專利名稱：一種抗病無核葡萄高效聚合育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)，特別是涉及一種抗病無核葡萄高效聚合育種方法。
背景技術(shù)：
葡萄作為世界性水果，其種植面積和產(chǎn)量均居世界第二。而無核性狀是葡萄商業(yè)生產(chǎn)中一種特殊的性狀標(biāo)志，在發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，無核葡萄產(chǎn)量已占到葡萄生產(chǎn)總量的60％以上。在我國，隨著市場(chǎng)需求量的增大，無核葡萄的栽培面積也呈上升趨勢(shì)，但因無核葡萄育種技術(shù)的滯后以及新品種的缺乏，嚴(yán)重阻礙了無核葡萄產(chǎn)量及品質(zhì)的提高。目前，在世界范圍內(nèi)對(duì)無核葡萄的育種一般采用傳統(tǒng)常規(guī)雜交育種技術(shù)，即以有核品種作母本，以無核品種作父本雜交后，播種分離，通過對(duì)后代選擇以選育無核葡萄品種，這種方法效率極低，而且鑒定雜種的無核性狀至少需要3～5年結(jié)果后方可進(jìn)行，這種耗時(shí)低效的育種方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需要。
美國《園藝科學(xué)》雜志1990年25卷第4期393～398頁報(bào)道的離體胚挽救技術(shù)，提高了無核葡萄品種間雜交后代無核雜種出現(xiàn)的比率，同時(shí)較常規(guī)傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比，縮短了4～5年時(shí)間，但對(duì)雜交后代目的性狀的觀察是通過胚挽救幼苗定植大田結(jié)果后才進(jìn)行，在幼苗期沒進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，因而效率較低，且選育的無核葡萄品種缺乏抗病性。1990年首次報(bào)道的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸技術(shù)作為植物育種的分子標(biāo)記技術(shù)，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域得到迅猛發(fā)展，并在實(shí)踐中取得了明顯成效，利用該技術(shù)尋找遺傳的分子標(biāo)記，可達(dá)到快捷、簡便、成本低、多態(tài)性豐富、又不需同位素示蹤和安全可靠的效果，因而受到世界分子生物學(xué)界的廣泛重視，但該技術(shù)目前僅屬于一種輔助育種技術(shù)，還沒有被廣泛應(yīng)用于抗病無核葡萄的育種技術(shù)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要克服利用常規(guī)傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)培育抗病無核葡萄周期長、效率低的缺點(diǎn)，發(fā)明了一種融常規(guī)雜交技術(shù)、胚挽救技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)于一體用于培育抗病無核葡萄新品種的高效聚合育種方法體系，從根本上提高抗病無核葡萄的育種效率。
本發(fā)明采用經(jīng)濟(jì)性狀好的無核葡萄品種作母本，以中國野生葡萄中抗病性強(qiáng)的種、株系或雜種作父本進(jìn)行田間人工雜交，40～53天后，采用幼小雜交胚珠進(jìn)行離體胚珠內(nèi)胚挽救，以獲得大量雜交后代的胚挽救幼苗，對(duì)獲得的大量抗病無核葡萄胚挽救苗后代，用檢測(cè)葡萄無核基因和抗病基因的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸標(biāo)記，進(jìn)行幼苗期分子標(biāo)記輔助選擇抗病性狀和無核性狀，以獲得抗病無核葡萄新品種。
利用本發(fā)明培育抗病無核葡萄新品種，僅需3～4個(gè)月即可得到胚挽救幼苗，較常規(guī)雜交育種及常規(guī)等待雜種苗結(jié)果后進(jìn)行鑒定總共至少縮短時(shí)間7～9年，極大的提高了育種效率，達(dá)到同行業(yè)世界領(lǐng)先地位，為充分利用我國特有豐富的野生葡萄抗病基因，快捷培育優(yōu)質(zhì)抗病無核葡萄新品種開創(chuàng)了廣闊前景。
具體實(shí)施方法
a.以中國野生葡萄抗病性強(qiáng)的種、株系或雜種作父本，在開花前1～2天采集其花粉。
b.將采集的花粉烘干研磨裝于玻璃瓶中，將瓶置于干燥器內(nèi)放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> c.以優(yōu)質(zhì)歐洲無核葡萄品種為母本，在開花前2～3天對(duì)花朵去雄，噴水后套袋。
d.次日起以備用花粉對(duì)去雄花朵授粉，連續(xù)授粉三天，授粉后立即對(duì)其套袋，以形成漿果。
e.授粉后40～53天，先將漿果用清水反復(fù)沖洗，后在超凈工作臺(tái)上用70％酒精漂洗20～30秒鐘，再放入0.1％升汞消毒液中浸泡6～8分鐘，然后用無菌水反復(fù)沖洗。
f.將消毒后的漿果在無菌條件下剝?nèi)∨咧椋谂囵B(yǎng)室內(nèi)接種于由胚發(fā)育培養(yǎng)液制成的培養(yǎng)基上促使胚充分發(fā)育。
f.1培養(yǎng)室溫度25～28℃。
f.2光照16小時(shí)。
f.3光照強(qiáng)度2000～3000勒克司。
g.培養(yǎng)55～60天后在培養(yǎng)室內(nèi)無菌剝?nèi)∮着?，接種于由胚萌發(fā)培養(yǎng)液制成的培養(yǎng)基上促使其萌發(fā)。
g.1培養(yǎng)室溫度25～28℃。
g.2光照12小時(shí)。
g.3光照強(qiáng)度1000～1500勒克司。
h.萌發(fā)的幼胚于10～15天后在培養(yǎng)室內(nèi)接種于由成苗培養(yǎng)液制成的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成胚挽救幼苗。
h.1培養(yǎng)室溫度25～28℃。
h.2光照12小時(shí)。
h.3光照強(qiáng)度2000～3000勒克司。
j.將具有4～5片葉的成苗光照鍛煉6～7天。
k.無菌條件下將幼苗移到珍珠巖中煉苗。
k.1濕度80％～95％。
k.2澆灌稀釋800～1000倍的25％多菌靈。
l.15天后將種苗移到溫室內(nèi)的營養(yǎng)土中煉苗3～4個(gè)月。
m.下年春季定植于大田。
n.對(duì)胚挽救幼苗進(jìn)行基因組脫氧核糖核酸的提取。
o.利用檢測(cè)葡萄無核基因和抗病基因的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸標(biāo)記，在幼苗期對(duì)胚挽救幼苗進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇抗病性狀和無核性狀，以淘汰非目標(biāo)性狀的雜交后代。
權(quán)利要求
1.一種抗病無核葡萄高效聚合育種方法，其特征是采用經(jīng)濟(jì)性狀好的無核葡萄品種作母本，以中國野生葡萄中抗病性強(qiáng)的種、株或雜種作父本進(jìn)行田間人工雜交，40～53天后，采用幼小雜交胚珠進(jìn)行離體胚珠內(nèi)胚挽救，以獲得大量雜交后代胚挽救幼苗，對(duì)獲得的大量抗病無核葡萄胚挽救幼苗后代，用檢測(cè)葡萄無核基因和抗病基因的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸標(biāo)記，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇抗病性狀和無核性狀，以獲得抗病無核葡萄新品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗病無核葡萄高效聚合育種方法，其特征是采取以下具體實(shí)施方法2.a以中國野生葡萄抗病性強(qiáng)的種、株系或雜種作父本，在開花前1～2天采集其花粉，2.b將采集的花粉烘干研磨裝于玻璃瓶中，將瓶置于干燥器內(nèi)放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?.c以歐洲優(yōu)質(zhì)無核葡萄品種為母本，在開花前2～3天對(duì)花朵去雄，噴水后套袋，2.d次日起以備用花粉對(duì)去雄花朵授粉，連續(xù)授粉三天，授粉后立即對(duì)其套袋，以形成漿果，2.e授粉后40～53天，先將漿果用清水反復(fù)沖洗，后在超凈工作臺(tái)上用70％酒精漂洗20～30秒鐘，再放入0.1％升汞消毒液中浸泡6～8分鐘，然后用無菌水反復(fù)沖洗，2.f將消毒后的漿果在無菌條件下剝?nèi)∨咧椋谂囵B(yǎng)室內(nèi)接種于由胚發(fā)育培養(yǎng)液制成的培養(yǎng)基上促使胚充分發(fā)育，2.f.1培養(yǎng)室溫度25～28℃，2.f.2光照16小時(shí)，2.f.3光照強(qiáng)度2000～3000勒克司，2.g培養(yǎng)55～60天后在培養(yǎng)室內(nèi)無菌剝?nèi)∮着撸臃N于由胚萌發(fā)培養(yǎng)液制成的培養(yǎng)基上促使其萌發(fā)，2.g.1培養(yǎng)室溫度25～28℃，2.g.2光照12小時(shí)，2.g.3光照強(qiáng)度1000～1500勒克司，2.h萌發(fā)的幼胚于10～15天后在培養(yǎng)室內(nèi)接種于由成苗培養(yǎng)液制成的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成胚挽救幼苗，2.h.1培養(yǎng)室溫度25～28℃，2.h.2光照12小時(shí)，2.h.3光照強(qiáng)度2000～3000勒克司，2.j將具有4～5片葉的成苗光照鍛煉6～7天，2.k無菌條件下將幼苗移到珍珠巖中煉苗，2.k.1濕度80％～95％，2.k.2澆灌稀釋800～1000倍的25％多菌靈，2.l15天后將種苗移到溫室內(nèi)的營養(yǎng)土中煉苗3～4個(gè)月，2.m下年春季定植于大田，2.n對(duì)胚挽救幼苗進(jìn)行基因組脫氧核糖核酸的提取，2.o利用檢測(cè)葡萄無核基因和抗病基因的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸標(biāo)記，在幼苗期對(duì)胚挽救幼苗進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇抗病性狀和無核性狀，以淘汰非目標(biāo)性狀的雜交后代。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗病無核葡萄高效聚合育種方法。葡萄是世界消費(fèi)量最大的水果之一，而無核葡萄又占其總量的60％以上，但無核葡萄品種的培育按常規(guī)方法卻需用7～9年時(shí)間，極大地阻礙了無核葡萄產(chǎn)量及品質(zhì)的提高，本發(fā)明的目的就是要克服利用常規(guī)傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)培育抗病無核葡萄育種周期長、效率低的缺點(diǎn)，公開了一種融常規(guī)雜交技術(shù)、胚挽救技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)于一體的高效聚合育種方法體系，使育種時(shí)間從7～9年縮短到3～4個(gè)月，通過該方法培育的無核葡萄抗病性強(qiáng)，無核比率大，畸果率低，果質(zhì)品位高，開創(chuàng)了葡萄育種新領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1415189SQ0213933
公開日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月5日
發(fā)明者王躍進(jìn), 潘學(xué)軍, 王飛, 張劍俠, 萬怡震, 駱偉強(qiáng) 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)