專利名稱：一種提高植物中水楊酸含量的方法及其專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高植物中水楊酸含量的方法及其專用載體。
背景技術(shù)：
水楊酸(Salicylic acid，SA)是一種酚類化合物，結(jié)構(gòu)式見式I。純品為粉狀結(jié)晶，可溶于水，易溶于極性有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)為157-159℃，干燥后易升華(原永兵，曹宗巽。1994.水楊酸在植物體內(nèi)的作用，植物學(xué)通報(bào)11(3)1-9)。
式I水楊酸在植物體內(nèi)普遍存在，包含游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的水楊酸，經(jīng)研究，外源施加水楊酸可以影響到植物體氣孔開閉、種子萌發(fā)、果實(shí)產(chǎn)量、離子吸收、產(chǎn)熱、開花、性別分化和抑制乙烯的生物合成等生理活動(dòng)，因而SA及其鹽類被認(rèn)為是一類新的植物激素。到了20世紀(jì)90年代，水楊酸作為植物的一種重要的抗脅迫信號(hào)分子得到廣泛研究(劉悅萍，宮飛，趙曉萌。2005.水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與植物抗逆性.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)21(7)227-269)。
研究表明，某些雙子葉植物在受到細(xì)菌、病毒、真菌侵染后，侵染部位的SA水平便顯著增加，同時(shí)出現(xiàn)壞死病斑，即過敏反應(yīng)(Hypersensitive，HR)；由此引起非感染部位SA含量也升高，繼而對(duì)同一病原或其它病原的再侵染產(chǎn)生抗性，即系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。植物在接受到病原菌這一原初信號(hào)之后，首先合成SA，并被侵染點(diǎn)的細(xì)胞受體接受，引起侵染葉片的HR反應(yīng)，并使植物獲得局部獲得性抗性(local acquired resistance，LAR)。SA由侵染葉片運(yùn)輸?shù)椒乔秩救~片，使植株獲得SAR。對(duì)于誘導(dǎo)SAR的可轉(zhuǎn)移的信號(hào)分子是SA還是其它某種未知分子，存在著兩種不同的觀點(diǎn)一種觀點(diǎn)認(rèn)為引起SAR反應(yīng)的信號(hào)分子是SA，當(dāng)病源侵染后，在侵染的部位SA大量積累，并通過維管組織運(yùn)輸?shù)椒乔秩静课唬怪参锂a(chǎn)生了SAR；而另一種觀點(diǎn)認(rèn)為引起SAR反應(yīng)的是另一種信號(hào)分子而非SA，SA只是參與了SAR反應(yīng)(劉悅萍，宮飛，趙曉萌。2005.水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與植物抗逆性.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)21(7)227-269)。
在單子葉植物中也可以產(chǎn)生SAR反應(yīng)。如果用不能與粉狀霉菌共生的菌株來侵染大麥和小麥，則使大麥和小麥獲得了對(duì)粉狀霉菌的抗性(Ouchi S，Oku H，HibinoC.1976.Localization of induced resistance and susceptibility in barleyleaves inoculated with the powdery mildew fungus.Phytopathology.66901-905)。當(dāng)把水稻下部的葉子用Pseudomonas syringae侵染后，上部的水稻葉片就產(chǎn)生了對(duì)Magnapovthe grisea強(qiáng)烈的抗性(Smith JA，Métraux J-P.1991.Pseudomonassyringae pv.Syringae induces systemic resistance to Pyricularia oryzae inrice.Physiol Mol Plant Pathol.39451-461)。水楊酸的類似物可以誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生SAR，產(chǎn)生對(duì)M.grisea和Xanthamonas oryzae的抗性(Métraux J-p，Ahl-Goy P.1991.Induced systemic resistance in cucumber in response to2，6-dichloro-isonicotinic acid and pathogens.In HHennecke，DPS Verna，eds，Advances in Molecular Genetics and Plant Microbe Interactions.Kluwer.Dordrecht，The Netherlands，432-439)，但是對(duì)水稻外源施加SA，并不能像煙草一樣誘導(dǎo)產(chǎn)生SAR反應(yīng)。產(chǎn)生上述現(xiàn)象可能是由于SA在水稻抗逆中是個(gè)第二信使，或者在水稻中發(fā)揮著其它的生物功能(Silverman P，Seskar M，Kanter D，Schweizer P，Métraux J-p，Raskin L.1995.Salicylic acid in rice.Plant Physiol.108633-639)。
水稻中SA的含量遠(yuǎn)高于其它作物，可能是抵抗病原侵染的天然屏障。在Yang等的研究中，通過過量表達(dá)細(xì)菌的水楊酸羥化酶nahG基因來降低水稻中SA的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出一種對(duì)病源侵染和除草劑百草枯引起的氧化傷害非常敏感(YangY，Qi M and Mei C.2004.Endogenous salicylic acid protects rice plants fromoxidative damage caused by aging as well as biotic and abiotic stress.ThePlant Journal.40909-919)，說明水稻中內(nèi)源性的SA起到了抗氧化的重要作用，可以增強(qiáng)水稻對(duì)氧化逆境的耐受性。上述研究結(jié)果表明水楊酸在植物的抗病中發(fā)揮重要作用。
一般認(rèn)為在植物體內(nèi)，屬于簡(jiǎn)單酚類化合物的SA的生物合成是走莽草酸途徑，形成反式肉桂酸，反式肉桂酸的側(cè)鏈經(jīng)氧化或鄰羥基化兩種不同反應(yīng)順序轉(zhuǎn)變成SA(見圖1A)(Spiegel，S.et.al.，1989.Phylopathology.79253-262)。這兩條途徑在植物體內(nèi)可能同時(shí)存在，其區(qū)別在于β-氧化和羥基化的先后順序不同。其中的酶，尤其是催化苯甲酸或鄰香豆酸轉(zhuǎn)化為SA的酶還不清楚。
在特定的假單孢屬中，假單孢菌借助一個(gè)很短的合成途徑通過分支酸(chorismate)來產(chǎn)生SA(合成途徑見圖1B，①反應(yīng)由異分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase)催化；②反應(yīng)由異分支酸-丙酮酸裂解酶(IPL，isochorismate pyruvate lyase)催化)(Gaille C，Kast P，and Haas D.2002.Salicylate biosynthesis in Pseudomonasaeruginosa.The Journal of Biological Chemistry.277(24)21768-21775)，分支酸通常是芳香族的前體。與植物的SA合成不同，假單孢菌SA的合成首先通過異分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase)將分支酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惙种?，再通過異分支酸-丙酮酸裂解酶(IPL，isochorismate pyruvate lyase)將異分支酸裂解為丙酮酸和水楊酸。
人們對(duì)植物中SA途徑的具體步驟還了解很少，但是對(duì)微生物中SA合成途徑的研究已經(jīng)很清楚。一些微生物的SA合成途徑簡(jiǎn)單明確，底物為分支酸。而分支酸作為植物莽草酸酯代謝途徑的終產(chǎn)物也存在于植物中。
水楊酸是阿司匹林(乙酰水楊酸)的藥效成分，該藥的作用和用途有解熱作用、鎮(zhèn)痛作用、抗炎抗風(fēng)濕效應(yīng)、抗血小板凝集作用、抑制腸分泌引起的腹瀉、增加體內(nèi)胰島素的含量、抑制某些前列腺素的合成、升高胃酸濃度、治療早期老年性白內(nèi)障、降低直腸癌的發(fā)生機(jī)率等。但是長(zhǎng)期服用化學(xué)方法合成的乙酰水楊酸會(huì)對(duì)胃產(chǎn)生不良影響，而天然植物和水果中的阿司匹林類似成分沒有相關(guān)的副作用，但是含量過低，很難滿足醫(yī)療和保健的需求，且提取和純化的成本較高。現(xiàn)在人們多以白柳樹皮為原料提取天然的阿司匹林類似物，但是自柳樹資源有限，且被剝?nèi)テさ牧鴺浜茈y有其它的利用價(jià)值。因此迫切需要一種提高植物中水楊酸含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高植物中水楊酸含量的專用載體。
本發(fā)明所提供的用于提高植物中水楊酸含量的載體，是含有異分支酸合成酶基因(ICS)和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因(IPL)的植物表達(dá)載體。
上述載體中的異分支酸合成酶基因的來源是廣泛的，如擬南芥、大腸桿菌或綠膿假單孢桿菌等，其中，來源于擬南芥的異分支酸合成酶基因(icsl)的GenBank號(hào)為AY056055，來源于大腸桿菌的異分支酸合成酶基因(entC)的GenBank號(hào)為M24142，來源于綠膿假單孢桿菌的異分支酸合成酶基因(pchA)的GenBank號(hào)為X82644；所述異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的來源也是廣泛的，如熒光假單孢菌或綠膿假單孢桿菌等，其中，來源于熒光假單孢菌的異分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pmsB)的GenBank號(hào)為Y09356，來源于綠膿假單孢桿菌的異分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pchB)的GenBank號(hào)為X82644。
由于莽草酸酯代謝途徑的終產(chǎn)物-分支酸主要產(chǎn)生于葉綠體中，因此，為獲得更好的轉(zhuǎn)基因效果，所述載體中的異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的5’端還緊密連接有葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列。
所述葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列的選擇是多種多樣的，既可以為異分支酸合成酶基因和/或異分支酸-丙酮酸裂解酶基因自帶的，如擬南芥的異分支酸合成酶基因(icsl)自身帶有的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列，也可以為其它基因的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列，如番茄中的二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase)小亞基的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列，其GenBank號(hào)為CAA29401。
在上述載體中的異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的上游還分別添加有組成型表達(dá)啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、Actin啟動(dòng)子或Ubiquitin等，優(yōu)選為CaMV35S啟動(dòng)子；在異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的下游還分別添加有終止子，如CaMV35S終止子(T35S)或NOS終止子(Tnos)等。
用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pHOS(購(gòu)于Invitrogen公司，原名為GatewayTMvector pH2GW7載體，此處簡(jiǎn)稱為pHOS)、pCAMBIA系列載體(購(gòu)于CAMBIA公司)或其它衍生植物表達(dá)載體。
此外，為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。
以pHOS為出發(fā)載體，構(gòu)建的用于提高植物中水楊酸含量的載體可為pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS或pmBI/pHOS。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高植物中水楊酸含量的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物中水楊酸含量的方法，是將上述專用載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，得到水楊酸含量獲得提高的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。
上述提高植物中水楊酸含量的方法對(duì)所有植物都適用，既適用于水稻、小麥、玉米或高羊茅草等單子葉植物，也適用于柳樹、甘草、板藍(lán)根、大豆、白三葉或生菜等雙子葉植物。
本發(fā)明提供了一種提高植物中水楊酸含量的方法及其專用載體。該方法從水楊酸合成途徑出發(fā)，將不同的ICS基因和IPL基因組合導(dǎo)入植物。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻中游離態(tài)SA含量最高達(dá)到了野生型的29倍。本發(fā)明的方法及其專用載體將在植物(特別是水稻)中水楊酸含量的提高中發(fā)揮巨大作用，并為植物的品種改良提供了一條新的途徑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1A為植物體內(nèi)水楊酸合成的假設(shè)途徑圖lB為假單孢綠膿桿菌的水楊酸合成途徑圖1為用于提高植物中水楊酸含量的專用載體的構(gòu)建示意2為用于提高植物中水楊酸含量的專用載體的結(jié)構(gòu)示意簡(jiǎn)3為野生型水稻和不同ICS和IPL基因組合轉(zhuǎn)基因T1代水稻葉片游離態(tài)SA含量的比較結(jié)果圖4為轉(zhuǎn)基因水稻葉片中外源基因表達(dá)量與游離態(tài)SA含量對(duì)應(yīng)關(guān)系的半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖5為高含量SA的轉(zhuǎn)基因水稻中抗病相關(guān)基因的半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖6為SA高表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻中過氧化物含量的檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，可參考Sambrook et al.，2001，Molecular cloningA Laboratory Manual，所用引物序列由英俊公司、賽百盛公司合成。
試劑及儀器一般生化試劑購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和膠回收試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于TIANGEN BIOTECH公司；Taq聚合酶和PFU聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等酶試劑購(gòu)于TaKaRa公司。層析儀型號(hào)為BioLogic DuoFlow Chromatography System，BioRad公司產(chǎn)品。C18反向柱為Develosil Packed Column(φ4.6×250mm)，購(gòu)自Develosil公司。
實(shí)施例1、構(gòu)建用于提高植物中水楊酸含量的載體現(xiàn)參照?qǐng)D1(按基因的功能分別用ICS和IPL代表相應(yīng)的基因，IPL包括pmsB、pchB；ICS包括entC icsl、pchA。ss，葉綠體定位信號(hào)；35S，CaMV 35S啟動(dòng)子；Ter，35S終止子。)，構(gòu)建用于提高植物中水楊酸含量的植物轉(zhuǎn)化載體，具體方法如下
一、異分支酸合成酶基因(ICS)和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因(IPL)的擴(kuò)增1、來源于大腸桿菌的異分支酸合成酶基因(entC)的擴(kuò)增以大腸桿菌DH5α的基因組DNA為摸板，在引物p15’-GGCAGAACGGCGCAGGACAT-3’和p25’-CGATAGCGACGGGCAAACTCTTC-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增異分支酸合成酶基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為1176bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓揇NA片段，將該基因命名為entC，GenBank號(hào)為M24142。
2、來源于擬南芥的異分支酸合成酶基因(icsl)的擴(kuò)增以擬南芥的cDNA為模板，在引物p75’-ATGGCTTCACTTCAATTTTCTTCTC-3’和p85’-TCAATTAATCGCCTGTAGAGATGTT-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增異分支酸合成酶基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為1710bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓揇NA片段，將該基因命名為icsl，GenBank號(hào)為AY056055。
3、來源于綠膿假單孢桿菌的異分支酸合成酶基因(pchA)的擴(kuò)增以綠膿假單孢桿菌PA01(P.aeraginosa，中科院微生物所1.1782)的基因組DNA為模板，在引物p95’-CGCGGATCCATGAGCCGGCTGGCGCCCCT-3’和p105’-GCGAAGCTTGGCGACGCCGCGCTGCAAG-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增異分支酸合成酶基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為1446bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓揇NA片段，將該基因命名為pchA，GenBank號(hào)為X82644。
4、來源于熒光假單孢菌的異分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pmsB)的擴(kuò)增以熒光假單孢菌(ATCC17400)的基因組DNA為模板，在嵌套引物p35’-CGCCATCGAATCAAACACAG-3’，p45’-TCAAGTCGTCAGGCATCCAC-3’，p55’-ATGCTGCCGCTAAAACCG-3’和p65’-TCATGACTTGGCCTGCGC-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增異分支酸-丙酮酸裂解酶基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為336bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓揇NA片段，將該基因命名為pmsB，GenBank號(hào)為Y09356。
5、來源于綠膿假單孢桿菌的異分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pchB)的擴(kuò)增以綠膿假單孢桿菌PA01(P.aeraginosa，中科院微生物所1.1782)的基因組DNA為模板，在引物p115’-CGCGGATCCATGATGAAAACTCCCGAAGACTGCA-3’和p125’-GCGAAGCTTTCATGCGGCACCCCGTGT-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增異分支酸-丙酮酸裂解酶基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為327bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓揇NA片段，將該基因命名為pmsB，GenBank號(hào)為X82644。
二、番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列(ss)的擴(kuò)增及與異分支酸合成酶基因、異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的融合1、番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列(ss)的擴(kuò)增以番茄的基因組DNA為模板，在引物p135’-ATGGCTTCCTCTGTCATTTC-3’和p145’-GCTAACTCTTCCACCATTGC-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為168bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符。回收并純化該DNA片段，將該片段命名為ss，GenBank號(hào)為CAA29401。
2、番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列與異分支酸合成酶基因、異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的融合除icsl外(自帶有葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列)，通過常規(guī)的重疊延伸PCR反應(yīng)將entC、pmsB、pchA和pchB基因分別與番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列ss進(jìn)行融合，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得了長(zhǎng)度為1176bp、336bp、309bp和1431bp的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓鲜鯠NA片段，將四種融合基因分別命名為ss-entC、ss-pmsB、ss-pchA和ss-pchB。然后將四種融合基因片段及icsl分別克隆到中間載體pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司)中，反應(yīng)體系為目的DNA 2.3μl，pENTR/D-TOPO 0.25μl，Salt solution 0.45μl，混勻后，先在室溫下反應(yīng)5min，然后冰浴5min，反應(yīng)結(jié)束后，將四種重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，得到分別攜帶有ss-entC、ss-pmsB、ss-pchA、ss-pchB及icsl的中間載體，分別命名為ssentC/TOPO、sspmsB/TOPO、sspchA/TOPO、sspchB/TOPO和icsl/TOpO，將ssentC/TOPO、sspchA/TOPO和icsl/TOpO統(tǒng)稱為ssICS/TOPO，將sspmsB/TOPO和sspchB/TOpO統(tǒng)稱為ssIPL/TOPO。
三、分別含有融合基因ss-pmsB和ss-pchB的植物表達(dá)載體的獲得將融合有番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列ss的融合基因ss-pmsB和ss-pchB通過LR交換反應(yīng)從中間載體ssIPL/TOPO轉(zhuǎn)到植物表達(dá)載體pHOS(來源于Invitrogen公司的GatewayTMvector pH2GW7載體，此處簡(jiǎn)稱為pHOS)中，LR交換反應(yīng)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為L(zhǎng)R buffer 2μl，ssIPL/TOPO 1μl(100～300ng)，pHOS 1μl(150～300ng)，LR Clonase Enzyme mix 1μl，ddH2O5μl，25℃反應(yīng)1～3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將交換產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并抽提質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明得到了插入序列正確的分別含有ss-pmsB和ss-pchB的重組載體，分別命名為sspchB/pHOS和sspmsB/pHOS，上述載體中的融合基因的上、下游分別為花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子(P35S)及其終止子(T35S)。再分別以質(zhì)粒sspchB/pHOS和sspmsB/pHOS為模板，在引物p135’-GCGGAGCTCAGCTCTCCCATATGGTCGACTAGAGC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SacI識(shí)別位點(diǎn))和p145’-CGCTCTAGATCCGACGTCGCATGCCTG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XbaI識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得了長(zhǎng)度為1708bp的含有P35S啟動(dòng)子、ss-pmsB和T35S終止子的目的片段，以及2090bp的含有P35S啟動(dòng)子、ss-pchB和T35S終止子的目的片段，經(jīng)序列分析證明與預(yù)期結(jié)果相符。然后用限制性內(nèi)切酶SacI和XbaI對(duì)上述兩個(gè)目的片段進(jìn)行雙酶切，再將兩種酶切片段分別克隆到載體pHOS中，經(jīng)測(cè)序鑒定后，將獲得的含有融合基因ss-pmsB的植物表達(dá)載體命名為pMBOS，將獲得的含有融合基因ss-pchB的植物表達(dá)載體命名為pCHBOS。
四、用于提高植物中水楊酸含量的載體的獲得將icsl及融合基因ss-entC和ss-pchA分別通過LR反應(yīng)從pENTR/D-TOPO中間載體icsl/TOPO、ssentC/TOPO和sspchA/TOPO重組到pMBOS和pCHBOS中，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與步驟三中的相同，得到用于提高植物中水楊酸含量的載體分別命名為pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS和pmBI/pHOS，載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示(35SCaMV35S啟動(dòng)子，ss葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列，T35SCaMV35S終止子)。
實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其SA含量的測(cè)定以水稻為例，檢測(cè)本發(fā)明的用于提高植物中水楊酸含量的載體對(duì)植物中SA含量的影響，具體方法如下一、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS和pmBI/pHOS分別轉(zhuǎn)化水稻中花11號(hào)的愈傷組織中，經(jīng)培育得到轉(zhuǎn)化有上述不同載體的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)鑒定，每種轉(zhuǎn)基因植株得到10個(gè)以上的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系，將轉(zhuǎn)化有pmBE/pHOS的轉(zhuǎn)基因水稻命名為pmBE(含有pmsB和entC)，將轉(zhuǎn)化有pmBI/pHOS的轉(zhuǎn)基因水稻命名為pmBI(含有pmsB和entC)，將轉(zhuǎn)化有pmBA/pHOS的轉(zhuǎn)基因水稻命名為pmBA(含有pmsB和pchA)，將轉(zhuǎn)化有pcBI/pHOS的轉(zhuǎn)基因水稻命名為pcBI(含有pchB和icsl)，將轉(zhuǎn)化有pcBE/pHOS的轉(zhuǎn)基因水稻命名為pcBE(含有pchB和entC)。
二、轉(zhuǎn)基因水稻的SA含量測(cè)定用高效液相色譜法檢測(cè)步驟一獲得的5種ICS和IPL基因組合的轉(zhuǎn)基因水稻植株(pmBE、pcBE、pmBA、pcBI、pmBI)T0代和T1代植株葉片中的SA含量，為了減少不同生長(zhǎng)期水稻的水楊酸含量差異，選取第3片真葉和第4片真葉作為樣品進(jìn)行測(cè)量，具體方法如下1、T0代轉(zhuǎn)基因水稻的SA含量測(cè)定隨機(jī)選取上述5種轉(zhuǎn)基因水稻T0代幼苗的葉片，用高效液相色譜法檢測(cè)葉片中的SA含量，并用同期轉(zhuǎn)化pHOS空載體的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗作為對(duì)照，檢測(cè)方法包括以下步驟1)水楊酸(SA)的提取按照Verberne等人(Verberne MC，Brouwer N，Delbianco F，Linthorst HJM.BolJF，Verpoorte R.2002.Method for the extraction of the volatile compoundsalicylic acid from tobacco leaf material.Phytochem.Anal.1345-50)的方法提取水楊酸，具體方法為將待測(cè)葉片在液氮中研磨成粉，收集至事先稱重的2mL離心管中加入1mL 90％甲醇，渦旋1min，超聲5min，最大速度離心5min，收集上清至新離心管中，將沉淀用0.5mL 100％甲醇重懸，渦旋1min，超聲5min，最大速度離心5min，合并上清，將上清再用最大速度離心5min，去不溶物，加入10μ1 0.2M NaAc，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至剩余約60μl，加入250μl 5％TCA，渦旋，加入800μl乙酸乙脂∶環(huán)乙烷(1∶1)抽提，重復(fù)一次，合并上層相，加入60μl 0.2M NaAc，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干粉，得到游離態(tài)水楊酸。
將游離態(tài)SA提取后的下層相加入HCl至終濃度為1M，加入60μl 0.2M NaAc，80℃水解1小時(shí)，加入800μl乙酸乙脂∶環(huán)乙烷(1:1)抽提，重復(fù)一次，合并上層相，加入60μl 0.2M NaAc，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干粉，即得到結(jié)合態(tài)水楊酸。
2)回收率的測(cè)定選取7mg水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，用上述方法提取游離態(tài)和結(jié)合態(tài)水楊酸，溶解于lmL HPLC流動(dòng)相中，取30μl上樣經(jīng)HPLC柱層析，測(cè)定吸收峰面積。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，查得測(cè)定值為5.798，計(jì)算回收率為82％。
3)用HPLC測(cè)定水楊酸含量HPLC流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸(35∶65∶3)，層析柱為C18(φ4.6×250mm)，檢測(cè)溫度為室溫，流速為0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)300nm，上樣量為30μl，經(jīng)HPLC柱層析，分析吸收峰，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知待測(cè)樣品中的SA含量。
4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制進(jìn)行生物樣品分析時(shí)，常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差又稱RSD(Relative StandardDeviation)表示精密度，精密度系指用該法測(cè)定同一勻質(zhì)樣品的一組測(cè)量值彼此符合的程度。RSD應(yīng)達(dá)到5％以內(nèi)，不能超過10％。制備0.0167μg/μl的SA標(biāo)準(zhǔn)品6份，分別經(jīng)HPLC柱層析，分析6份樣品檢測(cè)結(jié)果的RSD值為1.2％，證明此檢測(cè)方法的偏差在規(guī)定范圍內(nèi)。然后精密稱取105℃干燥至恒重的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品約100mg，置100mL容量瓶中，加75％乙醇使溶解并稀釋至刻度；配成1mg/mL的母液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。將母液分別稀釋20、40、60、80、100、500倍，取30μl樣品經(jīng)HPLC柱層析，在波長(zhǎng)340nm處測(cè)定吸收值，經(jīng)計(jì)算回歸方程為y＝19.443x+0.1178，r2＝0.9997。結(jié)果表明，水楊酸在0.002-0.05μg/μl的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
實(shí)際的檢測(cè)結(jié)果表明，野生型水稻中游離態(tài)與結(jié)合態(tài)SA的含量相近；在轉(zhuǎn)基因水稻中，隨著游離態(tài)SA含量的提高，結(jié)合態(tài)SA的含量也成比例地提高，且結(jié)合態(tài)SA提高的倍數(shù)更大，因此，現(xiàn)以游離態(tài)SA含量的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。上述5種轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株中的游離態(tài)SA含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示，在對(duì)不同基因組合的初步檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)上述5種轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株中的游離態(tài)SA含量均比對(duì)照(野生型植株(或空載體轉(zhuǎn)化植株))有所提高，特別是其中pcBE的5個(gè)獨(dú)立株系的游離態(tài)SA含量均顯著高于對(duì)照，且其中4個(gè)株系(2、3、8、52號(hào))遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照植株。
表1 T0代轉(zhuǎn)基因水稻葉片游離SA含量

2、T1代轉(zhuǎn)基因水稻的游離態(tài)SA含量測(cè)定現(xiàn)進(jìn)一步對(duì)上述5種轉(zhuǎn)基因水稻(pmBE、pcBE、pmBA、pcBI、pmBI)T1代的SA含量進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以野生型為對(duì)照(wt)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，從每種轉(zhuǎn)基因水稻中選取4-6個(gè)陽(yáng)性植株的第三片和第四片真葉作為待測(cè)樣品，用與步驟1相同的方法提取SA和SA含量測(cè)定，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。SA含量測(cè)定結(jié)果及方差分析結(jié)果如表2所示，F(xiàn)0.05和F0.01分別表示在顯著性水平α＝0.05和α＝0.01下的統(tǒng)計(jì)量。當(dāng)F＜F0.05時(shí)，說明轉(zhuǎn)基因植株水楊酸含量與野生型相比差異不顯著；當(dāng)F0.05＜F＜F0.01，時(shí)，說明轉(zhuǎn)基因植株水楊酸含量與野生型相比差異顯著；當(dāng)F＞F0.01時(shí)，說明轉(zhuǎn)基因植株水楊酸含量與野生型相比差異極其顯著。pmBE、pcBE、pmBA、pcBI和pmBI T1代的游離態(tài)SA含量比較結(jié)果如圖3所示，其中pmBI、pcBI和pmBE轉(zhuǎn)基因植株游離態(tài)SA含量同野生型相比稍有增高，而pmBA和pcBE轉(zhuǎn)基因植株游離態(tài)SA含量同野生型相比有較大的提高，特別是pcBE轉(zhuǎn)基因水稻中的游離態(tài)SA平均含量與野生型相比提高了18.57倍，pcBE五個(gè)轉(zhuǎn)基因株系游離SA含量測(cè)定結(jié)果如表3所示。
上述分析結(jié)果表明，將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化水稻后，水稻中的SA含量均獲得提高，且不同的ICS和IPL基因組合在水稻中合成SA能力存在差異，其中pcBE轉(zhuǎn)基因水稻的SA含量提高幅度最顯著，表明pchB和entC形成的基因組合在水稻中的活性最高。
表2 T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片游離SA含量及方差分析結(jié)果

注查表獲得所測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差F0.05(1，17)＝4.45，F(xiàn)0.01(1，17)＝8.4。
表3 T1代pcBE轉(zhuǎn)基因水稻部分株系的游離SA含量


實(shí)施例3、半定量RT-PCR法檢測(cè)基因表達(dá)與SA含量的關(guān)系用半定量RT-PCR法檢測(cè)實(shí)施例2獲得的轉(zhuǎn)基因水稻pcBE中外源基因(含有pchB和entC)的表達(dá)量，并分析基因表達(dá)量與水楊酸含量提高的相關(guān)性，以確定水楊酸含量的提高是否是由于導(dǎo)入的外源基因的過量表達(dá)引起的。具體方法為選取游離態(tài)SA含量不同的13株pcBE轉(zhuǎn)基因水稻，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以該cDNA為模板，用外源基因5’連接的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列的引物(p135’-ATGGCTTCCTCTGTCATTTC-3’和p145’-GCTAACTCTTCCACCATTGC-3’)和內(nèi)源參照基因Actin的引物(p155’-TCCGTGACATCAAGGAAAAG-3’和p165’-GATATCAACATCGCACTTCATG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見圖4中的圖b)，經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到200bp的Actin條帶和168bp的信號(hào)肽條帶，計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)量，并與13株pcBE轉(zhuǎn)基因水稻中的游離態(tài)水楊酸含量(見圖4中的圖a)進(jìn)行比較，通過凝膠成像軟件算出外源基因的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列擴(kuò)增條帶和Actin擴(kuò)增條帶強(qiáng)度的比值(相對(duì)表達(dá)量)，見圖4中的圖c。由圖4中的圖a與圖c可以看出，游離態(tài)SA含量高的樣本，外源基因的相對(duì)表達(dá)量也越高，證明轉(zhuǎn)基因植株中SA含量的提高是由于過表達(dá)了外源基因所致。
實(shí)施例4、半定量RT-PCR檢測(cè)高含量SA的轉(zhuǎn)基因植株中抗病相關(guān)基因的表達(dá)情況在擬南芥和煙草中，感染細(xì)菌或真菌性病原體，或是提高內(nèi)源性SA含量，均可以誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因(如NPR1、PR1、PR2和PR5等)的表達(dá)，并引發(fā)SAR反應(yīng)。而在水稻中，幼苗感染細(xì)菌或是真菌性病原體，SA含量沒有或是僅發(fā)生了很小的改變。當(dāng)對(duì)水稻施加外源SA時(shí)，不能激活PR基因表達(dá)或誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生?，F(xiàn)用半定量RT-PCR檢測(cè)SA含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因水稻中抗病相關(guān)基因的表達(dá)情況，具體方法為提取野生型水稻和一株pcBE轉(zhuǎn)基因水稻pcBE-3葉片的總的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，分別用OsNPR1(nonexpresser of pathogenesis-related genel，NPR1)的半定量引物(p175’-TGATCTTATCTGTTGCCAACTTATGC-3’和P185’-ACCCAGGTTAAATTCCAAAGTTCC-3’)和內(nèi)源參照基因Actin的引物(p15和p16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)用OsPBZ/PR10(probenazole-inducible gene，PBZ)的半定量引物(p195’-GCGGCTGTGGAAGGCGTTCAT-3’和p205’-CAGGGTGAGCGACGAGGTAGTCCT-3’)和內(nèi)源參照基因Actin的引物(p15和p16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(W，野生型水稻；T，轉(zhuǎn)基因水稻pcBE)，經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到200bp的Actin條帶、500bp的osNPR1基因條帶和300bp的OsPBZ/PR10基因條帶，表明在T0代轉(zhuǎn)基因水稻pcBE-3的葉片中，抗病相關(guān)基因OsNPR1，OsPBZ/PR10大量表達(dá)，而在野生型水稻中相應(yīng)的基因沒有表達(dá)，表明在高含量SA的轉(zhuǎn)基因水稻中的OsNPR1和OsPBZ/PR10的表達(dá)被強(qiáng)烈激活，說明在沒有外源施加化學(xué)物質(zhì)處理或是病原體感染的情況下，提高內(nèi)源性的SA的表達(dá)量可以激活水稻中與抗病相關(guān)的OsNPR1和OsPBZ/PR10基因的表達(dá)，推測(cè)該轉(zhuǎn)基因水稻具有較高的抗病性。
實(shí)施例5、SA高表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻中過氧化物的檢測(cè)Yang等人在水稻中組成型表達(dá)細(xì)菌的水楊酸羥化酶，以此來降低水稻中內(nèi)源性SA的含量，引起轉(zhuǎn)基因水稻中過氧化物和H2O2水平的升高，出現(xiàn)發(fā)育和光依賴的損傷(Yang Y，Qi M and Mei C.2004.Endogenous salicylic acid protects rice plantsfrom oxidative damage caused by aging as well as biotic and abiotic stress.The Plant Journal.40909-919)。選取提高內(nèi)源SA含量的轉(zhuǎn)基因水稻葉片，利用可與過氧化物反應(yīng)的底物NBT(nitro blue tetrazolium)來檢測(cè)過氧化物的含量，具體方法為選擇野生型水稻和T1代pmBE轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)植株選取5個(gè)葉片，用解剖刀將水稻葉片從基部切離植株，并將基部浸泡于1mg/mL NBT中8小時(shí)，之后于95％的乙醇中煮沸15分鐘進(jìn)行脫色，過氧化物含量越高，顯色越深。以經(jīng)水處理的野生型水稻葉片為對(duì)照，平行檢測(cè)3次。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(pmBE，WT分別為經(jīng)1mg/mL NBT處理的pmBE轉(zhuǎn)基因和野生型水稻葉片；WT+H2O為水處理的野生型水稻葉片)，結(jié)果表明，水楊酸含量越高，植物體中的過氧化物含量就越少，從另一個(gè)方面證明了SA在抗氧化方面的作用。在水稻體內(nèi)高水平的SA也許能直接作為抗氧化劑來抵抗過氧化物或是間接通過激活抗氧化劑來調(diào)整氧化還原平衡。
實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因生菜和甘草的獲得及其SA含量的初步測(cè)定將實(shí)施例1構(gòu)建的含有水楊酸合成關(guān)鍵酶基因ICS和IPL的載體pcBE/pHOS、pmBA/pHOS分別轉(zhuǎn)入雙子葉植物生菜和甘草中，轉(zhuǎn)基因生菜的獲得方法為利用生菜子葉為外植體，經(jīng)分別轉(zhuǎn)化有載體pcBE、pmBA的農(nóng)桿菌EHA105侵染10分鐘后，在MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，洗滌后，在篩選培養(yǎng)基(在MS培養(yǎng)基得基礎(chǔ)上添加潮霉素50毫克/升)上連續(xù)繼代培養(yǎng)20-30天，再經(jīng)生根后，獲得轉(zhuǎn)基因生菜。轉(zhuǎn)基因甘草的獲得方法為以甘草種子中的胚尖為外植體，將胚尖浸泡在分別轉(zhuǎn)化有載體pcBE、pmBA的農(nóng)桿菌EHA105農(nóng)桿菌菌液中，進(jìn)行超聲波輔助浸染10min，用無菌濾紙吸干后置于MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48-72小時(shí)，再經(jīng)過篩選和生根，獲得轉(zhuǎn)基因甘草苗。然后用與實(shí)施例2中相同的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生菜和甘草葉片中的SA含量，結(jié)果與對(duì)照(野生型生菜和甘草)相比，轉(zhuǎn)化有載體pcBE/pHOS、pmBA/pHOS的轉(zhuǎn)基因生菜和甘草葉片中的SA含量顯著提高，初步測(cè)定的提高倍數(shù)約為10倍。
上述轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證明本發(fā)明提高植物中水楊酸含量的方法及其專用載體不但可以用于提高單子葉植物的SA含量，也可用于提高雙子葉植物的SA含量。
權(quán)利要求
1.用于提高植物中水楊酸含量的載體，是含有異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的植物表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于所述異分支酸合成酶基因來源于擬南芥、大腸桿菌或綠膿假單孢桿菌，所述異分支酸-丙酮酸裂解酶基因來源于熒光假單孢菌或綠膿假單孢桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述來源于擬南芥的異分支酸合成酶基因的GenBank號(hào)為AY056055，來源于大腸桿菌的異分支酸合成酶基因的GenBank號(hào)為M24142，來源于綠膿假單孢桿菌的異分支酸合成酶基因的GenBank號(hào)為X82644，來源于熒光假單孢菌的異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的GenBank號(hào)為Y09356，來源于綠膿假單孢桿菌的異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的GenBank號(hào)為X82644。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的載體，其特征在于所述異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的5’端緊密連接有葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于所述葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列為異分支酸合成酶基因和/或異分支酸-丙酮酸裂解酶基因自帶的，或其它基因的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于所述葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列為番茄中的二磷酸核酮糖羧化酶小亞基的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列，其GenBank號(hào)為CAA29401。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于所述異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的上游分別添加有CaMV35S啟動(dòng)子、Actin啟動(dòng)子或Ubiquitin啟動(dòng)子；在異分支酸合成酶基因和異分支酸-丙酮酸裂解酶基因的下游分別添加有CaMV35S終止子或NOS終止子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pHOS、pCAMBIA系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體；以pHOS為出發(fā)載體構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS或pmBI/pHOS。
9.一種提高植物中水楊酸含量的方法，是將權(quán)利要求1所述的載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，得到水楊酸含量獲得提高的轉(zhuǎn)基因植株。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米或高羊茅草，所述雙子葉植物為甘草、生菜、板藍(lán)根、柳樹、大豆或白三葉草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物中水楊酸含量的方法及其專用載體。該載體是含有異分支酸合成酶基因和異分支酸－丙酮酸裂解酶基因的植物表達(dá)載體。該方法從水楊酸合成途徑出發(fā)，將不同的ICS基因和IPL基因組合導(dǎo)入植物。該方法是將所述載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，得到水楊酸含量獲得提高的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻中游離態(tài)SA含量最高達(dá)到了野生型的29倍。本發(fā)明的方法及其專用載體將在植物中水楊酸含量的提高中發(fā)揮巨大作用，并為植物的品種改良和增加農(nóng)作物的用途提供了一條新的途徑。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1850978SQ20061007865
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日
發(fā)明者王喜萍, 于鯤, 陳麗娜, 謝瑩, 夏勉, 張朝暉 申請(qǐng)人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司