專利名稱：：耐熱型植酸酶基因及其應(yīng)用的制作方法耐熱型植酸瞜基因及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)壤本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的，本發(fā)明涉及一種耐熱型植酸酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：磷是動物機體必需的礦物元素，雖然存在于動物性飼料中的磷大部分能被動物體吸收利用，但由于其價格昂貴，限制了在飼料中的使用。存在于植物性詞料中的磷大部分以植酸(即肌醇六磷酸)或植酸鹽的形式存在，而單胃動物體內(nèi)缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸鹽水解的酶)，造成飼料中磷的利用率僅有1/3或更低，為了補充有效磷的不足，必須在詞料中添加無機磷酸鹽，這樣勢必造成磷源的浪費，導(dǎo)致磷的過量排泄。單胃動物飼料中通過添加植酸酶，可以提高飼料中植酸磷的利用率，減少磷的排出對環(huán)境的污染。植酸酶屬于磷酸單脂水解酶，是一種能降解植物性飼料中植酸及其鹽類的磷酸酯酶。植酸酶能將植酸分解為肌醇和磷酸，大部分植酸酶(85%)在胃部發(fā)揮作用，小部分在小腸前端起作用，小腸后端無植酸酶活動。植酸酶只作用于植酸，只有當飼料中存在足量的植酸時，添加植酸酶才有實際價值。隨著生物技術(shù)特別是采用DNA重組技術(shù)后，使植酸酶在生產(chǎn)中的大量應(yīng)用成為可能。植物性植酸酶的最適pH值在4.8-6.0之間，在pH值小于3.0時，活性顯著下降，甚至失活。微生物植酸酶所耐受的pH值范圍比大多數(shù)植物性植酸酶要寬，一般pH值在2.5-6.0之間。絕大多數(shù)植酸酶發(fā)揮酶活性的最適溫度為45-55。C。然而，目前植酸酶的溫度耐受極限還遠不能滿足大多數(shù)生產(chǎn)顆粒飼料的要求。并且，某些植酸酶的酶活性也不夠理想。因此，本領(lǐng)域需要進一步尋找新的耐高溫且活性高的植酸酶，以提高動物對磷的吸收，有效地節(jié)省成本。發(fā)明內(nèi)審本發(fā)明的目的在于提供新型耐熱型植酸酶，該植酸酶具有耐高溫的特性，并且具有高的酶活性。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的蛋白，該蛋白選自下組-(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽同種功能(即具有分解植酸或植酸鹽的功能)的由(a)衍生的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組(i)編碼所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，該多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第五方面，提供所述的蛋白的用途，用于分解植酸或植酸鹽。在本發(fā)明的第六方面，提供一種制備所述的蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)所述的宿主細胞，收集獲得所述的蛋白。在本發(fā)明的第七方面，提供一種組合物，所述組合物中含有有效量的所述的蛋白，以及食品學(xué)或飼料學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物中含有Mg2+、Mn2+、或EDTA。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物中不含有Zn2+、A13+、Cu2+、或Fe3+。在本發(fā)明的第八方面，提供一種制備含有所述的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括步驟將所述的多核苷酸導(dǎo)入植物細胞中，培養(yǎng)所述的植物細胞，再生成植物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟(sl)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有所述的多核苷酸；(s2)將植物細胞或組織或器官與步驟(sl)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(S3)選擇出轉(zhuǎn)入所述的多核苷酸的植物細胞或組織或器官；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)一種新的耐熱型植酸酶，本發(fā)明人將之命名為PhyA-M。試驗證實，該植酸酶具有很高的酶活性依常溫(37°C)下酶活達到1.3X103U/mg)，且即使在80°C的高溫下酶活存留率也在75%以上。可見該植酸酶是一種耐熱型的植酸酶，具有廣泛的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的PhyA-M蛋白或多肽"是指所述的PhyA-M蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化PhyA-M蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括PhyA-M蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然PhyA-M蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語"PhyA-M蛋白"指具有PhyA-M蛋白活性的SEQIDNO:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與PhyA-M蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地1-10個，還更佳如l-8個、l-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括PhyA-M蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與PhyA-M蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗PhyA-M蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含PhyA-M蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了PhyA-M蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有PhyA-M蛋白序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供PhyA-M蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然PhyA-M蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氮酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，"PhyA-M蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。例如，這些保守性變異多肽可根據(jù)表l進行氨基酸替換而產(chǎn)生。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明PhyA-M蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:l所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:l所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指:(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，6(TC;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.P/。小牛血清/0.1。/。Fico11，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95。/。以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼PhyA-M蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明的PhyA-M蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或PhyA-M蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984;224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列來表達或生產(chǎn)重組的PhyA-M蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼PhyA-M蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，PhyA-M蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語"重組表達載體"指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含PhyA-M蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP),或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細鷹可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發(fā)明的多核苷酸在一些宿主中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCb法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。作為本發(fā)明的一種實施方式，可利用本發(fā)明的PhyA-M蛋白的編碼基因來制備轉(zhuǎn)基因植物，獲得的轉(zhuǎn)基因植物表達PhyA-M蛋白。將所述的轉(zhuǎn)基因植物作為動物的飼料成分，可以使飼料中具有穩(wěn)定來源的，因而不需要額外添加植酸酶。此外，也可在動物體內(nèi)導(dǎo)入PhyA-M蛋白的編碼基因，從而動物自身可表達PhyA-M蛋白，使PhyA-M蛋白成為一種內(nèi)源酶。這就省去了很多外源的添加工作。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的PhyA-M蛋白以及食品學(xué)上或飼料學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乙酸、麥麩、玉米芯或它們的組合。組合物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的組合物可以被制成顆粒劑的形式，例如用玉米芯或麥麩以及其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。在喂食動物時，通常將含有安全有效量的PhyA-M蛋白的組合物給予動物，在制備顆粒飼料時，通常調(diào)節(jié)飼料中PhyA-M蛋白的酶活在0.005-50U/g;優(yōu)選的為0.05-5U/g;更優(yōu)選的為0.1-lU/g。當然，具體給予劑量還應(yīng)考慮飼料的其它營養(yǎng)成分配方、動物的自體狀況等因素，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。作為本發(fā)明的一個實例，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。所述的多核苷酸是從高產(chǎn)耐熱植酸酶的菌種中分離出的，并且根據(jù)酵母的密碼子偏愛性進行了密碼子優(yōu)化。其序列如SEQIDNO:l所示，它包含的多核苷酸序列全長為1329個堿基，編碼全長為442個氨基酸的PhyA-M蛋白(SEQIDNO:2)。該蛋白可添加到動物飼料或其它需要補充植酸酶以分解植酸或植酸鹽的物質(zhì)中，用于分解植酸或植酸鹽。本發(fā)明豳主要優(yōu)點在于首次分離得到一種新的耐熱型植酸酶，該植酸酶具有很高的酶活性，在發(fā)酵罐水平上，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)120h后表達量達到2.5mg/mL，植酸酶活性(發(fā)酵效價)達3.0xl(^U/mL以上。并且，即使在80'C的高溫下酶活存留率也在759i以上，具有廣泛的應(yīng)用前景。下面結(jié)含具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照以下文獻中公布的方法CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Devkslereds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:耐熱型植黢,基因的克隆1.樣品的采集從溫泉等溫熱地域采集土壤或枯死植物的標本，這些地方由于具有大量植物性的植酸，因此可通過篩選獲得對植酸具有很強代謝能力的菌群，而且環(huán)境溫度很高，從而比較容易分離出具有耐熱性的植酸酶的基因。2.髙產(chǎn)射熱植酸酶菌種的分離通過對分離的樣品進行富集培養(yǎng)，將這些菌懸液涂布于含有植酸鈣的選擇培養(yǎng)基中生長，待具有水解圈時，逐個分離所有菌落單獨培養(yǎng)，然后再通過水解圈的大小篩選出具有高產(chǎn)性能的菌種。通過微生物分類的方法，鑒定每個菌落的分類學(xué)地位，然后再通過不同液體培養(yǎng)基對每株菌在最適宜的條件下進行植酸酶的誘導(dǎo)發(fā)酵，篩選出可高產(chǎn)植酸酶的菌種。3.植m基因同源引物的設(shè)計在確定所篩選的菌種所屬的種類，通過生物信息學(xué)序列數(shù)據(jù)庫提供的與該物種同源物種的植酸酶基因序列，采用多序列比對的方式，尋找這些基因相似的區(qū)域，然后將這些氨基酸序列反翻譯成簡并的核苷酸序列，根據(jù)這些序列設(shè)計具有同源性的同源引物。所述同源引物的序列為正向(phy5-l):ctncgngagagwagntcwtc(SEQIDNO:3);反向(phy3—1):astcnacctahatsgtwgcg(SEQIDNO:4)。其中，ma,t,g,或c;w:a,或t;g，或C;h-c，t，或a。4.菌體RNA的提取以及RT-PCR使用Trizol方法提取菌體的RNA。將粉末狀細胞裝入處理過的1.5mLEP管中，加入lmLTRIZOL用槍反復(fù)吹打，混勻，蓋上EP管蓋。室溫下靜置5分鐘，以利于TRIZOL進一步處理細胞。加入0.2mL氯仿到EP管中，蓋上管蓋，用手拿住EP管反復(fù)搖動15秒后，于室溫下靜置2-3分鐘后，12,OOOrpm離心15分鐘。取出，吸上清到一新1.5mLEP管中，注意不要吸入蛋白質(zhì)。加入0.5mL異丙醇。將EP管輕輕顛倒2，3次后。于-2(TC沉淀1小時以上。12，OOOrpm離心IO分鐘。去上清，加入lmL75免乙醇，將EP管輕輕顛倒2，3次后于8，000rpm離心5分鐘。倒掉乙醇，將1.5mLEP管倒扣于濾紙上5-10分鐘晾干。最后用20-50uL無RNase酶的水溶解后，放入液氮或-2(TC保存。將總RNA于70'C水浴變性2分鐘，立即置于冰上5分鐘，然后使用Promega公司的如下反轉(zhuǎn)錄體系進行反轉(zhuǎn)錄GoldBuffer7.4wL;dNTP10鵬mol/L0.15uL;01igo(dT)151.2uL;rRNasinRibonucleaseInhibitor0.75uUAMVRT(2025U/uL)0.5uL。加入20ixL總RNA，于37。C反轉(zhuǎn)錄40分鐘，完成后放置在95。C水浴中5分鐘終止反應(yīng)。取2.5uL前述反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物作為模板，按照如下體系進行第一輪的梯度PCR擴增去離子水32nL;10XPCR緩沖液5uL;MgCl24uL;dNTPMix(10mmol/L)4uL;phy5-lPrimer(20nmol/L)1nL;phy3-1Primer(20umol/U1nL;TaqDNA聚合酶(5U/uL)0.5uL。取1UL第一輪梯度PCR擴增產(chǎn)物作為模板，使用內(nèi)側(cè)巢式引物按照如下體系進行第二輪梯度PCR擴增，其中phy5-2引物序列為5'cgaacagagccgctccggcg3'(SEQIDNO:6)去離子水33.5nL;IOXPCR緩沖液5pL;MgCl2"L;dNTPMix(10mmol/U4uL;phy5-2Primer(20umol/U1uL;phy3-1Primer(20umol/U1nL;TaqDNA聚合酶(5U/uL)0.5nL。采用巢式PCR和梯度PCR的方法，對反轉(zhuǎn)錄cDNA進行多輪擴增，將特異性的擴增片斷，通過膠回收和TA克隆的方法，克隆到載體中測序，獲得攜帶植酸酶的EST序列的TA載體。5.RACE的方法克隆植酸酶基因GSP引物設(shè)計要求引物長度在2328bp之間，GC含量5070先，Tm》65°C，同時對于EST序列最好盡量靠近5'端，有利于擴增5'未知序列。使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計3，端引物，獲得的3'端引物序列為5，aacttcgtgcacacaccgtggtccagcg3，(SEQIDNO:5);另外5，端采用SMARTRACEcDNAAmplificationKit自帶的通用引物。按SMARTRACEcDNAAmplificationKit操作說明書完成全部克隆過程，獲得基因的5'末端和3，末端。通過生物信息學(xué)的手段將這條基因拼接成完整基因，再通過RT-PCR擴增出全長基因，TA克隆并測序，分析基因的核酸序列和蛋白質(zhì)序列，找到與之同源的基因。實驗結(jié)果表明，在所獲得的2個克隆子中均為同一條基因(確定是SEQIDNO:1)，且該基因與曲霉的植酸酶基因具有較高相似性(同源性96%)。實施例2:財熱植黢酶基因的改造及人工合成根據(jù)編碼植酸酶成熟蛋白的基因序列，按照畢赤酵母密碼子的偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下進行序列改造，同時在序列中避免富含AT序列(ATTTA、AATAA、AATTAA等)的出現(xiàn)。并按所用克隆載體的多克隆位點設(shè)計、添加合適的限制性內(nèi)切酶位點，將全基因分為11個部分，再將每個部分分為長度不超過60個核苷酸的單鏈核苷酸片段進行人工合成，人工合成的方法是本領(lǐng)域人員熟知的?；蛉サ鬘-端66bp的信號肽編碼序列后，全長1329bp。按畢赤酵母密碼子偏向，在不改變氨基酸序列的前提下進行改造，共改變了36個堿基涉及20個密碼子，基本符合畢赤酵母G+C的含量特征。核黢序列(SEQIDNO:1):tctgctggctccaagtcctgcgertacggtagacctcgggtaccagtgctcccctgcgact60tctcatctat鼉gggcctgtactcgccattcttttcgctcgaggacgagctgtccgtgtcg120agtaagcttcccaaggattgcagaatcaccttggttcaggtgctatctagacatggagct180agatacccaaccagctccgcgagcaaaaagtata柳agcttgtgacggcgatccaggcc240aatgccaccgacttcaagggcaagtttgcctttttgaagacgtscaactatactctgggt300gcggatgacctcactccctttggggagcagcagctggtga3CtCgggC3tcaagttctac360cagaggtacaaggctctggctagaagtgtggtgccatttattagagcctcaggctcggac420agagttattgcttcggg柳gaagttcatcgaggggttccagcaggcgaagctggctgat棚cctggcgcgacgaacagagccgctccggcgattagtgtgattattccggagagcgagacg540ttcaac幼taGgctggaccacggtgtgtgceicgaagtttgaggcgagtcagctgggagat600gaggttgcggccaatttcactgcgctctttgcacccgacatcagagctagagccg卿ag660catcttcctggcgtgacgctgacagacgaggacgttgtcagtctaatggacatgtgttcg720Utgatacggtagctagaeiccagcgacgcaagtcagctgtcaccgttctgtcaactcttc780actcacaatgagtgg幼g朋gt3C83Ct3Ccttcagtcctctacggccac840ggcgcaggcaaccctctgggaccggctcaggggatagggttcaccaacgagctgattgcc900agattgactagatctccagtgcaggaccacaccagcactaactcgactctagtctccaac960ccggccaccttcccgttgaacgctaccatgtacgttgacttttcacacga1020gtttccatcttctttgcattgggcctgtacaacggcactgaacccttgtccagaacctcg1080gtggaaagcgcc幼ggaattggatgggtattctgcatcctgggtggtgcctttcggcgct1140agagcctacttcgagacgatgcaatgcaagtcggaaaaggagcctcttgttagagctttg1200attaatgacagagttgtgccactgcatggctgcgatgtggacaagctgggtagatgcaag1260ctgaatgactttgtc卿gg3ttg3gttgggccagatctgggggc幼ctgggg柳gtgc1320tttagttga1329蛋白序列(SEQIDNO:2)-SAGSKSCDTVDLGYQCSPATSHLWGLYSPFFSLEDELSVSSKLPKDCRITLVQVLSRHGA60RYPTSSASKKYKKLVTAIQANATDFKGKFAFLKTYNYTLGADDLTPFGEQQLV隨KFY120QRYKALARSVVPFIRASGSDRVIASGEKFIEGFQQAKLADPGATNRAAPAISVIIPESET180FNNTLDHGVCTKFEASQLGDEV細FTALFAPD蘭AEKHLPGVTLTDEDVVSLMDMCS240FDTVARTSDASQLSPFCQLFTHNEWKKYNYLQSLKKYYGHGAGNPLGPAQGIGFTNELIA300RLTRSPVQDHTSTNSTLVSNPATFPLNATMYVDFSHDNSMVSIFFALGLYNGTEPLSRTS360VESAKELDGYSASWVVPFGARAYFE露KSEKEPLV亂難VVPLHGCDVDKLGRCK420LNDFVKGLSWARSGGNWGECFS442在基因(SEQIDNO:1)的5'端添加EcoRI位點，3'端添加NotI和HindIII位點，以便于基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pUC19及表達載體pPIC9上。按照基因合成的常規(guī)方法，將'合成基因各部分分別克隆于載體pUC19(華美生物工程公司)上，再進一步拼接得到完整的改造全基因phyA-m，重組質(zhì)粒命名為pUC19-phyA-ro。phyA-m基因經(jīng)序列測定后證實該基因與設(shè)計的序列一致。實施例3酣熱植酸醣基因在酵母中的髙效誘導(dǎo)表達及其分析1.合成片段的拼接及重組表達載體的構(gòu)建利用EcoRI/NotI酶切位點，將phyA-m從pUC19-phyA-m上切下，然后通過EcoRI/NotI位點克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9(Invitrogen)上，得到重組載體pPIC9-phyA-m。DNA的重組操作主要依據(jù)Sambrook等人，分子克隆實驗室指南進行。2.酵母的電擊轉(zhuǎn)化及篩選將重組載體pPIC9-phyA-m用BglII酶切使之線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(Invitrogen)。挑取陽性轉(zhuǎn)化子。電轉(zhuǎn)化及篩選方法參見Invitrogen公司操作手冊。3.重組,母的誘導(dǎo)表達重組酵母在5mLBMGY培養(yǎng)基中于3(TC搖床培養(yǎng)48h，離心收集菌體，加入lmLBMMY甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮菌體，繼續(xù)在3(TC下誘導(dǎo)培養(yǎng)48h,取樣檢測各菌株上清液中的植,活性，從中篩選出表達植酸酶的轉(zhuǎn)化子。酶活性單位定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1/xmol無機磷所需的酶量為一個酶活性單位(U)。酶活性測定方法參見實施例5，酶測定體系pH值為5.0。4.發(fā)酵纖水平植酸瞎的表達重組酵母在5L發(fā)酵罐(BIOSTATB5型)中進行發(fā)酵。重組酵母的發(fā)酵為高細胞密度補料發(fā)酵，發(fā)酵過程分為菌株培養(yǎng)階段、碳源飼喂階段和誘導(dǎo)表達階段，具體方法見Irwitrogen操作手冊。在誘導(dǎo)過程中每12h取樣一次測定表達的植酸酶的積累量并進行表達蛋白的SDS-PAGE。實驗結(jié)果表明選擇搖床水平表達量高的畢赤酵母重組菌株P(guān).pastorispPIC9-phyA-m26進行5L發(fā)酵罐發(fā)酵研究。在誘導(dǎo)之前的菌體生長階段發(fā)酵上清中檢測不到植酸酶活性。隨著甲醇的誘導(dǎo)，上清液中植酸酶酶活力顯著增加，酶蛋白不斷積累。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)120h后表達量達到2.5rag/mL，植酸酶活性(發(fā)酵效價)達3.0X103U/mL以上。畢赤酵母表達的植酸酶純化方法如下首先進行脫鹽處理，再經(jīng)分子篩S叩erdex—75一HR—10/30純化。分步收集洗脫峰，每管lmL，作為植酸酶酶學(xué)性質(zhì)研究的樣品。實施例4耐熱性植酸酶的,學(xué)性質(zhì)檢測經(jīng)純化的植酸酶在不同pH及不同溫度條件下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH和最適溫度。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37。C下處理lh及在不同溫度(60。C、70r、8(TC)下分別處理30min，在37。C、pH5.0的條件下分別測定酶活性以測定酶的pH穩(wěn)定性和酶的熱穩(wěn)定性。酶的比活單位的定義為每mg酶蛋白所表現(xiàn)出的酶活性單位(U)。通過考馬斯亮藍法測定樣品酶液中的蛋白含量，同時測得其植酸酶酶活性，由此得到酶的比活性，結(jié)果表明比活力為1.3X103U/mg。通過不同溫度對植酸酶的耐熱性做出研究，分別將酶液放置于55'C，60°C，65°C,70°C，75°C，80°C,85°C，90°C，95。C的水浴中溫育10min。取出后在室溫放置冷卻，測定每個溫度下處理的酶液酶活，以正常保存條件下的酵液酶活為對照，計算相對酶活及其耐熱性。在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度為lmM不同的金屬離子及化學(xué)試劑，在37t:、pH5.0條件下測定酶活性，研究其對酶活性的影響。實驗結(jié)果表明最適pH為5.5，當pH大于6時，酶活迅速降低；在pH2IO之間酶活具有雙峰。在pH5.0，同溫度下酶活性的測定結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為55。C。80°C、10min的水浴處理，酶活存留率基本在75%以上。在酶促反應(yīng)體系中加入不同的化學(xué)試劑，然后分別測定酶活性，結(jié)果表明，Mg2+、Mn2+和EDTA對phyA有激活作用；金屬離子Zn2+、A13+、Cu2+和Fe3+對phyA的酶促反應(yīng)均有不同程度的抑制作用。并且，經(jīng)過測定，與曲霉的植酸酶相比較，本發(fā)明的耐熱植酸酶的酶活提髙了70%，且曲霉的植酸酶的植酸酶在8CTC、10min的水浴處理后，酶活存留率僅為60%。實施例5，植酸K,活淵定1.方法累理植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的(NH4)3P04N仏V03，16MO03復(fù)合物，在波長415nm下進行比色測定。2.試劑,港液本方法中所用試劑，在沒有注明其它要求時，均指分析純試劑和符合GB/T6682中規(guī)定的三級水。并且，清洗試驗用容器不要用含磷清洗劑。2.10.25raol/L乙酸緩沖液(l):稱取34.02g三水乙酸鈉于1000ml容量瓶中，加入900ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0土0.01，并用蒸餾水定容至1000ml,室溫下存放2個月有效。2.20.25mol/L乙酸緩沖液(2):稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5gTritonX-100,0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml容暈瓶中，加入900ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0±0.01，并用蒸餾水定容至10OOml，室溫下存放2個月有效。2.37.5mmol/L植酸鈉(底物)溶液稱取0.6929g肌醇六磷酸鈉(C6H6024P6Na12)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸緩沖液(l)溶解并定容至刻度，調(diào)pH值到5.0，現(xiàn)用現(xiàn)配(實際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0mmol/L)。2.4硝酸溶液l:2水溶液。2.510g/L鉬酸銨溶液稱取10g鉬酸銨[(NH4)eMoA4犯20]于100ml容量瓶中，加入1.Oml氨水(25%)用水溶解定容至刻度。2.62.35g/L釩酸銨溶液稱取0.235g釩酸銨(NH4V03)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液，用水溶解定容至刻度。避光條件下保存l周有效。2.7顏色終止液移取2份硝酸溶液，l份鉬酸銨溶液，l份釩酸銨溶液混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.8磷酸二氫鉀(KH2P04):基準物。3儀器和設(shè)備3.1實驗室常用儀器設(shè)備。3.2恒溫水浴37±0.rC。3.3分光光度計；有10mm比色皿，可在415nm下測定吸光度。3.4磁力攪拌器。3.5渦流式混合器。3.6酸度計精確至小數(shù)點后2位。3.7離心機轉(zhuǎn)速為4000r/min以上。4.試樣翻備取植酸,樣品，用常規(guī)的四分法將試樣縮分至200g，植酸酶產(chǎn)品不需粉碎，配合飼料和添加劑預(yù)混合詞料需粉碎通過0.45mm標準篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。5.濂定歩驟5.1絕對法5.1.1標準曲線準確稱取0.6804g在105'C烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸緩沖液溶解，并定容至100ml,濃度為50.Ommol/L。按下面表2的比例稀釋成不同濃度，與試樣一起反應(yīng)測定，以吸光值為橫坐標，反應(yīng)體系中無機磷的量(umol)為縱坐標，列出直線回歸方程(y-ax+b)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>5.1.2試樣溶液的制備:稱取試樣兩份，每份1.0000g，精確至0.0001g，置于100ral容量瓶中，加入約70ml乙酸緩沖液(2)，一個磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌30min，用乙酸緩沖液(2)定容至刻度(減去磁力棒的體積)。搖勻，在離心機上以4000r/min離心10min。分取不同體積的上清液用乙酸緩沖液(2)稀釋，使樣液濃度保持在0.4U/ml左右，待反應(yīng)。前述植醸酶純化后經(jīng)使用乙酸緩沖液(1)按照以上步驟稀釋。5.1.3反應(yīng)取10ml試管按下面的反應(yīng)順序進行操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，37'C水解30min。反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機以上4000rpm離心10min，上清液以標準曲線的空白調(diào)零，在分光光度計415mn波長處測定樣品空白(A。》和樣品溶液(A)的吸光值，A-A。為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。6結(jié)果計算和表示6.1計算公式試樣中植酸酶的活性，用每克(或raL)試樣中的活性單位"U"表示，計算公式如下。植酸酶活性(|]/8)=-XFMX30X0.2..........................式中c——根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的y值;F—一試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；0.2——0.2ml酶稀釋液(步驟5.1.2);M-樣品質(zhì)量；30——反應(yīng)時間(分鐘)。實施例6:蛋白變體采用常規(guī)的方法，在本發(fā)明的PhyA-M蛋白的N端加上6個組氨酸標簽(His-6)，在使用常規(guī)方法表達出N端攜帶組氨酸標簽的PhyA-M蛋白后，使用Ni-NTA親和層析將被組氨酸標簽的靶肽進一步純化。洗脫并收集純化產(chǎn)物，按實施例4和5所述的方法，測定所獲得的PhyA-M蛋白的酶學(xué)活性和耐熱性，結(jié)果表明所述的攜帶組氨酸標簽的PhyA-M蛋白與不帶組氨酸標簽的PhyA-M蛋白活性相近，且也具有良好的耐熱性。實施例7:含有耐熱型植酸酶的組合物配制植醣酶組合物(5000型天然耐熱型顆粒)如表4:表4成分含量玉米淀粉90wt%微晶纖維素鈉2wt%水份余量(<8wt%)將上述各成分充分混合，根據(jù)常規(guī)的方法制成顆粒飼料產(chǎn)品。按以下表5的配方，用常規(guī)方法制備肉雞用飼料(含量Wt%)，采用的植酸酶組合物為上述制備的5000型天然耐熱型顆粒表5飼料原料正對照組負對照組配方l玉米65.465.465.4豆粕24.124.124.1次粉333玉米蛋白粉444鈣粉11.381.38磷酸氫鈣1.60.990.99沸石粉00.230.219賴氨酸0.1920.1920.192蛋氨酸0.150.150.15食鹽0.250.250.25預(yù)混料0.3850.3850.385植酸酶組合物000.Oil總計100100100將上述對照組和實驗1組各原料充分混合，按照常規(guī)方法制成飼料,實施例8t動物試驗將實施例7制備的配方1的飼料以及正對照組和負對照組的飼料分別喂食肉雞，觀察肉雞的生長狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，動物在食用實施例7制備的飼料組合物后，可使肉雞的增重、采食量、料肉比達到正常(正對照組)的水平(P〉0.05),而負對照組的肉雞表現(xiàn)出缺磷癥狀。說明配方1的飼料中包含的植酸酶經(jīng)過飼料制粒(經(jīng)過約蒸汽瞬間高溫(最高溫時為IO(TC)處理)后，仍保留足夠的酶活，可以降解植酸磷釋放出足夠的無機磷，彌補磷酸氫鈣不足所引起的鈣磷失調(diào)，生產(chǎn)性能下降，滿足肉雞的生長對磷的需要。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<110〉四川禾本生物工程有限公司<120>耐熱型植酸酶基因及其應(yīng)用〈130〉070927<160>6<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉1329<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉植酸酶基因<400〉1tctgctggctcc肪gtcctgcgatacggtatctcatctatggggcctgtactcgccattcagtaagcttcccaaggattgcagaatcaccagatacccaaccagctccgcgagcaaaaagaatgccaccgacttcaagggcaagtttgccgcggatgacctcactccctttggggagcagcagaggtacaaggctctggctagaagtgtgagagttattgcttcgggagag幼gUcatccctggcgcgacgaacagagccgctccggcgttcaacaatacgctggaccacggtgtgtgcgaggttgcggccaatttcactgcgctctttcatcttcctggcgtgacgctgacagacgagtttgatacggt縛ctagaaccagcgacgcaactcacaatgagtggaagaagtacaactacggcgcaggcaaccctctgggaccggctcagagattgactagatctccagtgcaggaccacccggccaccttcccgttgaacgctaccatggtttccatcttctttgcattgggcctgtacgtgga幼gcgccaaggaattggatgggtatagagcctacttcgagacgatgcaatgcaagattaatgacagagttgtgccactgcatggcctgaatgactttgtc幼gggattgagttggtttagttga<210〉2〈211〉442<212〉PRT序列表gacctcgggtaccagtgctcccctgcgact60ttttcgctcg柳acgagctgtccgtgtcg120ttggttcaggtgctatctagacatggagct180tataag卿cUgtgacggcgatccaggcc240tttttgaagacgtacaactatactctgggt300cagctggtgaactcgggcatcaagttctac360gtgccatttattagagcctcaggctcggac420gaggggttccagcaggcg犯gctggctgat480attagtgtgattattccggagagcg卿cg540acgaagtttgaggcgagtcagctgggagat600gcacccgacatcagagctagagccg卿ag660gacgttgtcagtctaatggacatgtgttcg720agtcagctgtcaccgttctgtcaactcttc780cttcagtccttg犯g犯gtactacggccac柳gggstagggttcaccaacgagctgattgcc900accagcactsactcgactctagtctccaac960tacgttgacttttcacacgacaacagcatg1020aacggcactgaacccttgtccagaacctcg1080tctgcatcctgggtggtgcctttcggcgct1140tcggaaaaggagcctcttgttagagctttg1200tgcgatgtggacaagctgggtagatgcaag1260gccagatctgggggcaactgggg柳gtgc13201329<213>人工序列<220><221>MISC—FEATURE<223〉植酸,蛋白<400>2SerAlaGly1SerProAlsLeuGluAsp35lieThrLeu50SerSerAla65AsnAlaThrTyrThrLeuVslAsnSer115SerValVal130SerGlyGlu145ProGlyAlaGluSerGluPheGluAla195LeuPheAla210ValThrUu225PheAspThrCysGinLeuSerLeuLys275AlaGinGly290SerProVal305ProAlaThrSerLys5ThrSer20GluLeuValGinSerLysAspPhe85GlyAla100GlylieProPheLysPheThrAsn165ThrPhe180SrGinProAspThrAspValAla245PheThr260LysTyrlieGlyGinAspPhePro325SerCysAspThrValAspLeuGlyTyrGinCys1015HisLeuTrpGlyLeuTyrSerProPhePheSer2530SerValSerSerLysLeuProLysAspCysArg4045ValLeuSerArgHisGlyAlaArgTyrProThr5560LysTyrLysLysLeuValThrAlalieGinAla707580LysGlyLysPheAlaPheLeuLysThrTyrAsn9095AspAspLeuThrProPheGlyGluGinGinLeu105110LysPheTyrGinArgTyrLysAlaLeuAlaArg120125lieArgAlaSerGlySerAspArgVallieAla135140lieGluGlyPheGinGinAlaLysLeuAlaAsp150155160ArgAlaAlaProAlalieSerVallieliePro170175AsnAsnThrLeuAspHisGlyValCysThrLys185190LeuGlyAspGluVslAI3AlaAsnPheThrAI3200205lieArgAlaArgAlaGluLysHisLeuProGly215220GluAspValValSerLeuMetAspMetCysSer230235240ArgThrSerAspAlaSerGinLeuSerProPhe250255HisAsnGluTrpLysLysTyrAsnTyrLeuGin265270TyrGlyHisGlyAlaGlyAsnProLeuGlyPro280285PheThrAsnGluLeulieAlaArgLeuThrArg295300HisThrSerThrAsnSerThrLeuValSerAsn310315320LeuAsnAlaThrMetTyrValAspPheSerHis330335AspAsnSerMetValSerliePhePheAlaLeuGlyLeuTyrAsnGly340345350ThrGluProLeuSerArgThrSerValGluSerAlaLysGluLeuAsp355360365GlyTyrSerAlaSerTrpValValProPheGlyAlaArgAlaTyrPhe370375380GluThrMetGinCysLysSerGluLysGluProLeuValArgAlaLeu385390395400lieAsnAspArgValValProLeuHisGlyCysAspValAspLysLeu405410415GlyArgCysLysLeuAsnAspPheValLysGlyLeuSerTrpAlaArg420425430SerGlyGlyAsnTrpGlyGluCysPheSer435440<210>3<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc一feature〈223〉引物<220〉<221〉misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,or<220〉<221>misc—feature<222〉(6)..(6)〈223〉nisa,c,g，or<220><221〉misc一feature<222>(15)..(15)<223>nisa,c,g,ort<400〉3ctncgngagagw躲ntcwtc20<210>4<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列<220><221>raisc_feature<223>引物<220><221〉misc—feature<222>(5)..(5)<223>nisa,c,g，ort<柳>4astcnacctahatsgtwgcg20<210〉5<211>28<212>腿〈213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>5aacttcgtgcacacaccgtggtccagcg28<210>6〈211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>raisc_feature<223>引物〈400〉6cgaacagagccgctccggcg20權(quán)利要求1.一種分離的蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQIDNO2氨基酸序列的多肽同種功能的由(a)衍生的多肽。2.—種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組-(i)編碼權(quán)利要求l所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷黢序列。5.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。6.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體；或它的基因組中整合有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。7.權(quán)利要求l所述的蛋白的用途，其特征在于，用于分解植酸或植酸鹽。8.—種制備權(quán)利要求1所述的蛋白的方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，收集獲得權(quán)利要求l所述的蛋白。9.一種組合物，其特征在于，所述組合物中含有有效量的權(quán)利要求l所述的蛋白，以及食品學(xué)或飼料學(xué)上可接受的載體。10.—種制備含有權(quán)利要求l所述的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟將權(quán)利要求2所述的多核苷酸導(dǎo)入植物細胞中，培養(yǎng)所述的植物細胞，再生成植物。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的PhyA-M蛋白及其應(yīng)用，所述的PhyA-M蛋白是一種耐熱型的植酸酶，可用于分解植酸或植酸鹽。本發(fā)明還公開了編碼PhyA-M蛋白的基因，含有所述基因的載體以及宿主細胞。所述的PhyA-M蛋白在飼料添加劑等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號A23K1/165GK101260391SQ20071003782公開日2008年9月10日申請日期2007年3月6日優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日發(fā)明者鋼李,滔楊,牛冬云,王小行,彥蔣申請人:四川禾本生物工程有限公司