專利名稱：采集扇貝高濃度精液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，系貝類遺傳育種研究中的技術(shù)改進(jìn)，是一種在扇貝繁殖盛期采集高濃度、高成熟率和低激活率扇貝精液的技術(shù)方法。

背景技術(shù)：
精液的采集一般是指人工授精研究或在生殖障礙研究中以獲取精液為研究對(duì)象的技術(shù)方法。
目前收集貝類精液大多采用解剖法和自然排放法，前者不能保證所得到的精子完全成熟，后者不能避免精子過(guò)早被海水激活。如鮑魚精液的收集通常采用陰干和升溫相結(jié)合誘導(dǎo)親鮑排精，再離心濃縮產(chǎn)至海水中的精子[Liliana Salinas-Flores等，Journal of shellfish，2005，24(2)415-420；Gwo Jin-Chywan等，Theriogenology，2002，581563-1578]，但離心濃縮所得到精子因長(zhǎng)時(shí)間與海水接觸，能量損失相對(duì)較多；Hughes(Cryobiology，1973，10342-344)和Zell等(Cryobiology，1979，16448-460)研究表明這種海水—精子混合物用于牡蠣精子冷凍效果并不理想，而采用解剖性腺組織的方法獲得精液比較成功，但同樣不能保證所獲得的精子完全成熟，且精液中殘留不少其它的組織細(xì)胞。通過(guò)對(duì)扇貝的精子冷凍保存及授精試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一種采集高濃度、高成熟率和低激活率扇貝精液的方法，目前尚未見有關(guān)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用一種便捷的方法收集到高濃度、高成熟率和低激活率的扇貝精子，以適用于精子冷凍保存和授精試驗(yàn)的研究，為克服扇貝育種過(guò)程中遠(yuǎn)緣雜交生殖隔離以及不同地域不同時(shí)間開展品種改良的難題鋪平道路，以期在培育出生長(zhǎng)快、抗逆能力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)親貝的基礎(chǔ)上，收集高濃度且品質(zhì)佳的扇貝精液，用于培育優(yōu)質(zhì)苗種，從而有效遏制目前存在的品質(zhì)下降，大面積死亡問(wèn)題，為扇貝養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展提供了一條新的出路。
本發(fā)明是按照以下操作方法完成的 它的方法包括1、優(yōu)質(zhì)親貝的培育；2、制備吸取精液的吸頭；3、高濃度精液的采集；4、檢測(cè)收集精子的活力。
1、優(yōu)質(zhì)親貝的培育以殼高為標(biāo)準(zhǔn)，從養(yǎng)殖海區(qū)選擇生長(zhǎng)速度快，健康活潑的雄性扇貝進(jìn)行暫養(yǎng)。蝦夷扇貝殼高9～11cm，暫養(yǎng)密度每立方米水體20個(gè)，暫養(yǎng)水溫4～8℃；櫛孔扇貝殼高6～7cm，暫養(yǎng)密度每立方米水體80個(gè)，暫養(yǎng)水溫14～16℃。投喂硅藻、金藻及螺旋藻，每天倒池一次。
2、制備吸取精液的吸頭材料為200μL黃顏色的吸頭，吸頭尖端用鋒利的刀片略微傾斜削去部分(0.5-1cm)并修平整，使其既能在腎孔端附近扎破腎管，又可盡量減少吸力和毛邊對(duì)精子的機(jī)械損傷。
3、高濃度精液的采集待親貝性腺充分成熟、個(gè)別出現(xiàn)排精現(xiàn)象時(shí)，挑選性腺飽滿的雄貝，陰干升溫刺激使其排放精子，觀察到排精后，立即從海水中取出，用制備的200μl吸頭，在腎孔端附近扎破腎管并吸取精液，放入冰上預(yù)冷的Eppendorf管中備用。
4、檢測(cè)所收集精子的活力取5μL精液，用195μL海水稀釋40倍，將計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的載物臺(tái)上，蓋上蓋玻片；迅速取一滴稀釋的精液于血球計(jì)數(shù)板蓋玻片的邊緣使精液自動(dòng)均勻滲進(jìn)計(jì)數(shù)室；置于200倍或400倍顯微鏡下觀察精子活動(dòng)情況，借助計(jì)數(shù)板上的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格進(jìn)行目測(cè)計(jì)數(shù)，觀察精子濃度及各活動(dòng)類型的精子數(shù)目；精子的活動(dòng)有三種類型前進(jìn)運(yùn)動(dòng)、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)和僅尾巴擺動(dòng)運(yùn)動(dòng)，評(píng)價(jià)精子活力是根據(jù)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)多少及其占全部精子數(shù)的百分比來(lái)確定，所測(cè)精子的活力達(dá)到80-100％。
與已有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明技術(shù)具有如下特點(diǎn) 1.收集方法簡(jiǎn)單，易于操作。只需了解扇貝的生殖腺及排泄器官的解剖結(jié)構(gòu)，精確辨別出腎管便可進(jìn)行精液的采集。一般雄性蝦夷扇貝通過(guò)該方法可收集到約1.5mL精液/只，櫛孔扇貝可收集到約0.6mL精液/只。
2.采用本方法獲得的精液濃度高，為0.2-1.6×109個(gè)/mL；成熟度也高，高達(dá)100％，因?yàn)榫又挥谐浞殖墒煲院蟛拍苓B同精液一起排放到腎管中，再?gòu)哪I孔排出至體外；腎管中的海水很少，因而精子基本上不被激活。

具體實(shí)施例方式 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明 最佳實(shí)施例具體操作工藝過(guò)程 2005年3-6月份，以殼高為標(biāo)準(zhǔn)，選擇生長(zhǎng)速度快，健康活潑的扇貝進(jìn)行暫養(yǎng)，建立優(yōu)質(zhì)親貝群體；從此群體中挑選性腺發(fā)育成熟的雄性個(gè)體，用200μL黃顏色的吸頭在腎孔端附近扎破腎管，吸取并收集精液。通過(guò)精子活力監(jiān)測(cè)、超低溫冷凍保存及授精試驗(yàn)，證明本方法所獲得的精液具有高濃度、高成熟度和低激活率的特點(diǎn)。
完成上述操作過(guò)程具體操作如下 其步驟包括1.優(yōu)質(zhì)親貝的培育；2.親貝生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)觀察；3.制備吸取精液的吸頭；4.精液收集方法的比較及精子質(zhì)量的評(píng)價(jià)；5.驗(yàn)證檢測(cè)后的精液質(zhì)量。
1.優(yōu)質(zhì)親貝的培育 以殼高為標(biāo)準(zhǔn)，選擇生長(zhǎng)速度快，健康活潑的雄性扇貝進(jìn)行暫養(yǎng)。3月份，從養(yǎng)殖海區(qū)挑選殼高9～11cm的蝦夷扇貝雄貝，移入室內(nèi)進(jìn)行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)密度每立方米水體20個(gè)，暫養(yǎng)水溫由開始的3-4℃，每天升溫1℃至8℃恒溫培育；4月份，從養(yǎng)殖海區(qū)挑選殼高6～7cm的櫛孔扇貝雄貝，移入室內(nèi)進(jìn)行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)密度每立方米水體80個(gè)，暫養(yǎng)水溫由開始的12-13℃，每天升溫1℃至16℃恒溫培育。暫養(yǎng)過(guò)程中每天倒池一次，投喂硅藻、金藻及螺旋藻。
2.親貝生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)觀察 2005年4月份，對(duì)親貝扇貝泄殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖觀察，扇貝的主要生殖器官為一對(duì)囊狀的生殖腺，排泄器官為一對(duì)腎臟，腎臟各由一海綿狀腺體及一具纖毛的薄壁短管狀體構(gòu)成，前者的腎口開口于圍心腔；后者的腎孔(泄殖孔)開口于外套腔中，附于閉殼肌的前方，介于生殖腺及左右兩鰓之間，呈長(zhǎng)囊形。代謝廢物和生殖產(chǎn)物都由腎孔排出。腎孔位于腎的末端腹面。生殖腺的前端兩側(cè)突出部上，左右各有一個(gè)約1毫米長(zhǎng)的裂縫，與腎臟相通，稱腎生殖孔。在繁殖季節(jié)，成熟個(gè)體的生殖腺極為飽滿，成熟的精子或卵子通過(guò)左右兩側(cè)的裂孔進(jìn)入腎臟，然后從左右腎孔(泄殖孔)排出體外。腎管中的精液僅含有少量組織殘跡和生理組分，精液濃度高，為0.2-1.6×109個(gè)/mL。
3.制備吸取精液的吸頭在準(zhǔn)備收集精液之前，將96支200μL黃顏色的吸頭尖端用鋒利的刀片略微傾斜削去部分(0.5-1cm)并修平整，使其既能在腎孔端附近扎破腎管，又可盡量減少吸力和毛邊對(duì)精子的機(jī)械損傷。制備好的槍頭裝入槍頭盒中，密閉高溫高壓消毒備用。
4.精液收集方法的比較及精子質(zhì)量的評(píng)價(jià) 雄貝性腺發(fā)育成熟時(shí)，采用三種不同的方法收集精液A.解剖法將性腺剪切成碎塊放于500目篩絹上，海水沖洗濾出精液至冰上預(yù)冷的小燒杯中；B.腎管處吸取法陰干升溫刺激雄貝，排精后立即從海水中取出，用200μl的吸頭在腎管處吸取精液，放入冰上預(yù)冷的Eppendorf管中備用，對(duì)于普通大小的雄性蝦夷扇貝，通過(guò)該方法可收集到約1.5mL精液/只，對(duì)于一般大小的雄性櫛孔扇貝，可收集到約0.6mL精液/只；C.離心濃縮法用離心管收集排入海水中的精液，經(jīng)冷凍離心，濃縮的精液存于10ml離心管內(nèi)冰上預(yù)冷備用。為消除扇貝個(gè)體間的差異，每種方法收集的精液均來(lái)源于同一批扇貝的多個(gè)個(gè)體。
取5μL精液，用195μL海水稀釋40倍，將擦洗干凈的計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的載物臺(tái)上，蓋上蓋玻片。迅速取一滴稀釋的精液于血球計(jì)數(shù)板蓋玻片的邊緣使精液自動(dòng)滲進(jìn)計(jì)數(shù)室，注意不要使精液溢出蓋玻片，并不可使精液不夠而致計(jì)數(shù)室內(nèi)有氣泡或干燥之處，如有這些現(xiàn)象應(yīng)重做。置于200倍或400倍暗視野顯微鏡下觀察精子活動(dòng)情況，借助計(jì)數(shù)板上的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格進(jìn)行目測(cè)計(jì)數(shù)，估計(jì)精子濃度，觀察活動(dòng)與不活動(dòng)的精子數(shù)目。數(shù)出計(jì)數(shù)室的四角及中央共五個(gè)大方格即80個(gè)小方格內(nèi)的精子數(shù)。計(jì)數(shù)每小格內(nèi)的精子，只數(shù)格內(nèi)及壓在左線和上線者。前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占全部精子數(shù)的百分比為精子活力，所測(cè)精子的活力均大于80％。
5.驗(yàn)證檢測(cè)后的精液質(zhì)量 通過(guò)精子超低溫冷凍保存和授精試驗(yàn)，以驗(yàn)證精液收集方式與所采集精液質(zhì)量的關(guān)系。結(jié)果表明，三種方法收集的精液冷凍前精子的活力差異不顯著，但冷凍后由B方法收集到的精液冷凍效果最好，解凍后精子活力為49.3±6.1％，而A和C所得的凍精活力分別為25.7±4.0％、28.7±1.5％，與B的結(jié)果相比差異顯著(p<0.05)。因?yàn)閺哪I管處收集的精子其外圍環(huán)境更接近生理狀態(tài)，且比較高的精子濃度限制了精子活動(dòng)，使精子能量保存較好，適合用于精子冷凍保存。由B方法收集到的精液受精能力亦強(qiáng)，在與同一批卵子受精時(shí)，其受精率明顯高于A和C方法，高達(dá)95％。
通過(guò)我們發(fā)明的這種精液收集方法所采集的精液除了可用于精子超低溫冷凍保存和受精試驗(yàn)外，還可考慮用于基于精子為載體的轉(zhuǎn)基因研究或以精子為原材料的雌核發(fā)育、雄核發(fā)育等的研究。
權(quán)利要求
1.一種采集扇貝高濃度精液的方法，其特征在于它的方法包括1)、優(yōu)質(zhì)親貝的培育；2)、制備吸取精液的吸頭；3)、高濃度精液的采集；4)、檢測(cè)收集精子的活力。
1)、優(yōu)質(zhì)親貝的培育以殼高為標(biāo)準(zhǔn)，從養(yǎng)殖海區(qū)選擇生長(zhǎng)速度快，健康活潑的雄性扇貝進(jìn)行暫養(yǎng)；蝦夷扇貝殼高9～11cm，暫養(yǎng)密度每立方米水體20個(gè)，暫養(yǎng)水溫4～8℃；櫛孔扇貝殼高6～7cm，暫養(yǎng)密度每立方米水體80個(gè)，暫養(yǎng)水溫14～16℃；投喂硅藻、金藻及螺旋藻，每天倒池一次；
2)、制備吸取精液的吸頭材料為200μL黃顏色的吸頭，吸頭尖端用鋒利的刀片略微傾斜削去0.5-1cm，并修平整毛邊；
3)、高濃度精液的采集待親貝性腺充分成熟、個(gè)別出現(xiàn)排精現(xiàn)象時(shí)，挑選性腺飽滿的雄貝，陰干升溫刺激使其排放精子，觀察到排精后，立即從海水中取出，用制備的200μl吸頭，在腎孔端附近扎破腎管并吸取精液，放入冰上預(yù)冷的Eppendorf管中備用；
4)、檢測(cè)所收集精子的活力取5μl精液，用195μl海水稀釋40倍，將計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的載物臺(tái)上，蓋上蓋玻片；迅速取一滴稀釋的精液于血球計(jì)數(shù)板蓋玻片的邊緣使精液自動(dòng)均勻滲進(jìn)計(jì)數(shù)室；置于200倍或400倍顯微鏡下觀察精子活動(dòng)情況，借助計(jì)數(shù)板上的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格進(jìn)行目測(cè)計(jì)數(shù)，觀察精子濃度及各活動(dòng)類型的精子數(shù)目，評(píng)價(jià)精子活力是根據(jù)精子活動(dòng)類型其前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的多少及其占全部精子數(shù)的百分比來(lái)確定，即所測(cè)精子的活力達(dá)到80-100％；
全文摘要
一種采集扇貝高濃度精液的方法，它的方法包括優(yōu)質(zhì)親貝的培育、制備吸取精液的吸頭、高濃度精液的采集、檢測(cè)收集精子的活力。該方法是采用截去尖端的200μL吸頭在性腺充分成熟的扇貝腎孔端附近扎破腎管并吸取精液，所獲得的精液僅含有少量組織殘跡和生理組分，精液濃度高，為0.2-1.6×109個(gè)/mL；成熟度高，達(dá)100％，其接觸海水的量非常少，因而沒有完全被激活。8-9cm的雄性蝦夷扇貝，可收集到約1.5mL精液/只；6-7cm的雄性櫛孔扇貝，可收集到約0.6mL精液/只。通過(guò)精子冷凍保存和授精試驗(yàn)驗(yàn)證，采用這種精液收集方式所收集的扇貝精液可應(yīng)用于生產(chǎn)和研究當(dāng)中。
文檔編號(hào)A61D19/00GK101133977SQ200710113130
公開日2008年3月5日 申請(qǐng)日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者楊愛國(guó), 周麗青, 劉志鴻, 楊培民 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所