一種合歡葉片中的內(nèi)生菌h6菌株分離方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種合歡葉片中的內(nèi)生菌H6菌株分離方法及其應(yīng)用，該分離方法包括：采用75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min，無(wú)菌水沖洗2-3次，可達(dá)到合歡葉片表面最佳的消毒效果和內(nèi)生菌H6分離的最適條件。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明H6菌株、發(fā)酵液、無(wú)菌株發(fā)酵液及其從H6發(fā)酵液中分得的活性組分對(duì)供試的植物病原菌蘋果腐爛病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌等均具有較強(qiáng)的抑制作用。本發(fā)明采用液-液萃取法對(duì)內(nèi)生菌H6的代謝液提取，得10個(gè)組分，其中活性高的組分1、2和8樣品硅烷化衍生后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，鑒定出其中脂肪酸、芳香酸、環(huán)二肽、甾醇類等25種具抗菌活性的物質(zhì)。
【專利說(shuō)明】一種合歡葉片中的內(nèi)生菌H6菌株分離方法及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種新篩選的合歡內(nèi)生細(xì)菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏號(hào): CGMCC N0.:7990 ;保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間:2013年8月13日。該菌及發(fā)酵液中的活性成分對(duì)可引起植物病害的病原真菌具有顯著的抑菌活性，可制備成生物農(nóng)藥，用于田間病害的防治。技術(shù)背景[0002]合歡內(nèi)生菌H6 (保藏編號(hào)CGMGG N0.:7990)自山東省青島市城陽(yáng)區(qū)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)種植的合歡(Albizzia julibrissin Durazz.)葉片中篩選出的具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)過(guò)大量室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明它對(duì)蘋果腐爛病菌、葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌等植物病原菌具有較高的生物活性，可用于相應(yīng)田間病害的防治。[0003]長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)農(nóng)藥生產(chǎn)以仿制為主，知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的形勢(shì)迫使我國(guó)必須將創(chuàng)制新藥的研究放在重要位置。我國(guó)天然藥物資源豐富、經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)相對(duì)比較薄弱， 從天然產(chǎn)物中尋找創(chuàng)新藥物適合現(xiàn)階段國(guó)情。隨著分離分析技術(shù)的進(jìn)步，許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜及微量成分獲得純品并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)成為可能，極大地豐富了天然藥物的來(lái)源。近幾年，藥用植物新資源的尋找集中在其內(nèi)生菌方面。傳統(tǒng)藥用植物中都存在很多內(nèi)生菌，其在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因重組，獲得了宿主的某些基因，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或更新穎的代謝產(chǎn)物，有研究顯示，51%的從植物內(nèi)生真菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物本身及土壤微生物。已有報(bào)道其代謝產(chǎn)物具有抑菌、抗氧化及抗腫瘤等多種活性，這一特點(diǎn)使藥用植物內(nèi)生菌成為人們尋找天然藥物和生物活性物質(zhì)的新方向，同時(shí)在保護(hù)珍稀瀕危植物方面也具有重要價(jià)值。[0004]合歡(Albizzia julibrissin Durazz.)系豆科合歡屬植物,產(chǎn)于我國(guó)黃河流域及以南各地，朝鮮、日本、越南、印度等 地也有分布，資源非常豐富。合歡花的干燥花序，是常用中藥。現(xiàn)代研究表明，由于合歡本身含有機(jī)酸、留醇及其苷、黃酮類化合物、神經(jīng)酰胺及神經(jīng)鞘苷等多種活性物質(zhì)，具有抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗炎抗菌、免疫增強(qiáng)、鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁、抗氧化等多種藥理活性作用，越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。趙杰等研究表明合歡葉提取物對(duì)黃瓜霜霉病有很好的預(yù)防作用。楊秀娟等研究表明，合歡葉提取物在24h內(nèi)對(duì)南方根結(jié)線蟲的抑制率在50%以上，且其殺卵率達(dá)到81.41%。劉峰等初步研究了合歡葉提取物對(duì)油菜茵核病菌的抑制作用，金玉蘭與賈福麗研究表明，合歡莖葉正丁醇萃取物對(duì)油菜菌核、蘋果腐爛病、辣椒炭疽病等病菌均有一定的防治效果，說(shuō)明合歡莖葉提取物中確實(shí)存在抑菌物質(zhì)，而且具有一定的抑菌譜。對(duì)于合歡中內(nèi)生菌的研究，至今僅見國(guó)內(nèi)有零星報(bào)道，繆莉等自合歡樹皮中分離出7株內(nèi)生菌用于抗腫瘤活性的篩選。楊嘉等從不同地區(qū)的合歡組織中分離到268株內(nèi)生真菌菌株，進(jìn)行了總抗氧化活性的篩選。鄭志斌從采集到的合歡組織中分離、純化得到5株內(nèi)生真菌，通過(guò)產(chǎn)孢形態(tài)進(jìn)行菌種鑒定。鑒于合歡葉的提取物具有良好的殺菌、抗腫瘤、抗氧化活性，從其中分離出的內(nèi)生菌也具有多種生物活性，具有進(jìn)行深入研究的必要，本發(fā)明基于前期近三年的自合歡葉中進(jìn)行具抗菌活性的內(nèi)生菌分離篩選，經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，合歡內(nèi)生細(xì)菌H6菌體，發(fā)酵液、無(wú)菌代謝產(chǎn)物、發(fā)酵液中活性組分均具有較強(qiáng)的抑菌活性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明提供了一株新用途的合歡內(nèi)生細(xì)菌(解淀粉芽孢桿菌)H6菌株，它對(duì)多種植物病原真菌的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。合歡葉片表面消毒的最佳組合為，葉片用75% (體積分?jǐn)?shù))酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min左右即可達(dá)到合歡葉片表面的徹底消毒。所分得的菌株H6在LB固體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)溫度為30-32°C， 轉(zhuǎn)速180rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間為24_48h，培養(yǎng)24h的種子液，按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液PH為6.8-7.2。該菌株的菌落在LB培養(yǎng)基上類似圓形，有隆起，不透明，干燥，菌落邊緣為鋸齒狀，表面褶皺，正反面顏色一致呈淺黃色。經(jīng)革蘭氏染色觀察，為G+性，桿狀細(xì)菌，長(zhǎng)度為1.17-1.43um，形成芽孢，中生。經(jīng)17項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)合16SrRNA序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹歸屬，結(jié)果表明，其與已知Bacillus amyloliquefaciens序列同源性 ^ 99%，初步鑒定其為是解淀粉芽孢桿菌。[0006]本發(fā)明優(yōu)化了合歡葉片表面消毒和其內(nèi)生菌H6分離的方法，采用75%(體積分?jǐn)?shù)) 酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min，無(wú)菌水沖洗2_3次，即可達(dá)到合歡葉片表面最佳的消毒效果和內(nèi)生菌H6分離的最適條件。[0007]本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明H6菌株、發(fā)酵液、無(wú)菌株發(fā)酵液及其從H6發(fā)酵液中分得的活性組分對(duì)供試的植物病原菌蘋果腐爛病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌等均具有較強(qiáng)的抑制作用，目的在于從藥用植物合歡中尋找具有生防效果的內(nèi)生菌，并發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的新穎結(jié)構(gòu)物質(zhì)，為新生物農(nóng)藥的開發(fā)提供模板。[0008]本發(fā)明采用液-液萃取法對(duì)內(nèi)生菌H6的代謝液(30L)分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將具有抑菌活性的乙酸乙酯層進(jìn)行柱層析，得10個(gè)組分，其中活性高的組分 1、2和8樣品硅烷化衍生后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NIST2005的檢索，鑒定出其中脂肪酸、芳香酸、環(huán)二肽、留醇類等25種具抗菌活性的物質(zhì)。[0009]本發(fā)明具有以下特點(diǎn):[0010]1、H6菌株分離自于藥用植物，在與植物長(zhǎng)期共生的條件下，其基因發(fā)生變化，可以代謝出藥用植物本身具有的一些獨(dú)特的活性成份，為新農(nóng)藥的創(chuàng)制提供結(jié)構(gòu)新穎的模板。[0011]2、H6菌株為解淀粉芽孢桿菌，其適應(yīng)性強(qiáng)，易培養(yǎng)，抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)率高。其分離自植物，為內(nèi)生菌，對(duì)作物無(wú)致病性，而對(duì)靶標(biāo)病原菌具有良好的生防效果。滿足開發(fā)成生物農(nóng)藥的要求，具有安全、與環(huán)境相容性好的特性。[0012]3、內(nèi)生菌H6菌體本身、發(fā)酵液、無(wú)菌代謝產(chǎn)物及代謝物中活性組分均具有抑菌作用。經(jīng)過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)證明，本發(fā)明中申請(qǐng)保護(hù)的合歡內(nèi)生細(xì)菌H6對(duì)蘋果腐爛病、葡萄黑痘病、 西瓜枯萎病、小麥赤霉病等的具有潛在的防治作用，對(duì)作物安全、殺菌譜較廣?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】[0013]圖1H6系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 [0014]圖2、形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)[0015]圖3、革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)[0016]圖4乙酸乙酯層對(duì)蘋果輪紋病菌抑制作用[0017]圖5乙酸乙酯層對(duì)小麥全蝕病菌抑制作用[0018]圖6乙酸乙酯層對(duì)棉花枯萎病菌抑制作用[0019]圖7乙酸乙酯層對(duì)蘋果腐爛病菌抑制作用[0020]圖8組分F1、F2、F6對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制作用效果[0021]圖9組分F1、F2、F8對(duì)蘋果輪紋病菌的抑制作用效果[0022]圖10組分F2、F3、F8、F9對(duì)小麥全蝕病菌病菌的抑制作用效果[0023]圖11組分FI的總離子流圖[0024]圖12組分F2的總離子流圖[0025]圖13組分F8的總離子流圖[0026]圖14組分F1、F2、F8中24種化合物質(zhì)譜圖與組分F1、F2、F8中25種化合物質(zhì)譜圖【具體實(shí)施方式】[0027]實(shí)施例1.合歡內(nèi)生細(xì)菌(Bacillus amyloliquefaciens) H6分離純化方法[0028](I)合歡葉片表面最佳消毒方法與時(shí)間的篩選[0029]采用組織印記法對(duì)消毒時(shí)間進(jìn)行篩選。具體操作為:選取新鮮無(wú)病斑的合歡葉， 用流水沖凈葉片的表面lOmin，然后用無(wú)菌水沖洗3-4次，再用75% (體積分?jǐn)?shù))酒精消毒， 消毒時(shí)間設(shè)定為2min、3min、5min，再用10%次氯酸鈉溶液再次消毒，消毒時(shí)間分別設(shè)定為 2min、3min、5min、IOmin,將不同處理時(shí)間的組織小塊用無(wú)菌水沖洗3_5次,吸取最后一次的無(wú)菌水沖洗液100 μ L涂布于培養(yǎng)基表面作為對(duì)照I ;另外，將消毒后的葉片表面接觸LB 培養(yǎng)基2-3min后取出作為對(duì)照2。用解剖刀將消毒后葉片剪成5mmX 5mm小塊，然后接種在 LB平板培養(yǎng)基(9cm)上，每皿接3塊，每處理3次重復(fù)，于30°C恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2_3d。 若各對(duì)照培養(yǎng)皿中沒(méi)有菌落出現(xiàn)，并且相對(duì)應(yīng)的消毒葉片有菌落出現(xiàn)，則證明表面消毒方法合適，選取這一組合方法作為最佳消毒方法。經(jīng)組織印記法檢驗(yàn)消毒效果，確定較為合適的合歡葉片組織表面消毒方法為:75% (體積分?jǐn)?shù))酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min左右即可達(dá)到合歡葉片表面的徹底消毒。[0030](2)合歡內(nèi)生細(xì)菌H6的分離純化[0031]采用組織塊法，無(wú)菌條件下，取表面消毒處理后的合歡葉片表面接觸LB培養(yǎng)基 2-3min后取出，作為對(duì)照。用解剖刀將消毒后葉片剪成5mmX 5mm小塊,然后接種在LB平板培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)2-3d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，采用平板劃線分離培養(yǎng)法純化，直至獲得純培養(yǎng)，命名為H6。[0032]實(shí)施例2.H6菌株的`鑒定特征[0033]( I)菌體形態(tài)觀察和染色反應(yīng)[0034]將H6接種于LB培養(yǎng)基上，2_3d后觀察，菌落為圓形，干燥，菌落邊緣為鋸齒狀，菌落扁平，不透明，正反面顏色一致為淡黃色。經(jīng)革蘭氏染色觀察，為G+性，桿狀細(xì)菌，長(zhǎng)度為 1.17-1.43um，形成芽孢，中生。[0035](2 ) H6的生理生化特性[0036]觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、卵磷脂酶、V-P測(cè)定、檸檬酸鹽的利用、酪朊水解、吲哚、硝酸鹽還原、丙二酸鹽的利用等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均為陽(yáng)性，而明膠液化、運(yùn)動(dòng)性、甲基紅實(shí)驗(yàn)、脲酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氨酶、纖維素分解等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均顯陰性。[0037]表1H6菌株生理生化特性
【權(quán)利要求】
1.一種合歡內(nèi)生菌H6，分離自山東省青島市城陽(yáng)區(qū)種植的合歡葉片中，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏號(hào):CGMCC N0.:7990。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種合歡內(nèi)生菌H6，其特征在于，H6在LB固體培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度30-32，培養(yǎng)時(shí)間24-48h，該菌的鑒定特征為:H6為桿狀細(xì)菌，G+性，芽孢中生。
3.一種合歡內(nèi)生菌H6的制備方法，其特征在于包含以下步驟:(1)選取新鮮無(wú)病斑的合歡葉，用流水沖凈葉片的表面，然后用無(wú)菌水沖洗3-4次，再用75% (體積分?jǐn)?shù))酒精消毒，消毒時(shí)間為2min，再用10%次氯酸鈉溶液再次消毒，消毒時(shí)間為3min左右，即可達(dá)到合歡葉片表面的徹底消毒；(2)采用組織塊法，無(wú)菌條件下，取表面消毒處理后的合歡葉片表面接觸LB培養(yǎng)基 2-3min后取出，作為對(duì)照,用解剖刀將消毒后葉片剪成5 mmX5 mm小塊,然后接種在LB平板培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)2-3d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，采用平板劃線分離培養(yǎng)法純化，直至獲得純培養(yǎng)，命名為H6。
4.一種合歡內(nèi)生菌H6的抑菌用途，其特征在于:內(nèi)生菌H6菌體本身、發(fā)酵液、無(wú)菌代謝產(chǎn)物及代謝物中活性組分均具有抑菌作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抑菌用途，其特征在于:所屬的菌為蘋果腐爛病菌，葡萄黑痘病菌，西瓜枯萎病菌，小麥赤霉病菌，辣椒炭疽病菌，辣椒炭疽病菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抑菌用途，其特征在于:合歡內(nèi)生細(xì)菌H6對(duì)蘋果腐爛病、葡萄黑痘病、西瓜枯萎病、小麥赤霉病，辣椒炭疽病，辣椒炭疽病的具有潛在的防治作用。
7.一種合歡內(nèi)生菌H6抑菌活性組分的分離和檢測(cè)方法，其特征在于:在GC-MS中無(wú)法檢測(cè)，進(jìn)行各組分的衍生化，方法如下:甲氧胺鹽酸鹽以20mg/mL的含量溶解于吡啶溶液，超聲幫助溶解，吸取100μ I溶劑加入已離心干燥好的樣品管中，封口，超聲15min，渦旋 Imin，幫助溶解，稍微離心，30°C培養(yǎng)2h，加入100 μ L BSTFA至樣品管中，封口，超聲20min 溶解，稍微離心，37°C培養(yǎng)6h，離心15min，轉(zhuǎn)速12000r/min，吸取160 μ L至GC樣品玻璃管中。GC-MS檢測(cè)條件:HP-5MS毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m)。進(jìn)樣口溫度為65°C，進(jìn)樣體積IyL,流速lmL/min,柱箱程序:初始溫度65?保持2min ;以5? /min升至185? ； 以1°C /min升溫至200°C;再以15°C升溫至280°C，保持5min，氦氣為載氣，恒壓模式，進(jìn)樣口壓力58.7kPa，離子源和傳輸線溫度分別為230和280°C，電子能量70eV，全掃描掃描范圍 m/z20~650，溶劑延遲時(shí)間5.5min，檢測(cè)的樣品中，環(huán)(PHE-PRO)具有抗菌活性，其保留時(shí)0間為19.91min。該化合物的結(jié)構(gòu)式為
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK103555607SQ201310365784
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】曲田麗, 金玉蘭, 肖 琳, 李秀嵐 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)