專利名稱：：微生物肥料-植物合生元組合物制劑及合生元制劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物肥料領(lǐng)域，具體涉及一種應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的微生物肥料一植物合生元組合物制劑及合生元制劑制備方法。技術(shù)背景隨著農(nóng)藥、獸藥、飼料添加劑、化肥、激素等化學合成物質(zhì)使用量的不斷增加，農(nóng)產(chǎn)品數(shù)量有了較快增長，但同時也不可避免地對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品造成了嚴重的污染，這不僅對人們的健康存在潛在威脅，而且直接影響到農(nóng)產(chǎn)品在國際上的競爭力和出口創(chuàng)匯。世界大部分國家，特別是一些發(fā)達國家允許使用的生長素和激素逐年減少，對農(nóng)作物中農(nóng)藥和化肥等殘留的要求也越來越高，提倡無公害的天然食物(綠色食品)己成為食品安全重要內(nèi)容和迫切需求。一、益生菌的概念益生菌又稱為益生素、促生素、活菌素等，廣義上講，是指含活菌或含菌體組分及代謝產(chǎn)物的生物制品。常見的益生菌有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、酪酸菌、酵母菌、噬菌蛭弧菌等，它們即是動物益生菌，又可作為植物益生菌；另外，光合細菌、植物根際微生物，如固氮細菌、解磷細菌、轉(zhuǎn)化鉀化物的微生物也是重要的植物益生菌。植物益生菌主要是指一些具有自生固氮、解磷、解鉀功能，或一些產(chǎn)酶、產(chǎn)有機酸的微生物，其直接的作用主要是改良土壤性質(zhì)，提高土壤肥力，節(jié)約肥料，減少化肥、農(nóng)藥使用量，另一方面，抑制有害微生物的生存與繁殖，減輕并逐步消除土傳病蟲害和連作障礙。間接的作用是增強植物的代謝功能，提高光合作用，促進種子發(fā)芽，根系發(fā)育、開花、結(jié)實，成熟期提前。二、益生元的概念益生元也叫"化學益生素"，是一種不易被機體消化但可選擇性刺激有益菌的生長或增強有益菌的活性，而且不被有害菌利用，從而促進機體健康的益菌制品。最基本的益生元為碳水化合物，但定義并不排除被用作益生元的非碳水化合物物質(zhì)。各種益生元中，研究和應用最廣泛的是寡糖，一般構(gòu)成單元為五碳糖或六碳糖，主要包含殼寡糖、氨基寡糖素、果寡糖、甘露寡糖、肝素寡糖、木寡糖、褐藻寡糖和牛蒡寡糖等。三、植物益生元的概念應用于植物，并且對植物的生長有促進作用的寡糖，可稱之為植物益生元。對應用于植物的寡糖素有系統(tǒng)的研究，其中應用較為成功的有氨基寡糖素(即殼寡糖)、真菌寡糖、半乳糖醛酸、卡拉膠寡糖等。另外，低分子量可溶的殼聚糖對植物生長也有一定的促進作用。植物益生元對植物生長發(fā)育表現(xiàn)出特殊的調(diào)節(jié)作用，它可以促進植物生長、促進植物愈傷組織形成、使植物細胞活化，提高肥料成分的吸收率；有的可作為蛋白酶抑制劑誘導因子，在植物抵抗病蟲害中起作用；有的可使植物局部細胞和組織產(chǎn)生過敏性死亡，使得病原物不能進一步擴散；還有的參與調(diào)控植物的形態(tài)建成等。目前的研究結(jié)果證實，單獨使用植物益生素或植物益生元，均對植物有明顯的益處。因為兩者單獨使用時，或者促進植物對氮磷鉀的吸收利用，或者誘導植物本身的免疫防御系統(tǒng)功能增強抗病性，同時還具有安全、高效、無殘留，符合"生態(tài)文明"要求，對保障糧食及食品安全具有非常重要的意義。微生物肥料也叫菌肥，是應用于植物或土壤環(huán)境中含有生物活性、起肥料效應，或以肥料方法使用、以微生物活性生物體或其代謝產(chǎn)物為主要作用因子的一類益生菌，是從土壤中篩選以至馴化出能改善作物營養(yǎng)的微生物。凡是能直接或間接改善作物營養(yǎng)狀況的微生物，將其制成菌劑或加入其他填充物，均可作為肥料廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。它的肥料效應一般認為是廣義的，不僅僅是營養(yǎng)物質(zhì)方面，也包括了對作物生長刺激、調(diào)控、協(xié)助作物吸收水分以及由于接種微生物在作物根際的廣泛生長而降低或抑制有害微生物的存活，從而表現(xiàn)出減輕一些病(蟲)害的效用。微生物肥料的作用機理獨具特點，不能被其他肥料代替，概括起來有以下幾個方面。一、活化并促進植物對氮、磷、鉀大量元素及其他營養(yǎng)元素的吸收。二、產(chǎn)生植物激素、酸性物質(zhì)等多種生理活性物質(zhì)刺激調(diào)節(jié)植物生長。三、產(chǎn)生抑病作用，間接促進植物生長。四、提高植物的抗逆性。上述微生物肥料有單一增強某項指標的，如固氮菌，也有多種微生物組成的菌群，協(xié)調(diào)發(fā)揮作用全面提高肥效的。但從既提高肥效，又促進植物抗性的角度設計微生物肥料的尚無報導。益生菌與益生元的復合制品，稱為合生元，又稱合生素或共生元，其特點是同時發(fā)揮益生菌和益生元的作用。合生元現(xiàn)己被廣泛地用于人類和動物保健與疾病預防治療過中，究其使用的高效性與無殘留性等眾多優(yōu)點，今后有成為抗生素預防治療疾病替代品的趨勢。本發(fā)明即從植物根際微生態(tài)和植物本身系統(tǒng)防御性的角度綜合考慮，提出了植物合生元的概念，提出了增加肥效的植物合生元組合物，解決了以往微生物肥料存在的或菌種單一、功能單一，或僅利用微生物的固氮解磷解鉀作用和競爭抑制作用等缺陷和不足。目前，國內(nèi)外市場上，已經(jīng)有少量的寡糖益生菌組合產(chǎn)品出現(xiàn)，但研究和應用僅限于動物。本發(fā)明提出植物合生元的概念將填補寡糖益生菌組合產(chǎn)品在植物生產(chǎn)領(lǐng)域的空白，使寡聚糖和益生素結(jié)合起來，在植物領(lǐng)域的應用中發(fā)揮更大更高的效能。此類新型制劑對環(huán)境友好、無污染，同時兼有促進植物生長和提高品質(zhì)的功能，是發(fā)展前景十分廣闊的一類新的生物制品。
發(fā)明內(nèi)容植物合生元的概念益生菌和寡糖兩者應用在植物上，均可改善土壤結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)植物生長、促進營養(yǎng)吸收、提高植物抗逆性。兩者配伍，共同作用于植物，益生菌抑制病害、促進植物生長，寡糖可改善益生菌的生長環(huán)境，促進益生菌生長，同時又調(diào)節(jié)、誘導植物抗性，改善土壤結(jié)構(gòu)和水分，二者相輔相成，共同起到促進生長、抑制病害、提高產(chǎn)量的作用。它可使植物細胞活化，促進植物愈傷組織形成和對氮、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而具有促進植物細胞生長發(fā)育的效果，可提高農(nóng)作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)；還能激活植物酶的活性，誘導植物系統(tǒng)獲得抗病性，從而減少農(nóng)藥的使用，減少環(huán)境污染。植物益生菌和益生元的組合物即為本發(fā)明提出的"植物合生元"。其中，起益生菌作用的微生物具有固氮、解磷、解鉀等功能；起益生元作用的寡聚糖為1-20個單糖組成的低聚糖，誘導植物系統(tǒng)抗性；真菌低聚糖可改善土壤結(jié)構(gòu)。因此該合生元可作為特殊微生物肥料應用。目前市場上已有成型的應用于動植物的益生元或益生菌制品，也有動物合生元產(chǎn)品；但迄今，國內(nèi)外對于植物合生元的應用和研究還未有明確資料。本發(fā)明率先把植物益生元和植物益生素以一定的比例配合，共同對植物起作用，并把這種產(chǎn)品組合物稱為植物合生元。植物合生元是"植物益生菌和植物益生元的混合制劑"。它的功能特點就是同時發(fā)揮益生菌與益生元的雙重作用。其機制是，一方面通過直接增加有益菌來改善微生態(tài)的平衡，從而達到宿主保健和疾病防治的目的；另一方面通過益生元的作用特點來強化益生菌的作用效果。通過以上功效從而可促進植物生長、提高防病抗病能力和經(jīng)濟效益。本發(fā)明的目的提供一種針對微生物特別種群具有自生固氮、解磷解鉀等功效，寡聚糖類物質(zhì)對植物有誘導抗性的功能并對益生菌生長有促進作用的微生物肥料一植物合生元組合物制劑。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣解決的一種微生物肥料一植物合生元組合物制劑，本發(fā)明的特殊之處在于按重量比，該制劑由85份99份益生菌，0.05份3.5份益生元，1.5份10份穩(wěn)定劑組成植物合生元，其中益生菌和益生元組成植物合生元的比例范圍為3060份l份。所述的益生菌包括有枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、固氮細菌、解磷細菌、轉(zhuǎn)化鉀化物的微生物、巨大芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌等，由枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌組成發(fā)酵液，按體積比，枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌巨大芽孢桿菌膠質(zhì)芽孢桿菌為h1:1配制，其中各種菌株的芽孢數(shù)量比例為枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌巨大芽孢桿菌膠質(zhì)芽孢桿菌=5:3:2;所述的益生元包括由低聚糖或寡聚糖中的1種或多種復合組成，其中的低聚糖為真菌葡聚糖、酵母葡聚糖、田菁膠、瓜兒豆膠、魔芋膠；其中的寡聚糖為真菌寡糖、寡葡聚糖、氨基寡糖、木寡糖、甘露寡糖、甘露半乳寡糖；所述穩(wěn)定劑包括真菌葡聚糖發(fā)酵產(chǎn)物，具體為真菌葡聚糖溶液，是由大型真菌發(fā)酵產(chǎn)生的高粘度胞外多糖所組成，其固形物含量按重量比為1.03.0%;本發(fā)明的技術(shù)方案中，植物合生元組合物制劑各成分的配比進一步優(yōu)選為植物合生元組合物制劑由90份95份益生菌發(fā)酵液，0.05份1.5份益生元，3份6份穩(wěn)定劑組成植物合生元，其中益生菌和益生元組成植物合生元的比例范圍為5055份l份。植物合生元制劑的技術(shù)原理如下植物益生菌為復合菌液，主要是為了發(fā)揮不同菌株的固氮解磷解鉀等基本功能，促進植物對氮磷鉀的吸收利用；另一方面，使植物益生菌在植物根際形成優(yōu)勢菌群，抑制有害菌的增殖，形成競爭性抑制；植物益生元為不同來源的低聚糖或寡聚糖，本身可誘導植物自身防御系統(tǒng)的功能，提高植物的免疫能力和抗病力；另一方面，植物益生元可促進益生菌的增長，促進其形成優(yōu)勢菌群，二者協(xié)同作用，促進植物生長，提高產(chǎn)量。植物合生元制劑中所述的的低聚糖或寡聚糖含量按重量比為發(fā)酵液總量的0.05-1.5%，相當于低聚糖或寡聚糖的濃度為20-900Pg/mL，此濃度范圍經(jīng)灌溉使用后為促進植物生長的適宜濃度。本發(fā)明的另一目的是提供植物合生元制劑的制備方法。一種合生元制劑制備方法，按下述步驟進行1)、益生菌的發(fā)酵①、發(fā)酵方式為不同菌株分別單獨培養(yǎng)，三級發(fā)酵，逐級放大，放大比率為1:520V/V;②、制種將不同的菌種接入不同的滅菌平板培養(yǎng)基上，在溫度32。C37。C恒溫培養(yǎng)48h，在無菌操作臺上，用1015mL無菌水將菌落上的菌體充分懸浮，轉(zhuǎn)入滅菌的茄形瓶中，在溫度32。C37"C恒溫培養(yǎng)48h，溫度80。C處理10min，用于發(fā)酵罐接種；◎、發(fā)酵各級發(fā)酵罐按照培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基原料均應充分粉碎到100目，鈣鹽和鎂鹽單獨溶解后再與其它溶混合，溫度12rc滅菌20min，冷卻至4(TC以下，接入制備好的液體菌種開始發(fā)酵；、一級種子罐發(fā)酵周期2024h，二級種子罐發(fā)酵周期2024h，種子罐的移種時間為至鏡檢開始產(chǎn)芽孢時，將種子罐中的發(fā)酵液打入下一級發(fā)酵罐，發(fā)酵罐發(fā)酵周期為3648h，鏡檢芽孢率達90%以上放罐；培養(yǎng)條件裝料系數(shù)為70%,液體種子接種量為210%V/V，培養(yǎng)基C/N為2040/3，PH為6.57.5，前期溫度28°C-30°C，后期溫度34°C-36°C，罐內(nèi)壓力0.03-0.08Mp，攪拌轉(zhuǎn)速100160r/min;不同菌種用不同的培養(yǎng)基單獨發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束時，不同菌種的培養(yǎng)物中，芽孢數(shù)量為250X10&fii/ml;2)、菌量調(diào)整不同菌株發(fā)酵結(jié)束時所含的芽孢數(shù)量有較大差異，而作為植物益生菌來講，以提供氮磷鉀為目的，植物對各種營養(yǎng)所需的量不同，因此相對應的不同種類的芽孢數(shù)量不等，需要對原料發(fā)酵液的菌量進行調(diào)整，調(diào)整方法如下取1050mL量的發(fā)酵液樣品，溫度80'C處理10min，在各自專用的培養(yǎng)基上，用平板稀釋法進行芽孢數(shù)定量，取得基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，計算稀釋倍率，按照不同菌種的培養(yǎng)基配方，只取其中的無機鹽成分，配制成不同的稀釋液，根據(jù)稀釋倍率進行稀釋；取其培養(yǎng)基所含的無機鹽成分和比例的目的，是維持稀釋液的成分和原發(fā)酵液基本一致，避免稀釋后芽孢在儲藏期內(nèi)萌發(fā)；不同菌株發(fā)酵液稀釋后的芽孢數(shù)量范圍為枯草芽孢桿菌3-12X109cfu/ml，巨大芽孢桿菌1-6X109cfu/ml，膠質(zhì)芽孢桿菌0.6-4X109cfu/ml;3)、配制將步驟2)中經(jīng)過調(diào)整的發(fā)酵液，按照等比例V/V混合，攪拌均勻；加入寡聚糖，加入量按重量比為總量的0.05-1.5%,使配制液中的寡糖濃度達到20—900ug/ml;再加入葡聚糖，加入量按重量比為發(fā)酵液總量的310%(V/V)，攪拌，使物料充分懸??；4)、均質(zhì)混合將步驟3)中混合的物料用膠體磨處理，再行分裝即得產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明所提供的作為植物合生元的微生物肥料使用效果菌液與各個寡聚糖的組合有較明顯的協(xié)同作用，對標志溫室大棚黃瓜生長狀況的節(jié)間、葉色、巻須、雌花指數(shù)均有提高，其中主要表現(xiàn)在對節(jié)間、葉色、巻須指數(shù)的提高上，促生作用均好于傳統(tǒng)的施用尿素對照。綜合指數(shù)增長之和達到23.7，綜合指數(shù)增加60.14%。在祛病、固氮、解磷、解鉀等混合菌液中加入寡聚糖對黃瓜有比較明顯的增產(chǎn)作用，沖施本品51天后，大棚黃瓜比對照均增產(chǎn)29.1%。在祛病、固氮、解磷、解鉀等混合菌液中加入寡聚糖能明顯提高對黃瓜促生作用，使黃瓜的生長性狀更加良好，即生長穩(wěn)健、節(jié)間在8-10厘米、均勻一致；葉色平展、墨綠、增厚、缺刻深淺、基本沒有生理病變；巻須粗壯且長、尖端翠綠、與莖夾角合理；雌花在距頂端距離50厘米左右開放、花瓣大、色鮮艷、子房較長。復合菌液加寡聚糖的促生、增產(chǎn)作用主要是因為其中的固氮菌、解磷、解鉀菌能增加土壤養(yǎng)份，提高化肥利用率，改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，促進通氣性、保水性及排水性，克服日光溫室重茬連作障礙；寡聚糖在為固氮菌、解磷、解鉀菌提供繁殖營養(yǎng)的同時，能抑制病菌產(chǎn)生的毒性、啟動作物的自身免疫系統(tǒng)，去病除害，減少使用殺菌農(nóng)藥；抗寒、抗熱、抗旱、抗?jié)?、抗鹽堿、抗肥害、抗藥害、抗營養(yǎng)失衡；復合功能菌分泌的大量抗生素等物質(zhì)，能促進黃瓜根系伸長、毛細根良好發(fā)育，促進開花結(jié)實。具體實施方式下面對本發(fā)明的內(nèi)容及實施例作進一步說明植物合生元中的主要成分為植物益生菌，由以下菌株構(gòu)成枯草芽孢桿菌(泡"hssW"s)，菌種編號為ACCC01199,產(chǎn)酶微生物，分解有害菌細胞壁；枯草芽孢桿菌(^sc27ms"Z"s)，菌種編號為ACCC01698，固氮；蠟樣芽胞桿菌(萬a^77"scerezA)，菌種編號為ACCC01102,產(chǎn)酶微生物，分解有害菌細胞壁；巨大芽孢桿菌(^S3d7^s727e^3Z^rA朋)，菌種編號為ACCC02954，解磷，同時具有固氮作用；膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，菌種編號為ACCC02983,解鉀菌，同時具有固氮作用。以上菌株均為市售菌株。植物合生元中的另一主要成份為益生元，由以下寡糖中的1種或2種或3種構(gòu)成，分別是真菌寡糖、氨基寡糖、低聚葡聚糖、甘露寡糖、半乳甘露寡糖、木寡糖、果寡糖、低聚異麥芽糖等，寡糖的形態(tài)是粉末狀或糖漿，均為市售產(chǎn)品。各種寡糖分子量低，水溶性好，易于農(nóng)作物吸收利用。合生元中寡糖的作用主要是(1)抗病作用，通過誘導植物自身的免疫反應，使植物提高抵抗病原微生物的抗性；(2)抑菌作用，通過競爭性抑制，使病原微生物和有害菌的生長受到抑制；(3)調(diào)節(jié)植物根際微生物的有益菌群，通過寡糖本身益生元的作用，促進肥料中各種芽孢桿菌生長繁殖，發(fā)揮固氮、解磷和解鉀的作用，同時促進土壤中有益微生物增殖，進而促進植物生長；(4)改善土壤狀況，在增加土壤有益微生物菌群的同時，使土壤有機質(zhì)含量增加，結(jié)構(gòu)疏松，保水能力增強。合生元中的另一輔助成分為穩(wěn)定劑，是一種發(fā)酵生產(chǎn)的高粘度葡聚糖和低聚糖的混合物制品，其作用是一方面使植物合生元中的益生菌充分懸浮，在制劑中分布均勻，保持液體制劑的穩(wěn)定性；另一方面起到促進土壤團粒結(jié)構(gòu)的形成并維持充足的水分。實施例l一種微生物肥料一植物合生元組合物制劑，按重量比，該制劑由85份99份益生菌，0.05份3.5份益生元，1.5份10份穩(wěn)定劑組成植物合生元，其中益生菌和益生元組成植物合生元的比例范圍為3060份l份(W/W)。說明書第10/16頁一種合生元制劑制備方法，按下述步驟進行1)、益生菌的發(fā)酵①、制種將不同的菌種接入不同的滅菌平板培養(yǎng)基上，在溫度32'C37。C恒溫培養(yǎng)48h，在無菌操作臺上，用1015mL無菌水將菌落上的菌體充分懸浮，轉(zhuǎn)入滅菌的茄形瓶中，在溫度32-C37。C恒溫培養(yǎng)48h，溫度8(TC處理10min，用于發(fā)酵罐接種；②、發(fā)酵各級發(fā)酵罐按照培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基原料均應充分粉碎到100目，鈣鹽和鎂鹽單獨溶解后再與其它溶混合，溫度12rc滅菌20min，冷卻至4(TC以下，接入制備好的液體菌種開始發(fā)酵；③、發(fā)酵方式為不同菌株分別單獨培養(yǎng)，三級發(fā)酵，逐級放大，放大比率為1:520V/V;—級種子罐發(fā)酵周期2024h，二級種子罐發(fā)酵周期2024h，種子罐的移種時間為至鏡檢開始產(chǎn)芽孢時，將種子罐中的發(fā)酵液打入下一級發(fā)酵罐，發(fā)酵罐發(fā)酵周期為3648h，鏡檢芽孢率達90%以上放罐；培養(yǎng)條件裝料系數(shù)為70%，液體種子接種量為10%V/V，培養(yǎng)基C/N為20/3，PH為6.57.5，前期溫度28。C-3C)。C，后期溫度34°C-36°C，罐內(nèi)壓力0.03-0.08Mp，攪拌轉(zhuǎn)速100160r/min;不同菌種用不同的培養(yǎng)基單獨發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束時，不同菌種的培養(yǎng)物中，芽孢數(shù)量為250Xl(^cfu/ml;2)、菌量調(diào)整不同菌株發(fā)酵結(jié)束時所含的芽孢數(shù)量有較大差異，而作為植物益生菌來講，以提供氮磷鉀為目的，植物對各種營養(yǎng)所需的量不同，因此相對應的不同種類的芽孢數(shù)量不等，需要對原料發(fā)酵液的菌量進行調(diào)整，調(diào)整方法如下取1050mL的發(fā)酵液樣品，用8(TC溫度處理10min，在各自專用的培養(yǎng)基上，用平板稀釋法進行芽孢數(shù)定量，取得基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，計算稀釋倍率，按照不同菌種的培養(yǎng)基配方，只取其中的無機鹽成分，配制不同的稀釋液，根據(jù)稀釋倍率進行稀釋；不同菌株發(fā)酵液稀釋后的芽孢數(shù)量范圍為枯草芽孢桿菌3-12X109cfu/ml，巨大芽孢桿菌1-6X109cfu/ml，膠質(zhì)芽孢桿菌0.6-4X109cfu/ml;3)、配制將步驟2)中經(jīng)過調(diào)整的發(fā)酵液，按照等比例V/V混合，攪拌均勻；加入寡聚糖，加入量按重量比為總量的0.05-1.5%，使配制液中的寡糖濃度達到20一900ug/ml;再加入葡聚糖，加入量按重量比為發(fā)酵液總量的3109GV/V，攪拌，使物料充分懸?。?)、均質(zhì)混合將步驟3)中混合的物料用膠體磨處理，再行分裝即得產(chǎn)品。實施例2一種微生物肥料一植物合生元組合物制劑，按重量比，該制劑由90份95份益生菌，0.05份2.0份益生元，3份6份穩(wěn)定劑組成植物合生元，其中益生菌和益生元組成植物合生元的比例范圍為4560份1份(W/W)。一種合生元制劑制備方法，按下述步驟進行1)、益生菌的發(fā)酵①、制種將不同的菌種接入不同的滅菌平板培養(yǎng)基上，在溫度35t恒溫培養(yǎng)48h，在無菌操作臺上，用15mL量無菌水將菌落上的菌體充分懸浮，轉(zhuǎn)入滅菌的茄形瓶中，在溫度35。C恒溫培養(yǎng)48h，溫度80。C處理10min，用于發(fā)酵罐接種；②、發(fā)酵各級發(fā)酵罐按照培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基原料均應充分粉碎到100目，鈣鹽和鎂鹽單獨溶解后再與其它溶混合；溫度i2rc滅菌20min，冷卻至4(TC以下，接入制備好的液體菌種開始發(fā)酵；◎、發(fā)酵方式為不同菌株分別單獨培養(yǎng)，三級發(fā)酵，逐級放大，放大比率為1:15(V/V);—級種子罐發(fā)酵周期2024h,二級種子罐發(fā)酵周期2024h，種子罐的移種時間為至鏡檢開始產(chǎn)芽孢時，將種子罐中的發(fā)酵液打入下一級發(fā)酵罐，發(fā)酵罐發(fā)酵周期為3648h，鏡檢芽孢率達90%以上放罐；培養(yǎng)條件裝料系數(shù)為70%，液體種子接種量為5%V/V，培養(yǎng)基C/N為20/3，PH為6.57.5，前期溫度28。C-30°C，后期溫度34°C-36°C，罐內(nèi)壓力0.03-0.08Mp，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min;不同菌種用不同的培養(yǎng)基單獨發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束時，不同菌種的培養(yǎng)物中，芽孢數(shù)量為250Xl(^cfu/ml;2)、菌量調(diào)整按實施例1的方法進行；不同菌株發(fā)酵液稀釋后的芽孢數(shù)量范圍為枯草芽孢桿菌8X109cfu/ml，巨大芽孢桿菌4.8X109cfu/ml，膠質(zhì)芽孢桿菌3.2X109cfu/ml;3)、配制將步驟2)中經(jīng)過調(diào)整的發(fā)酵液，按照等比例V/V混合，攪拌均勻；加入寡糖，加入量為總量的1.5%，使配制液中的寡糖濃度達到900ug/ml;再加入葡聚糖，加入量按重量比為發(fā)酵液總量的6%(V/V)，攪拌，使物料充分懸?。?)、均質(zhì)混合將步驟3)中混合的物料用膠體磨處理，再行分裝即得產(chǎn)品。實施例3枯草芽孢桿菌(萬aoz7"ss""力"s)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、瓊脂20g、水1000ml，pH7.2?？莶菅挎邨U菌液體培養(yǎng)基:豆栢1000g、白糖1000g、CaC03500g、NaCl30g、kCl30g、MgS0430g、(NH4)2S0450g、MnS043g、FeS043g、水IOOL?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)特性生長最高溫度為40-50°C，生長最適溫度33-37。C，發(fā)酵最適溫度29-33°C，最適PH為5.5-8.5。枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征革蘭氏陽性桿菌，大小約0.6-0.8X1.5-3.0微米。生長在葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的細胞染色均勻，運動。芽孢呈橢圓形，芽孢中生或偏中生，不膨大或稍有膨大。菌落圓形、表面色暗、粗糙、邊緣不整齊。發(fā)酵罐液體培養(yǎng)條件裝料系數(shù)為70%，液體種子接種量為10%(V/V)。培養(yǎng)基C/N為20/3，PH為6.57.5，前期溫度28-30°C,后期溫度34-36°C，罐內(nèi)壓力0.03-0.08Mp，攪拌轉(zhuǎn)速125r/min。液體發(fā)酵培養(yǎng)特征發(fā)酵初期菌液為乳白色，菌數(shù)增加量很小，PH變化不大，無泡沫產(chǎn)生。6小時后，菌數(shù)呈對數(shù)增加，攪拌有泡沬產(chǎn)生。18小時后，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗及PH的變化，菌數(shù)基本穩(wěn)定，30小時后，溫度升至35。C，此時泡沫產(chǎn)生越來越多，直至培養(yǎng)40小時以上，90%已經(jīng)成芽孢，此時PH5.8-6.0,菌液顏色變深，培養(yǎng)完成。約兩天完成一個發(fā)酵培養(yǎng)周期。培養(yǎng)結(jié)束時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量為3050X10&fu/mL。實施例4巨大芽孢桿菌(萬ac/7i/s/Z7e^ate2^/yz7)的培養(yǎng)巨大芽孢桿菌斜面培養(yǎng)蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl5g、瓊脂20g、水滿0ml，pH7.2。液體培養(yǎng)基豆栢700g、白糖700g、CaC03350g、NaCl21g、kCl21g、MgS0421g、(NH4)2S0435g、MnS042.lg、FeS042.lg、水50L。培養(yǎng)特性好氧生長，在普通肉湯培養(yǎng)24小時中呈渾濁，有沉淀物，生長最高溫度為45°C，最適PH為7-7.5。巨大芽孢桿菌的形態(tài)特征桿菌，大小約1.2-1.5X2.0-5.0微米，革蘭氏陽性反應，運動，幼齡菌用呂氏美蘭染色著色不均一，蘇丹黑染色菌體內(nèi)有藍黑色顆粒。芽孢呈橢圓形，中生或偏中生，胞囊不膨大。菌落扁平、內(nèi)陷有光澤、潤濕、邊緣較整齊，乳白色不透明。液體培養(yǎng)條件裝料系數(shù)為70%，液體種子接種量為10%(V/V)。培養(yǎng)基C/N為20/3，PH為6.57.5，前期溫度28-30°C，后期溫度34-36°C，罐內(nèi)壓力0.03-0.08Mp，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min。培養(yǎng)結(jié)束時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量為4—20X109cfu/mL。實施例5膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基蔗糖10g、磷酸氫二鈉2g、FeC13，0.5%，lml、玻璃粉lg、CaC030.lg、MgS040.5g、瓊脂20g、水1000ml，pH7.0。液體培養(yǎng)基白糖140g、淀粉420g、CaC0370g、(NH4)2S0470g、MnS0470g、K2HP04140g、FeC133.5g、水50L,pH7.0。膠質(zhì)芽孢桿菌的形態(tài)特征粗長桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色反應不定，產(chǎn)生聚P-羥基丁酸鹽(PHB)顆粒。菌體大小為(1.01.2)X(2.57.0)nm，菌體周圍有厚莢膜。芽孢壁厚，橢圓形，中生或近端生，芽孢囊不膨大或微膨大。菌落圓形，無色，隆起，膠質(zhì)粘稠，透明或半透明，邊緣整齊。好氧或兼性厭氧生長，水解淀粉，接觸酶反應陽性，氧化酶和卵磷脂酶反應陰性，在無氮培養(yǎng)基上生長良好，生長溫度10。C45。C。液體培養(yǎng)條件裝料系數(shù)為70%，液體種子接種量為10%(V/V)。培養(yǎng)基C/N為20/3，PH為6.57.5，前期溫度28-30°C，后期溫度34-36。C，罐內(nèi)壓力0.03-0.08Mp，攪拌轉(zhuǎn)速140r/min。培養(yǎng)結(jié)束時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量為2—10X10gcfu/ml。本實施例其他步驟同實施例1實施例6膠質(zhì)芽孢桿菌菌量的調(diào)整按上述實施例5所述的工藝條件發(fā)酵膠質(zhì)芽孢桿菌，發(fā)酵結(jié)束時，經(jīng)測定膠質(zhì)芽孢桿菌的芽孢數(shù)為3.6X109cfu/ml，終產(chǎn)品中要求膠質(zhì)芽孢桿菌的量為0.6X109cfu/ml，需要進行比例稀釋。按下述成分比例配制稀釋液，CaC0370g、(NH4)2S0470g、MnS0470g、K2HP04140g、FeCl33.5g、水50L，pH7.0。取l份(V/V)發(fā)酵液，加入到l份(V/V)稀釋液中，再按l:1:l的比例與其他發(fā)酵液混合，攪拌均勻，混合液中的膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢數(shù)即為0.6X109cfu/mL。其他菌株的發(fā)酵液的芽孢數(shù)量也如法調(diào)整。實施例7本發(fā)明具體應用本發(fā)明產(chǎn)品植物合生元在黃瓜上的使用效果見下表。將標志黃瓜生長狀況的節(jié)間、葉色、巻須、雌花等主要項目調(diào)查數(shù)據(jù)按照以下公式計算"生長綜合指數(shù)"，記入表一；數(shù)值越大，表明該項狀況越好。生長綜合指數(shù)(％)=[E(級別代表值X本級株數(shù))/(檢查總株數(shù)X最高級別代表值)]X100%，式中S是各級乘積數(shù)值的總和。其他指標計算方法相同。促生結(jié)果見表l、表2。促育結(jié)果見表3。增產(chǎn)結(jié)果見表4。各表數(shù)據(jù)顯示，植物合生元對大棚黃瓜有促進生長、促進果實發(fā)育和增產(chǎn)的效果。表l沖施后20天黃瓜生長狀況(三重復綜合指數(shù)平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2沖施后20天黃瓜生長狀況比較(三重復綜合指數(shù)平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3沖施后20天黃瓜發(fā)育狀況(三重復綜合指數(shù)平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4沖施后51夭黃瓜總產(chǎn)量(三重復定點55株平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1一種微生物肥料-植物合生元組合物制劑，其特征在于按重量比，該制劑由85份～99份益生菌發(fā)酵液，0.05份～3.5份益生元，1.5份～10份穩(wěn)定劑組成植物合生元，其中益生菌和益生元組成植物合生元的比例范圍為30～60份1份，所述的益生菌包括枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌、固氮細菌、解磷細菌、轉(zhuǎn)化鉀化物的微生物、巨大芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌，發(fā)酵液由枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌組成，按體積比，枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶膠質(zhì)芽孢桿菌為1∶1∶1配制，其中各種菌株的芽孢數(shù)量比例為枯草芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶膠質(zhì)芽孢桿菌為5∶3∶2。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物肥料一植物合生元組合物制劑，其特征在于按重量比，該制劑由90份95份益生菌發(fā)酵液，0.05份L5份益生元，3份6份穩(wěn)定劑組成植物合生元，其中益生菌和益生元組成植物合生元的比例范圍為5055份l份。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物肥料一植物合生元組合物制劑，其特征在于所述的益生元包括由低聚糖或寡聚糖中的1種或多種復合組成，其中的低聚糖為真菌葡聚糖、酵母葡聚糖、田菁膠、瓜兒豆膠、魔芋膠；其中的寡聚糖為真菌寡糖、寡葡聚糖、氨基寡糖、木寡糖、甘露寡糖、甘露半乳寡糖，所述的低聚糖或寡聚糖含量為發(fā)酵液總量的0.05-1.5%，最終的低聚糖或寡聚糖濃度為20-900ug/mL。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物肥料一植物合生元組合物制劑，其特征在于所述的穩(wěn)定劑為真菌葡聚糖溶液，是由大型真菌發(fā)酵產(chǎn)生的高粘度胞外多糖所組成，其固形物含量按重量比為1.03.0%，加入量為1.510%(V/V)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物肥料一植物合生元組合物制劑，其特征在于所述益生菌的生物活性孢子體的數(shù)量為616X109cfU/mL。6、一種權(quán)利要求1所述的合生元制劑制備方法，按下述步驟進行-1)、益生菌的發(fā)酵①、發(fā)酵方式為不同菌株分別單獨培養(yǎng)，三級發(fā)酵，逐級放大；②、制種將不同的菌種接入不同的滅菌平板培養(yǎng)基上，再擴繁到滅菌的茄形瓶中，培養(yǎng)結(jié)束時，溫度8(TC處理10min，用于發(fā)酵罐接種；③、發(fā)酵各級發(fā)酵罐按照培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接入制備好的液體菌種開始發(fā)酵；、經(jīng)過一級種子罐發(fā)酵、二級種子罐發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵三級發(fā)酵，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液鏡檢芽孢率達90%以上時放罐；發(fā)酵結(jié)束時，不同菌種的培養(yǎng)物中，芽孢數(shù)量為250X10gcfu/ml;2)、菌量調(diào)整不同菌株發(fā)酵液調(diào)整后的芽孢數(shù)量范圍為枯草芽孢桿菌3-12X109cfu/ml，巨大芽孢桿菌1-6X109cfu/ml，膠質(zhì)芽孢桿菌0.6-4X109cfu/ml;3)、配制將步驟2)中經(jīng)過調(diào)整的發(fā)酵液，按照等比例V/V混合，攪拌均勻；加入寡聚糖，加入量按照重量比W/W為總量的0.05-1.5%;再加入液體葡聚糖，加入量為最終混合物總量的3i(mv/v，攪拌，使物料充分懸?。?)、均質(zhì)混合將步驟3)中混合的物料用膠體磨處理，再行分裝即得產(chǎn)品。7、根據(jù)權(quán)力要求6所述的合生元制劑制備方法，其特征在于菌量調(diào)整時取1050mL量的發(fā)酵液樣品，用8(TC溫度處理10min，在各自專用的培養(yǎng)基上，用平板稀釋法進行芽孢數(shù)定量，取得基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，計算稀釋倍率，按照不同菌種的培養(yǎng)基配方，只取其中的無機鹽成分，配制不同的稀釋液，根據(jù)稀釋倍率進行稀釋。全文摘要本發(fā)明公開了微生物肥料-植物合生元組合物制劑及合生元制劑制備方法。該組合物制劑由益生菌，益生元，穩(wěn)定劑組成植物合生元，芽孢桿菌組成發(fā)酵液，合生元制劑制備方法步驟益生菌的發(fā)酵，菌量調(diào)整，配制，均質(zhì)混合即得產(chǎn)品。制劑中的固氮菌、解磷、解鉀菌能增加土壤養(yǎng)份，提高化肥利用率，改善土壤團粒結(jié)構(gòu)，促進通氣性、保水性及排水性，克服日光溫室重茬連作障礙；制劑中的寡糖益生元能刺激作物提高對病原微生物的抗性，同時又促進益生菌的定植和增殖；能抑制病菌產(chǎn)生的毒性、啟動自身免疫系統(tǒng)，去病除害，減少殺菌農(nóng)藥；抗寒、抗熱、抗旱、抗?jié)场⒖果}堿、抗肥害、抗藥害、抗營養(yǎng)失衡；能促進植物根系伸長、毛細根良好發(fā)育，促進開花結(jié)果。文檔編號C05G3/00GK101591199SQ20091002303公開日2009年12月2日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者劉甲啟,張心青,徐澤平,戴榮華,楊傳倫,王寶琴,王秀芝,蘆曉飛,蘇亞平,振門申請人:西安德龍生物科技有限公司