專利名稱：一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因分子標(biāo)記方法，特別是涉及一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法，和脫氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作為檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因探針的寡聚核苷酸序列，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄是一種世界性水果，其面積和產(chǎn)量均居各類水果的第二位，葡萄黑痘病是一種嚴(yán)重危害葡萄的真菌病害，尤其是在葡萄生長季節(jié)雨水較多、濕度較大的地區(qū)，危害嚴(yán)重，常造成葡萄落花落果，葉片穿孔脫落，果粒上有鳥眼狀黑斑等，嚴(yán)重影響葡萄的生長與產(chǎn)量。傳統(tǒng)防治葡萄黑痘病的方法是對(duì)葡萄進(jìn)行多次噴藥防病，但化學(xué)防治會(huì)造成果實(shí)殘毒、污染環(huán)境，不利于人們的身體健康。利用葡萄資源自身的抗病性，通過雜交育種是培育抗黑痘病葡萄新品種的根本途徑，但通過雜交育種的方法，選育出抗黑痘病新品種的周期較長，一般鑒定雜種抗黑痘病性能需3-5年，這種人力、物力、時(shí)間耗費(fèi)多而效率低的育種方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。
隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)是一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低、多態(tài)性檢測(cè)豐富、不需同位素示蹤和安全可靠的特點(diǎn)。該技術(shù)1990年首先被應(yīng)用于菌屬、菌種和種內(nèi)差異的鑒別，隨后在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域及農(nóng)作物育種方面得到廣泛的應(yīng)用，并取得明顯成效，但一直沒有應(yīng)用于葡萄抗黑痘病育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決傳統(tǒng)雜交育種中，葡萄抗黑痘病育種周期長、效率低的難題，而公開一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)及操作步驟是a.以葡萄抗黑痘病育種的種間雜交組合白河-35-1×佳利釀的雙親及F1代、F2代為試材，提取、分離、純化脫氧核糖核酸(DNA)b.用脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行RAPD擴(kuò)增c.獲得與葡萄抗黑痘病基因連鎖的脫氧核糖核酸(DNA)的片段d.用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取純化該脫氧核糖核酸(DNA)片段e.以pGEM-T載體連接脫氧核糖核酸片段f.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切g(shù).將鑒定為陽性克隆的菌液測(cè)定該DNA片段的堿基構(gòu)成及其序列h.獲得1365堿基對(duì)的DNA片段的全部堿基組成及其序列i.進(jìn)一步依據(jù)1365堿基對(duì)的全部堿基組成及其序列j.人工合成4個(gè)寡聚核苷酸，其中之一(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)可用作引物，對(duì)脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增k.對(duì)原雜交組合雙親及其F1代、F2代，中國野生葡萄，歐洲葡萄，美洲野生葡萄，以及雜交組合廣西-1×京可晶的親本及其F1代分別進(jìn)行擴(kuò)增l.獲得特異性脫氧核糖核酸(DNA)片段m.用上述方法回收、克隆、測(cè)序該DNA片斷n.獲得了另一個(gè)檢測(cè)葡萄抗黑痘病性狀的脫氧核糖核酸(DNA)序列，其大小為1110堿基對(duì)o.確定獲得的寡聚核苷酸序列(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作為檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因的探針。
本發(fā)明葡萄抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354對(duì)抗黑痘病育種雜交組合廣西-1×京可晶F1代339株檢測(cè)與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為98.53％，對(duì)組合白河-35-1×佳利釀F2代207株檢測(cè)與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為96.17％；寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作為檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因的探針對(duì)雜交組合廣西-1×京可晶F1代339株檢測(cè)與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為83.57％，對(duì)組合白河-35-1×佳利釀F2代207株檢測(cè)與田間植株抗病表現(xiàn)的符合率為87％。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明用脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行RAPD擴(kuò)增的具體步驟為b.1采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)b.1.1混合液體積為25微升b.1.2含有10×PCR緩沖液2.5微升b.1.3氯化鎂1.5毫摩爾/升b.1.4 dNTP 200微摩爾/升b.1.5 Taq DNA聚合酶1個(gè)單位b.1.6隨機(jī)引物1微升b.1.7 45毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA)；b.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液b.2.1 PCR儀為Eppendorf-AG22331型b.2.2聚合酶鏈反應(yīng)94℃下解鏈5分鐘；b.3進(jìn)行45個(gè)循環(huán)b.3.1每一個(gè)循環(huán)包括94℃下解鏈1分鐘b.3.2 36℃下引物附著模板脫氧核糖核酸2分鐘b.3.3 72℃下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的伸長2分鐘b.3.4最后一個(gè)循環(huán)是72℃下延伸10分鐘；b.4將擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳
b.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2％b.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升b.4.3電泳的電壓為110伏b.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時(shí)；b.5電泳結(jié)束后，在紫外燈下照相。
本發(fā)明用人工合成的寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作引物，對(duì)脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的具體步驟為j.1采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)j.1.1混合液體積為25微升j.1.2含有10×PCR緩沖液2.5微升j.1.3氯化鎂1.5毫摩爾/升j.1.4 dNTP 200微摩爾/升j.1.5 Taq DNA聚合酶1個(gè)單位j.1.6寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)1微升j.1.7 45毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA)；j.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液j.2.1 PCR儀為Eppendorf-AG22331型j.2.2聚合酶鏈反應(yīng)94℃下解鏈5分鐘；j.3進(jìn)行40個(gè)循環(huán)j.3.1每一個(gè)循環(huán)包括94℃下解鏈30秒j.3.2 62℃下引物附著模板脫氧核糖核酸30秒j.3.3 72℃下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的伸長1分鐘j.3.4最后一個(gè)循環(huán)72℃下延伸5分鐘；j.4將擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳j.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2％j.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升
j.4.3電泳的電壓為110伏j.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時(shí)；j.5電泳結(jié)束后在紫外燈下照相。
采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸(RAPD)技術(shù)，獲得了與葡萄抗黑痘病基因連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)該分子標(biāo)記克隆、測(cè)序，獲得了葡萄抗黑痘病基因分子標(biāo)記的脫氧核糖核酸(DNA)的組成與序列，用該特定DNA序列可以檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因的存在與否，以加速育種進(jìn)程和提高抗黑痘病育種的準(zhǔn)確性；可以進(jìn)一步通過染色體步移法，對(duì)抗黑痘病基因作圖與定位，依據(jù)獲得的葡萄抗黑痘病基因分子標(biāo)記序列，人工合成的寡聚核苷酸序列(5’ACAATCACCCAACTCCTC 3’)也具有檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因存在與表達(dá)的功能。
本發(fā)明具有以下用途可用作脫氧核糖核酸(DNA)探針、核糖核酸(RNA)探針、基因定位作圖、基因轉(zhuǎn)移、葡萄抗黑痘病育種中早期篩選鑒定的DNA分子依據(jù)、作為抗黑痘病葡萄品種和株系的脫氧核酸核酸(DNA)指紋以及注冊(cè)植物專利的理論依據(jù)。
本發(fā)明的葡萄抗黑痘病基因分子標(biāo)記為葡萄雜交育種提供了幼苗期鑒定的DNA依據(jù)，將會(huì)加速抗黑痘病育種的進(jìn)程和提高育種效率，為快速選育抗黑痘病葡萄新品種，進(jìn)一步克隆抗黑痘病基因和基因轉(zhuǎn)移提供方法和物質(zhì)基礎(chǔ)，也為葡萄抗黑痘病的遺傳規(guī)律研究和分子標(biāo)記連鎖遺傳作圖提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因的脫氧核糖核酸(DNA)的序列和人工合成的寡聚核苷酸序列，從根本上解決和加速了葡萄抗黑痘病育種進(jìn)程。
權(quán)利要求
1.一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法，其特征是采用以下技術(shù)操作步驟進(jìn)行1.a以葡萄抗黑痘病育種的種間雜交組合白河-35-1×佳利釀的雙親及F1代、F2代為試材，提取、分離、純化脫氧核糖核酸(DNA)1.b用脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行RAPD擴(kuò)增1.c獲得與葡萄抗黑痘病基因連鎖的脫氧核糖核酸(DNA)的片段1.d用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取純化該脫氧核糖核酸(DNA)片段1.e以pGEM-T載體連接脫氧核糖核酸片段1.f轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切1.g將鑒定為陽性克隆的菌液測(cè)定該DNA片段的堿基構(gòu)成及其序列1.h獲得1365堿基對(duì)的DNA片段的全部堿基組成及其序列1.i進(jìn)一步依據(jù)1365堿基對(duì)的全部堿基組成及其序列1.j人工合成4個(gè)寡聚核苷酸，其中之一(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)可用作引物，對(duì)脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增1.k對(duì)原雜交組合雙親及其F1代、F2代，中國野生葡萄，歐洲葡萄，美洲野生葡萄，以及雜交組合廣西-1×京可晶的親本及其F1代分別進(jìn)行擴(kuò)增1.l獲得特異性脫氧核糖核酸(DNA)片段1.m用上述方法回收、克隆、測(cè)序該DNA片斷1.n獲得了另一個(gè)檢測(cè)葡萄抗黑痘病性狀的脫氧核糖核酸(DNA)序列，其大小為1110堿基對(duì)1.o確定獲得的寡聚核苷酸序列(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作為檢測(cè)葡萄抗黑痘病基因的探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法，其特征是用脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行RAPD擴(kuò)增的具體步驟為2.b.1采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)2.b.1.1混合液體積為25微升2.b.1.2含有10×PCR緩沖液2.5微升2.b.1.3氯化鎂1.5毫摩爾/升2.b.1.4dNTP 200微摩爾/升2.b.1.5Taq DNA聚合酶1個(gè)單位2.b.1.6隨機(jī)引物1微升2.b.1.745毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA)；2.b.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液2.b.2.1PCR儀為Eppendorf-AG22331型2.b.2.2聚合酶鏈反應(yīng)94℃下解鏈5分鐘；2.b.3進(jìn)行45個(gè)循環(huán)2.b.3.1每一個(gè)循環(huán)包括94℃下解鏈1分鐘2.b.3.236℃下引物附著模板脫氧核糖核酸2分鐘2.b.3.372℃下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的伸長2分鐘2.b.3.4最后一個(gè)循環(huán)是72℃下延伸10分鐘后；2.b.4將擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳2.b.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2％2.b.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升2.b.4.3電泳的電壓為110伏2.b.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時(shí)；2.b.5電泳結(jié)束后，在紫外燈下照相。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法，其特征是用人工合成的寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)作引物，對(duì)脫氧核糖核酸(DNA)作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的具體步驟為3.j.1采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)3.j.1.1混合液體積為25微升3.j.1.2含有10×PCR緩沖液2.5微升3.j.1.3氯化鎂1.5毫摩爾/升3.j.1.4dNTP 200微摩爾/升3.j.1.5Taq DNA聚合酶1個(gè)單位3.j.1.6寡聚核苷酸(5′ACAATCACCCAACTCCTC 3′)1微升3.j.1.745毫微克的模板脫氧核糖核酸(DNA)；3.j.2用25微升的礦物油覆蓋反應(yīng)液3.j.2.1PCR儀為Eppendorf-AG22331型3.j.2.2聚合酶鏈反應(yīng)94℃下解鏈5分鐘；3.j.3進(jìn)行40個(gè)循環(huán)3.j.3.1每一個(gè)循環(huán)包括94℃下解鏈30秒3.j.3.262℃下引物附著模板脫氧核糖核酸30秒3.j.3.372℃下脫氧核糖核酸(DNA)聚合鏈的伸長1分鐘3.j.3.4最后一個(gè)循環(huán)72℃下延伸5分鐘；3.j.4將擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存或直接用瓊脂糖凝膠電泳3.j.4.1瓊脂糖凝膠濃度為1.2％3.j.4.2加入溴化乙錠0.5毫微克/毫升3.j.4.3電泳的電壓為110伏3.j.4.4用水平板電泳槽電泳1-1.5小時(shí)；3.j.5電泳結(jié)束后在紫外燈下照相。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于葡萄抗黑痘病育種的基因分子標(biāo)記方法，是以種間雜交組合白河－35－1×佳利釀的雙親及F
文檔編號(hào)A01H1/02GK101054595SQ20071001735
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日
發(fā)明者王躍進(jìn), 張劍俠 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)