制蟑螂保幼激素的合成。另外，本發(fā)明還測試了部分式B化合物對蟑螂卵發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)式B化合物處理的蟑螂，卵的發(fā)育明顯受到抑制。正常情況下，第七天卵發(fā)育成熟；而經(jīng)式B化合物處理的蟲子的卵發(fā)育緩慢。以本發(fā)明的式B化合物為活性成分的防治蟑螂的藥物也屬于本發(fā)明的保護范圍。在需要的時候，在所述藥物中還可以加入一種或多種農(nóng)藥制劑中可接受的載體，所述載體包括農(nóng)藥制劑中常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑等。制成的藥物的劑型也是多樣的，可以是粉劑、微乳劑、佴劑、微膠囊劑、乳油等。本發(fā)明以A型AST的Phe-Gly-Leu-NH2片段為先導(dǎo)物，設(shè)計合成了一類新穎的保幼激素合成抑制劑?；衔锓肿恿吭?00左右，遠遠低于天然的抑咽側(cè)體素和前人所制備的類似物，結(jié)構(gòu)很簡單。這類化合物對蟑螂的保幼激素合成具有較好的抑制活性，進一步的應(yīng)用研究表明，該類化合物明顯影響雌性蟑螂的生殖系統(tǒng)，抑制蟑螂卵的生成。符合昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的特性，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。圖l、化合物B7的活體活性(體表測試)。圖2、化合物B7對蟑螂卵的發(fā)育影響。具體實施例方式本發(fā)明可用以下實施例作進一步詳細說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。制備實施例l、Bl化合物的合成(1)樹脂活化稱取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶漲活化3h，DMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min,5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFmoc-Leu-0H(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgH0Bt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser'si式劑檢測。(3)接Gly:DMF洗3次，加入90mgFmoc-Gly-OH，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15tnlDMF,室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min,5mlDMF洗4次，5ralDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(4)接Phe:DMF洗3次，加入116mgF腦-Phe-OH,114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF,室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(5)切割、解側(cè)鏈保護基產(chǎn)物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OmlTFA，室溫攪拌2.5h，溶液由黃色變?yōu)榧t色，過濾，N2吹去TFA，加入30ml冷的無水乙醚，4000N/min離心5min，得白色沉淀，30ml冷的無水乙醚如此洗3次，真空干燥，質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜檢測結(jié)果MH+:335.2。(6)粗肽用HPLC分離純化。色譜柱為C18半制備柱。收集的溶液脫去乙腈后，凍干制得純肽。化合物B2按上述方法制備。制備實施例2、B4化合物的合成(1)樹脂活化稱取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶漲活化3h，DMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFmoc-Leu-OH(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgHOBt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(3)接Gly:DMF洗3次，加入90mgFmoc-Gly-0H，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌淀DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(4)接苯基丙烯酸:DMF洗3次，加入45mg苯基丙烯酸，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(5)切割、解側(cè)鏈保護基產(chǎn)物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OtnlTFA，室溫攪拌2.5h，溶液由黃色變?yōu)榧t色，過濾，N2吹去TFA，加入30ml冷的無水乙醚，4000N/min離心5min，得白色沉淀，30ml冷的無水乙醚如此洗3次，真空干燥，質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜檢測結(jié)果隨a':340.0。(6)粗肽用HPLC分離純化。色譜柱為C18半制備柱。收集的溶液脫去乙腈后，凍千制得純肽?；衔顱3，B5，B6均按上述方法制備。制備實施例3、B7化合物的合成(1)樹脂活化稱取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶漲活化3h,DMF洗4次，加入20M哌卩定DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFtnoc-Leu-OH(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgHOBt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切害ij20min，5tnlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(3)接丁二酸酐DMF洗3次，加入30mg丁二酸酐、37mg的DMPA，溶于15ralDMF，室溫攪拌2h,5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(4)接芐胺DMF洗3次，加入3倍量芐胺，114mgHBTU,41mgHOBt,105ulDIEA，溶于15mlDMF,室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(5)切割、解側(cè)鏈保護基:產(chǎn)物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OmlTFA，室溫攪拌2.5h,溶液由黃色變?yōu)榧t色，過濾，N2吹去TFA，加入30ml冷的無水乙醚，4000N/min離心5min，得白色沉淀，30ml冷的無水乙醚如此洗3次，真空干燥，質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜檢測結(jié)果MH+:320.2。(6)粗肽用HPLC分離純化。色譜柱為C18半制備柱。收集的溶液脫去乙腈后，凍干制得純肽。化合物B8，B9均按上述方法制備。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>所有式B化合物的結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)和物理性狀列于表l中。_表l、式B化合物的結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜結(jié)果及其物理性狀<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>應(yīng)用實施例l、化合物的離體活性本發(fā)明采用Tobe等人的離體放射化學(xué)測定方法(參考:a.Tobe,S.S.;Clarke,N.TheeffectofL-methionineconcentrationonjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthecockroachZj》7o/7terai/sectA'oc力e瓜1985，15，175-179.b.Tobe，S.S.;Pratt,G.E.Theinfluenceofsubstrateconcentrationsontherateofinsectjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthedesertlocustinvitro.A'oc力e瓜/.1974,144,107-113.)，測定了式A化合物抑制太平洋折翅蠊(歷Wopterap"/cta^)保幼激素合成的離體活性。部分化合物離體生測結(jié)果見表2。表2、部分式B〗七合物的離體活性結(jié)構(gòu)IC50BlPhe~Gly-Leu-NH22.06liMB3Ph^^^^^^Gly-Leu-NH20.86uMB4Ph^^^Gly-Leu-NH2B7▽丫Leu-NH200.48uM表2結(jié)果表明，式B化合物具有抑制蟑螂保幼激素合成的能力。B1，B3，B4和B7的ICs。值分別為2.06liM，0.86txM，1.01yM和0.48uM。數(shù)據(jù)表明，B3，B4和B7的離體活性均優(yōu)于先導(dǎo)物B1。應(yīng)用實施例2、體表測試方法測定化合物的活體活性。配制100uM的類似物的DMS0溶液；并與丙酮配制成混合溶液(比例l:5)。取5uM混合溶液涂布于蟑螂(雌蟲，成蟲羽化當天)(每頭試蟲的施藥量為O.lnmol)，將蟑螂置于27'C，濕度80%，充足食物和水，無光的環(huán)境下培養(yǎng)到第三天；采用離體放射化學(xué)測定方法測定受試蟑螂合成保幼激素的能力。圖1為化合物B7的活體活性結(jié)果。所有結(jié)果用t檢驗方法統(tǒng)計。其中，***為P〈0.001;柱形圖上數(shù)字n為重復(fù)次數(shù)。圖1結(jié)果表明，在每頭試蟲施藥量為0.lnmol的條件下，化合物B7顯著抑制了蟑螂保幼激素的合成。t檢驗方法統(tǒng)計的結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的P值為0.0005，低于0.001。應(yīng)用實施例3、化合物對蟑螂卵的發(fā)育影響。配制100yM的化合物B7的DMSO溶液，再與丙酮配制成混合溶液(比例1:5)。取5uM混合溶液涂布于蟑螂(雌蟲，成蟲羽化當天)，將蟑螂置于27'C，濕度80%，充足食物和水，無光的環(huán)境下培養(yǎng)。每天檢查蟑螂卵巢的發(fā)育情況，測量卵母細胞的長度?；衔顱7對蟑螂卵的發(fā)育抑制結(jié)果見圖2.從圖2可以看出，與溶劑DMSO對照相比，B7處理的蟑螂的卵發(fā)育速度降低，說明B7抑制了蟑螂卵的發(fā)育。權(quán)利要求1、一類結(jié)構(gòu)新穎的保幼激素合成抑制劑，該類抑制劑是苯丙-甘-亮三肽酰胺類似物，其通式結(jié)構(gòu)為式BR-Leu-NH2式B式B中，R為Phe-Gly-，Tyr-Gly-，PhCH2CH2CO-Gly-，PhCH＝CHCO-Gly-，Ph(CH2)5CO-，Ph(CH2)4CO-，PhCH2NHCO(CH2)2CO-，PhCH2NHCO(CH2)3CO-，PhCH2NHCOCH2CO-。2、權(quán)利要求1中所述式B化合物中，優(yōu)選的式B化合物為R:Phe-Gly-，PhCH2CH2C0_Gly-，PhCH=CHC0-Gly-，PhCH2NHC0(CH2)2C0-。3、權(quán)利要求l所述的化合物的制備方法。4、權(quán)利要求l所述化合物在蟑螂防治中的應(yīng)用。5、以權(quán)利要求l所述化合物為活性成分的藥物。6、根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于所述藥物是用于防治蟑螂的藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一類結(jié)構(gòu)新穎的保幼激素合成抑制劑，該類抑制劑是苯丙-甘-亮三肽酰胺類似物，本發(fā)明所提供的化合物結(jié)構(gòu)通式為式BR-Leu-NH₂式B中，R為Phe-Gly-，Tyr-Gly-，PhCH₂CH₂CO-Gly-，PhCH＝CHCO-Gly-，Ph(CH₂)₅CO-，Ph(CH₂)₄CO-，PhCH₂NHCO(CH₂)₂CO-，PhCH₂NHCO(CH₂)₃CO-，PhCH₂NHCOCH₂CO-。本發(fā)明的式B化合物模擬了A型AST的Phe-Gly-Leu-NH₂片段的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有結(jié)構(gòu)簡單，合成成本低的特點；這類化合物對蟑螂的保幼激素合成具有較好的抑制活性，進一步的應(yīng)用研究表明，該類化合物明顯影響雌性蟑螂的生殖系統(tǒng)，抑制蟑螂卵的生成。符合昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的特性，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。文檔編號A01P23/00GK101519430SQ20091008061公開日2009年9月2日申請日期2009年3月20日優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日發(fā)明者云凌,開振鵬,張金蕊,斯蒂芬.斯.陶博,楊新玲,勇謝,陳馥衡,娟黃申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)