專利名稱：：產(chǎn)率增加的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉;M目對(duì)于相應(yīng)的野生型植物而言增加植物產(chǎn)率的方法.it^具體而言，本發(fā)明涉及通過增加植物中稻(Oi^flwm'vfl)(Os)MADS18樣多肽或其同源物的活性來增加植物產(chǎn)率的方法。本發(fā)明還涉及OsMADS18樣多肽或其同源物活性增加的植物，所述植物相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)率。本發(fā)明還提供了在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體
背景技術(shù)：
：不斷增加的世界人口和逐漸減少的農(nóng)業(yè)可用耕地迫使研究朝向提高農(nóng)業(yè)的效率。傳統(tǒng)的作物和園藝學(xué)改良方法利用選育技術(shù)來鑒定具有預(yù)期性狀的植物。然而，此類選育技術(shù)有一些缺陷，即這些技術(shù)一般為勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生的植物通常包含異質(zhì)的遺傳組分，當(dāng)這些異質(zhì)的遺傳組分從親M物傳遞時(shí)不一定產(chǎn)生預(yù)期的性狀。分子生物學(xué)的逸艮已經(jīng)允許人類修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì).植物基因工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般以DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳物質(zhì)引入植物.這類技術(shù)具有傳遞具多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的作物或植物的能力.在經(jīng)濟(jì)上特別讓人感興趣的性狀是產(chǎn)率.產(chǎn)率通常定義為作物可測(cè)量經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)出。這可以以數(shù)量和/或質(zhì)量的方式進(jìn)行定義。產(chǎn)率直接取決于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)量和大小、植物構(gòu)造(例如，分枝的數(shù)量)、種子產(chǎn)量等等.根的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是決定產(chǎn)率的重要因素?？梢酝ㄟ^優(yōu)化上述因素之一來增加作物產(chǎn)率。增加植物產(chǎn)率的能力將在諸如農(nóng)業(yè)，包括觀賞植物的生產(chǎn)、樹木栽培(aboriculture)、園藝學(xué)和林業(yè)等領(lǐng)域具有許多應(yīng)用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物，增加植物中OsMADS18樣多肽的活性使植物具有增加的產(chǎn)率。MADS盒基因(酵母MCM1、植物4gamous和2eficiens以;^ASRF(血清反應(yīng)因子))構(gòu)成一大類真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因家族，參與酵母、植物和動(dòng)物發(fā)育的方方面面。MADS盒基因編碼強(qiáng)烈保守的MADS結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與其把基因調(diào)控區(qū)中的特定盒進(jìn)行DNA結(jié)合。此基因家族可劃分為兩個(gè)主要世系，I型和II型。n型基因也稱為MIKC型蛋白，源于其所擁有的四個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(見圖1，摘自Jack(2001)PlantMolecBiol46:515-520):-^08代^0^入結(jié)合，位于蛋白N末端的大約60M酸(高度保守)；-I代表居間結(jié)構(gòu)域(interveningdomain)(次保守)，參與MADS二聚體的選擇性形成；-K代表負(fù)責(zé)二聚化的角蛋白結(jié)構(gòu)域(充分保守)；-￡代表參與轉(zhuǎn)錄激活或多聚轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物形成的C末端區(qū)域(序列和長度可變)。已在擬南芥(Jra6iVto/w/s)中鑒定到100多個(gè)MADS盒基因，并且已按系統(tǒng)發(fā)生學(xué)歸類為12個(gè)進(jìn)化枝，每個(gè)進(jìn)化枝與MADS共有序列具有特殊的偏移(Thiessen等(1996)JMolEvol43:484-516)。OsMADS18(以前稱為FDRMADS7或OsMADS28)，連同如下擬南芥基因FUL/Agl8(FRUITFULL)、CAL/Agl10(CAULIFLOWER)、APl/Agl7(APETALA1)和^it較少的MADSAGL79，均屬于SQUA進(jìn)化枝eRJjSQUAMOSA,來自金魚草04"ftVrW/f"iif附q/"s))。SQUA進(jìn)化枝的基因?yàn)閰⒄誄oen和Meyerowitz于1991年(Nature353:31-7)提出的ABC花器官特征說明模型(ABCfloralorganidentityspecificationmodel)的功能器官特征基因。稻擁有四個(gè)A類基因OsMADS14、OsMADS15、OsMADS18和OsMADS20，每一個(gè)都是SQUA進(jìn)化枝的成員。雙子葉植物的SQUA進(jìn)化枝被再分為兩個(gè)亞枝，AP1和FUL亞進(jìn)化枝。這些亞進(jìn)化枝基本上在位于其相應(yīng)蛋白C末端的特異性JiJJ^序方面存在差異(Litt和Irish(2003)Genetics165:821-833)。除了存在特異性AP1^J^g序之外，雙子葉植物AP1進(jìn)化枝相關(guān)蛋白通常還在其C末端含有法尼基化(farnesylation)基序(此基序?yàn)镃AAX，其中C為半胱氨酸，A通常為脂肪族氨基酸，而X為甲硫氨酸、谷酰胺(glutamine)、絲氨酸、半胱氨酸或丙氨酸)。在單子葉植物中，SQUA進(jìn)化枝蛋白也被再分為兩大組，這可以基于位于其蛋白最后15個(gè)氨基酸中的保守C末端基序予以區(qū)分LPPWMLRT(SEQIDNO:18)和LPPWMLSH(SEQIDNO:19)(圖2)。與SQUA進(jìn)化枝雙子葉植物的序列形成對(duì)比，SQUA進(jìn)化枝單子葉植物的序列其C末端沒有法尼基化基序.OsMADS18與玉米ZMM28多肽及大麥m3多肽聚集成簇(Becker和Thiessen(2003)MolPhylogenetEvol29(3):464-89)。所有這三種蛋白在其C末端大約最后15個(gè)氨基酸中均含有LPPWMLRT^^M序，來自SQUA進(jìn)化枝的兩個(gè)其他稻MADS盒蛋白，OsMADS14和OsMADS15，屬于在其C末端大約最后15個(gè)氨基酸中具有LPPWMLSH基序的亞進(jìn)化枝.對(duì)于這兩類基序，LPPWMLRT(SEQIDNO:18)和LPPWMLSH(SEQIDNO:19),最保守的A^酸位于第二位(P代表脯氨酸)和第四位(W代表色氨酸).OsMADS18為一種廣a達(dá)的基因，其RNA可在根、葉、花和發(fā)育的果仁組織中檢測(cè)到(Masiero等(2002)JBiolChem277(29):26429-35)。OsMADS18可能參與從營養(yǎng)生長向開花的轉(zhuǎn)變(Fornara等(2004)PlantPhysiol135(4):2207-19).OsMADS18在稻中的組成型it^達(dá)作為植物成熟加速的后果導(dǎo)致植物矮化和早期開花.在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中，已證明OsMADS18與OsMADS6、OsMADS24、OsMADS45和OsMADS47形成異源二聚體。OsMADS18還與OsNF-YBl特異性iiM目互作用，后者與擬南芥LeafyCotyledonl(LECl或AtNF-YB9)享有最高的序列同一性。也已經(jīng)證明了三種蛋白OsMADS18、OsMADS6和OsNF-YBl之間三重復(fù)合物的形成(Masiero等(2002)JBiolChem277(29):26429-35)。Yanofsky等在US6,229,068Bl中描述了利用AGL8相關(guān)基因產(chǎn)物并在植物中異位表達(dá)之來增加植物種子(或果實(shí))大小的方法。該文獻(xiàn)中提及的用于異位表達(dá)AGL8相關(guān)基因產(chǎn)物的優(yōu)選調(diào)控元件是組成型的、種子偏好型的或誘導(dǎo)型的元件。國際專利申請(qǐng)WO02/33091公開了用于維持開花和植物構(gòu)造的單子葉植物(來自多年生黑麥草)MADS盒轉(zhuǎn)錄因子。國際專利申請(qǐng)WO03/057877公開了不同大麥品種中具有單核苷酸多態(tài)性(SNP)的MADS盒cDNA。
發(fā)明內(nèi)容才艮據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了增加植物產(chǎn)率的方法，包括增加植物中OsMADS18樣多肽或其同源物的活性，所述OsMADS18樣多肽或其同源物為(i)單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化擬I型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)，除了基序第二位和笫四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)絲酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/o的序列同一性.有利地，實(shí)施^L據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生產(chǎn)率增加、特別是種子產(chǎn)率增加的植物。文中所述術(shù)語"增加的產(chǎn)率"用M示任意一種或多種下列M的增加，每個(gè)都相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物而言(i)植物一個(gè)或多個(gè)部分，特別是地上(可>)部分增加的生物量(重量)或^T其它可^部分增加的生物量；(ii)增加的種子產(chǎn)率，這包括種子生物量(種子重量)的增加，并且其可以是每^Mi抹或單粒種子基礎(chǔ)上的種子重量增加或者每公頃或每英畝種子重量的增加；(iii)增加的每個(gè)圃錐花序的花(小穗floret)的數(shù)量，其表達(dá)為飽滿種子數(shù)占初期(primary)圃錐花序的比率；(iv)增加的(飽滿)種子數(shù)量；(v)增加的種子充實(shí)率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100);(vi)增加的種子大小，這也可影響種子的組成；(vii)增加的種子體積，這也可影響種子的組成(例如，油、蛋白質(zhì)和糖類含量的增加以及組成的變化)；(viii)增加的種子面積；(ix)增加的種子長度；(x)增加的種子寬度；(x)增加的種子周長；(xi)增加的收獲指數(shù)，其表達(dá)為可收獲部分如種子的產(chǎn)率與總生物量的比率；和(xii)增加的千粒重(TKW)，這通過計(jì)數(shù)飽滿種子數(shù)量和它們的總重量外推得到。TKW增加可來自于種子大小和/或種子重量的增加，并且還可以來自胚大小和/或胚乳大小的增加。以谷物為例，產(chǎn)率增加可以^^現(xiàn)為下列一種或多種情況每乂>頃或每英畝植物數(shù)量的增加、每^L^^穗數(shù)量的增加、行數(shù)、行粒數(shù)、粒重量、千粒重、^!長^/直徑等的增加。以稻為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為下列一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的增加每4S項(xiàng)或每英畝的植物數(shù)量、每^i抹的圃錐M數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的花數(shù)、種子充實(shí)率的增加、千粒重的增加等。產(chǎn)率的增加也可以導(dǎo)致改變的構(gòu)造，或可以作為改變的構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。M優(yōu)選的方面，實(shí)施本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有增加的種子產(chǎn)率的植物.因此，本發(fā)明提供了增加植物種子產(chǎn)率的方法，該方法包括增加植物中OsMADS18樣多肽或其同源物的活性.由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，相對(duì)于相應(yīng)野生型植物在其生命周期相應(yīng)階段的生"]U1率而言，這些植物可能呈現(xiàn)增加的生"!Ut率(至少在其部分生命周期中)，增加的生長速率可以是對(duì)植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特異性的，或者可以基本上遍及整林植物，具有增加生長速率的植物可以呈現(xiàn)出早期開花.生長速率的增加可以出現(xiàn)在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段，或者出現(xiàn)在^4Ui整個(gè)植物生命周期的過程中.在植物生命周期的早期階段，生&逸率的增長可以表現(xiàn)為增強(qiáng)的活力.生長速率的增加可以改變植物的^周期，使植物能夠比其他可能的情況更晚播種和/或更快jML如果生長速率充分增加，可以允許播種同種植物物種更多的種子(例如完全在一個(gè)常規(guī)的生長期內(nèi)，播種和收獲稻類植物、接著播種和收獲更多的稻類植物).類似的，如果生長速率充分地增加，可能允許播種不同植物物種更多的種子(例如播種和收獲稻類植物，隨后，例如，播種和任選的收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適合的植物)。在一些作物植物的情況下也可能從同一根莖收獲增加的次數(shù).改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(這是由于(比方說在一年中)任何特定植物可以生長和收獲次數(shù)的增加).與野生型對(duì)應(yīng)物相比，生長速率的增加還能夠在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)榉N植農(nóng)作物的地域限制通常由種植時(shí)(早季)或^時(shí)(晚季)不利的環(huán)境條件所決定。如果縮短收獲周期，可以避免這類不利條件?？梢酝ㄟ^來自生長曲線的多種M確定生長速率，這類M可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大大小的50V。所需時(shí)間)和T-卯(植物達(dá)到其最大大小90%所需時(shí)間)等等.執(zhí)行本發(fā)明的方法賦予植物增加的生長速率.因此，本發(fā)明提供了增加植物產(chǎn)率的方法，該方法包括增加植物中OsMADS18樣多肽或其同源物的活性。無"^植物處于無脅迫條件下，或植物相對(duì)于對(duì)照/野生型植物暴露于多種脅迫下，都發(fā)生產(chǎn)率和/或生"^il率的增加。通常植物通過更加緩慢的生長來應(yīng)^觸的脅迫。在重M迫條件下，植物甚至可以完4^降止生長.另一方面，輕^迫在中定義為當(dāng)植物接觸時(shí)不導(dǎo)致植物完4^止生長喪失重新開始生長能力的任何脅迫，由于朝4t方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的JOl,栽培的作物植物常常不會(huì)遇到重度脅迫。因此，由輕M迫誘導(dǎo)的受損的生長通常成為農(nóng)業(yè)中不期望的因素.輕M迫是植物可能接觸的典型脅迫.這些脅迫可以是植物接觸的日常生物的和/或非生物的(環(huán)境的)脅迫。典型的非生物的或環(huán)境的脅迫包括由反常的熱或冷/冰凍溫度產(chǎn)生的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水).化學(xué)物質(zhì)也可以引起非生物脅迫。生物的脅迫一M由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫.實(shí)施本發(fā)明的方法可以在任何植物中有利地實(shí)現(xiàn)上述產(chǎn)率的增加.本文所用術(shù)語"植物"包含整,物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官，其中上述每一個(gè)都包含目的基因/核酸。術(shù)語"植物"也包含植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣其中上述每一個(gè)都包含目的基因/核酸。在本發(fā)明方法中尤其有用的植物包括所有屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的植物，尤其是包括選自下列清單的飼料或飼料莢果、觀賞植物、食品作物、樹木或灌木的單子葉和雙子葉植物，其中包括金合歡屬物種04cflciVxs/少.)、槭樹屬物種(^c"印;.)、獼猴桃屬物種(J"/"W/flspp.)、七葉樹屬物種(j然c"/MSs/i/i.)、新西蘭貝殼杉(^容"^&做欲a/Zs)、J/始i'fla挑ara、三色桫移(y4/sc;pMfl加'co/w)、須芒草屬物種(^"^p，"s/3;p.)、落花生屬物種(Jr"cA/s卿)、檳榔(/4m"c她cA")、4ste//fl/rflg/Yi"s、黃芘04sfrflgfl/"sdcer)、丑a汰i^eap/iif"(/iiga、樺木屬物種(丑e似/a卿.)、蕓莒屬物種(5/Yi柳'cfl卿.)、^41(toig"/mi砂加朋ir始fl)、a/r!'ca"a、紫鉚(5"加/w"toa)、CWa6ayii"'朋sa、朱纓花屬物種(Ca戰(zhàn)a"dra卿)、^Came//f'awW"sfs)、美人慕(CVmnfliW!'ca)、辣椒屬物種(C7fl/wic"鵬s/i/;.)、決明屬物種(CVwsws/i/;.)、多巨瓣豆(Cew^veiwfl/w6esceiw)、木瓜屬物種(C"/rfle"o挑e/essp/;.)、肉桂(Ci/1wam0加11mcassiVi)、小果咖叫》(C"ojQTefl"ra6/ca)、Co/o/y/ros/^/Tifffm/ffopawe、變異小冠花香瓜屬物種(C"c"油卿.)、柏木屬物種(CM戸s愿卿.)、C^a幼e"欲仿她、木梨(Q^wif'fl06/卵ga)、圃球柳杉(03^to挑ef/flya/w附'ca)、香茅屬物種挑o"etori'a、大葉骨碎^卜(Z)flVfl戰(zhàn)fl必var/cato)、山馬埴屬物種(Z)es附o必M附卿.)、迪卡蘭(D/由鄉(xiāng)'fl罕a卿a)、Z)狄故r印，/t柳p/ecte/fs、Di》c/ea卿、鐮扁豆屬物種(Z)oft'c/wss/i;p.)、Z)(m^om'm加reW"m、錐穗稗(五cA/woc/rto"p戸加iVte斷、Brar^s/^"糝子(臉"sf""wflca"")、五rflgres治卿.、刺桐屬物種(勿細(xì)VMi卿.)、桉屬物種(五"co/，"s卿.)、五"c/e"sc似挑戸i'、金茅v戰(zhàn)仍fl)、蕎麥屬物種CFago/yr"挑s/^.)、費(fèi)約羅se"麵'朋fl)、草雷屬物種CF/vigflWfl卿.)、千斤^L^物種(F/柳iVigiVi卿)、y'avfl"/ca、(/f>*/V//fls//n陸地棉((？<^/'附A/rsMft/挑)、4M^屬物種(Gy^v///^1卿.)、("幼o(hù)"rt/aco/柳/w附"、巖黃茂屬物種(/Te辦w鵬卿.)、牛鞭草v"/gfl")、場(chǎng)/wrr/i側(cè)'flnz/fl、小連翅(場(chǎng)/^i'CMWiemr,M挑)、jEfy/^W/ie//"必ss0/Mto、白花庭藍(lán)(/"必gcMVfCfl/7iflrto)、秀尾屬物種(Zr/s)、丄e/^"/r/re"flp戶/iyb&V、胡枝子屬物種(丄邵e妝fl卿.)、萵苣屬物種(丄欲"cfl卿.)、/encoce/iAfl/fl、'挑/|/狄、丄她if附6fl/"es/i'、百l^^屬物種(lo加s卿.)、硬皮豆(Mwro一附flfojc///flre)、蘋果屬物種(她/iw卿.)、Affl"幼Wesc/e"to、紫苜蓿(Mwft'cflgosa/i'va)、水杉(Meto呵wo/"g(K/^ortwAoiVfes)、大藏(J/"sflsa/7/eff加nf)、煙草屬物種(A7ctfrf"/iM加s/)>/i.)、驢食草屬物種(0朋AijcA/s卿.)、Or/f她印"s卿"稻屬物種(Oij加卿.)、4^洲歡翼豆(/V/top/wnifffa/Wcfl"nwi)、吝lLC草屬物種(i^/iifisc似加spp.)、跨梨(/Vf鄉(xiāng)grafe/,)、碧冬癡屬物種OPC""/fl卿.)、菜豆屬物種(尸to幼/"ss/);p.)、棋挪竹(/%?！?&ca"ar/cifs/s)、/^w附i'n鵬coo&fVm"附、石械屬物種CP/toft7iwspp.)、白云杉(尸/ceflg/fl"cfl)、松屬物種(/V""ssp/>.)、翁豆(戶/s"附s"A'v"m)、新西蘭羅漢松(戶0i/0car/y"s、i^g^wiflf^riVi/Zec炎/i'、尸唯wwrt/r/7Vis《iiar卿a、楊屬物種(i^pu/MS卿.)、牧豆樹(iV做—sdwcrfln'a)、花旗松(i^ei/rfCs"gflwfgdg7)、/Vcr0/061'M加ste//a-u/if、西洋梨(i^r"sai加wiiiwis)、櫟屬物種(0Mefcnssp/;.)、及/rap/r/0/eps/snw6e//afa、美味棒花棕(及Ao/witos0^iysa/)iV/a)、及A"s"n似/e/fsis、歐*洲醋粟giYws/flVi)、茶蒸子屬物種(及幼es印/>.)、洋槐(及oW"w戸e"1/0acacZa)、薔藪屬物種(及卵fls/j;p.)、懸鉤子屬物種(及u6iiss/少.)、柳屬物種CSflZix:s/，/;.)、ScAj^flc/yri'M附sa"gKiVte"挑、金木^(5ciVwto/wX^verft'ci7/flto)、；l匕美紅杉(i9e《KoiVzsei/^rw>e/fs)、巨杉(Se《M0/a</e/fi/roifg/ga/f紐unf)、兩色蜀黍(5^1^m附Wco/<w)、、菱菜屬物種他i7fflciVi卿.)、/F附6"V1加、5V訪wwsfl/印ecM柳Vfes、鄉(xiāng)/仍flW幼o(hù)s/(挑船、葫,茶屬物種(7WeAflgl.s/J^)、落羽杉(7Vmw/iw挑必幼c/w附)、阿拉伯黃背草(r/re附^/"加VHirfra)、車軸草屬物種(7>1>//"挑sp;i.)、小麥屬物種(7>故011明p.)、異葉鐵杉(rs"gflZretefY/i/y;//fl)、越桔屬物種(FJacc/"/w挑s/i/;.)、野豌豆屬物種(K/ci'fls/);p.)、葡萄(K!'risw7i(/*yi)、錐穗'沃森花(^iatecm/fl/jTa/iwV/flto)、馬蹄蓮(Za/i紐descA/aaC/t/—ai)、玉蜀黍(Zea扁")、莧屬植物(amaranth)、洋薊(artichoke)、天門冬屬(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘藍(lán)(i簡(jiǎn)se/"戶Mte)、甘藍(lán)、蕓苔(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芽菜、羽衣甘藍(lán)(collardgreens)、亞麻、無頭甘藍(lán)(kale)、兵豆屬(lentil)、油菜籽油菜(oilseedrape)、秋葵(okra)、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻類等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物為諸如大豆、向日葵、蕓苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草的作物植物。進(jìn)一步優(yōu)選地，植物為單子葉植物，例如甘蔗。更加優(yōu)選地，植物是谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱.可以通過提高多肽的水平來增加OsMADS18樣多肽的活性。OsMADS18mRNA水平也可以提高。^^選地，當(dāng)OsMADS18樣多肽水平?jīng)]有改變，或者甚至當(dāng)OsMADS18樣多肽水平降低的時(shí)候，其活性也可以增加.這種情況出現(xiàn)在多肽固有特性發(fā)生改變的時(shí)候，例如，通過制備比野生型多肽更具活性的突變體形式.本文定義的術(shù)語"OsMADS18樣多肽或其同源物"指這樣的多肽(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化擬I型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18>除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)絲酸取代且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/o的序列同一性?；蛑械娜〈梢允潜Ｊ厝〈?，但并不限于保守取代。保守M酸取代可以替換上述基序中任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，包括第2位和笫4位上分別為脯氨酸和色氨酸所占據(jù)的殘基。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
可以容易地獲得保守取M.下表給出保守M酸取代的實(shí)例。表l:保守M酸取代的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>可以用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的常規(guī)技術(shù)容易地鑒定"OsMADS18樣多肽或其同源物"。例如，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可以在體外或體內(nèi)容易地確定DNA結(jié)合活性和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，DNA結(jié)合活性體外測(cè)定的實(shí)例包括使用已知MADS盒DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的凝膠阻滯分析(West等(1998)NuclAcidRes26(23):5277-87)，或酵母單雜交測(cè)定(yeastone-hybridassays>蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用體外測(cè)定的實(shí)例是酵母雙雜交分析(Fields和Song(1989)Nature340:245-6)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以簡(jiǎn)單地通過進(jìn)行比對(duì)并在多肽C末端搜尋該基序，而容易地鑒定上文所定義的基序(SEQIDNO:18).類似地，可以通過序列比對(duì)容易地確定多肽與SEQIDNO:2所^的^JJ^否具有至少65%的同一性，序列比對(duì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，這類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA.GAP應(yīng)用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443>453)來尋找兩個(gè)完整序列的比對(duì)，4吏匹配數(shù)最大化和空位數(shù)最小化。BLAST算法(Altschul等(1990)JMolBiol215:403-10)計(jì)算序列同一性的百分比，并對(duì)兩序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件可從生物技術(shù)信息國家中心公開地獲得。例如，在其蛋白最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)并與SEQIDNO:2所代表的氨基酸序列具有至少65%同一性的OsMADS18同源物，可利用如下ClustalW多重序列比對(duì)算法(版本1.83)容易地進(jìn)行鑒定http:〃clustalw.genomejD/sit-bin/nDh-clustalw，使用如下兩兩比對(duì)參數(shù)K-tuple(字長)大小為l，窗口大小為5，空位罰分為4，頂對(duì)角線(topdiagonal)數(shù)為5，并使用百分比的記分方法。為術(shù)語"OsMADS18樣多肽或其同源物"所涵蓋的植物來源多肽的實(shí)例包括(參見表2):來自稻的OsMADS18AF091458(SEQIDNO:2)，來自玉蜀黍的ZMM28(或m28)AJ430695(SEQIDNO:4)，來自黑麥草(Z^/i"挑/we"we)的MADS3AY198328(SEQIDNO:6)，來自大麥的m3AJ249143(SEQIDNO:8)。ZMM28樣蛋白是由如下數(shù)個(gè)甘蔗CSflcc^ra附oj^ciVffliww)重疊EST的重疊群推斷出的CA285442(SEQIDNO:9)、CA200888(SEQIDNO:10)、CA247266(SEQIDNO:11)、CA282968(SEQIDNO:12)和CA29卯卯(SEQIDNO:13)l甘蔗蛋白(SEQIDNO:15)是由通過比對(duì)5個(gè)不同的EST所獲得的共有序列(SEQIDNO:14)推斷出來的。SEQIDNO:16為第二個(gè)核苷酸共有序列，與SEQIDNO:14相比，自ATG起578bp的位置上具有一個(gè)核苷酸改變(G至T)。多肽SEQIDNO:17是由SEQIDNO:16推斷出來的，并且除了蛋白質(zhì)第193位的一個(gè)M酸改變(V193G)，與SEQIDNO:15完全相同.表2:OsMADS18樣單子葉植物直系同源物(orthologue)的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>應(yīng)該理解的是，歸入"OsMADS18樣多肽或其同源物"定義的序列不限于由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17所代表的序列，而是任何符合以下標(biāo)準(zhǔn)的多肽(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝II型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活'決且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18>除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)狄酸取代且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/。的序列同一性，均適用于本發(fā)明的方法，并用于獲得相對(duì)于相應(yīng)野生型植物產(chǎn)率增加的植物。編碼OsMADS18樣多肽或其同源物的核酸可以是任何天然的或合成的核酸。因此，本文定義的術(shù)語"OsMADS18樣核^/基因"是編碼如上定義的OsMADS18樣多肽或其同源物的任何核^/基因。OsMADS18樣核酸的實(shí)例包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQH)NO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16中任一所錄的那些序列.OsMADS18樣核^/基因及其變體可適于實(shí)施本發(fā)明的方法。OsMADS18樣核^/基因基因雜交的核酸。""本文定義的術(shù)語"部分"指包含至少747個(gè)核苷酸的(OsMADS18樣核l基因)DNA片段，該部分編碼至少249個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，優(yōu)選還包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)為(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝n型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18>除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代且(iv)與SEQH)NO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/。的序列同一性?？梢?，例如，通過在OsMADS18樣核酸中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)缺失來制備部分。部分可以以分離的形式應(yīng)用，或者它們可以與其它編碼(或非編碼)序列融合以，例如，產(chǎn)生組合多種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其它編碼序列融合時(shí)，翻譯產(chǎn)生的多肽產(chǎn)物可以大于預(yù)測(cè)的OsMADS18樣片斷。優(yōu)選地，功能部分是由以下任一所代^^核酸的部分SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16.另一OsMADS18樣核^/基因變體是在降低的嚴(yán)^件下，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，能夠與上文所定義的OsMADS18樣核酸/基因雜交的核酸，該雜交序列編碼的多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，優(yōu)選還包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)為(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化擬I型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)，除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/。的序列同一性。除了具有上述特征，優(yōu)選雜交序列能與由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16任一所代表的核酸序列雜交，或與上文所定義的任何上述序列的部分雜交.本文定義的術(shù)語"雜交"指其中基本同源互補(bǔ)的核酸序列彼此退火的過程。雜交過程能夠完全在溶液中發(fā)生，即互補(bǔ)的核酸都在溶液中.雜交過程也可以在如下情況下進(jìn)行，即互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)上，如磁珠、瓊脂糖珠或任何其它樹脂上.此外，雜交過程也可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定在固相支持物如辨酸纖維素或尼龍膜上，或者如用照相平板印刷固定在例如^玻璃支持物上(后者稱為核酸陣列或微陣列，或稱為核酸芯片)。為了使雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈，和/或除去單鏈核酸中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成等務(wù)降的影響'在核酸雜交實(shí)驗(yàn)如Southern和Northern雜交的情況中，"嚴(yán)格雜交條件"和"嚴(yán)格雜交洗滌IHf"依賴于序列，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。熟練的技術(shù)人員知曉可以在雜交和洗滌過程中改變的多種參數(shù)，從而保持或者改變嚴(yán)格條件。Tm是在確定的離子強(qiáng)度和pH值下，50%的耙序列與完全匹配的探針雜交的溫度。Tm依賴于溶液糾和探針的絲組成及長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。在低于Tjil6'C到32'C獲得最大雜交率。在雜交溶液中存在一價(jià)陽離子會(huì)減少兩核酸鏈之間的靜電排斥作用，從而促進(jìn)雜合體形成；當(dāng)鈉濃度高達(dá)0.41\1時(shí)，這一作用明顯，每個(gè)百分點(diǎn)的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度降低0.6到0.7匸，加入50。/。甲酰胺能夠使雜交在30到45'C完成，盡管這將降低雜交率。v5^t錯(cuò)配降低雜交率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對(duì)于大的探針，每個(gè)百分點(diǎn)M錯(cuò)配使Tjt下降約1C。Tjt可以用依賴于雜合體類型的下列方程式計(jì)算1、DNA-DNA雜合體(Meinkoth和Wahl，Anal.股ochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5X:+16.6xlog[Na+la+0.41xo/0[G/Cb-500x[L^1-0.61x%甲酰胺2、DNA-RNA或RNA-RNA雜合體Tm=79.8+18.5(1ogw[NaY)+0.58(o/oG/C"+11.8(%G/Cb)2-820/Lc3、寡DNA或寡RNAd雜合體<20個(gè)核苷酸Tm=2(/n)20-35個(gè)核苷酸Tm-22+1.46(fn)fl或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽離子，但是^t0.01-0.4M范圍內(nèi)精確.》僅對(duì)于在30%到75%范圍內(nèi)的％GC精確。1=雙鏈體的>5^|"長度，"寡，寡核苷酸；/n,引物的有效長度-2x(G/C數(shù))+(A/T數(shù)).3斧對(duì)于每1%甲^，T^值降低約0.6到0.7'C，而6M尿素的存在可使Tm值降低約30'C,雜交特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)。為了除去非特異雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。這類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃M低、洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性就越高。洗滌條件通常在等于或低于雜交嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。一般地，如上設(shè)置適用于核酸雜交測(cè)定或基因擴(kuò)增檢測(cè)操作的嚴(yán)^件。也可以選擇更高或更低的嚴(yán)格性條件。通常，對(duì)于在確定的離子強(qiáng)度和pH值下的特定序列，選擇比熱解鏈溫度(Tm)低50'C的低嚴(yán)M件。中等嚴(yán)^Hf溫度比Tj氐20t:，高嚴(yán)^件溫度比TJ氐10X:。例如，嚴(yán);fM^件是至少像如條件A-L—樣嚴(yán)格；降低的嚴(yán)4MHf是至少像如糾M-R—樣嚴(yán)格?？梢酝ㄟ^許多已知技術(shù)中的任一來控制非特異性結(jié)合，所述技術(shù)諸如，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉膜，在雜交緩沖液中添加異源RNA、DNA和SDS，和用RNA酶處理。在以下43中列出雜交和洗滌務(wù)泮的實(shí)例。表3:雜交和洗滌務(wù)泮的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>t"雜合體長度"是雜交核酸的預(yù)期長度.當(dāng)已知序列的核酸雜交時(shí)，可以通過比對(duì)序列及鑒別本文所述的保守區(qū)域來確定雜合體長度.t在雜交和洗滌緩沖液中，可以用SSPE(lxSSPE是0.15MNaC1，10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成后洗滌15分鐘。雜交和洗滌可以另外地包括5xDenhardt's試劑、0.5-1.0%SDS、100ng/ml變性片段化的鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉和高達(dá)50%的甲酰胺。*Tb-Tr:對(duì)于預(yù)期長度小于50個(gè)^^對(duì)的雜合體，雜交溫度應(yīng)該比雜合體的解鏈溫度Tm低5-10。C;根據(jù)上述方程式確定Tm。*本發(fā)明還包括以PNA或修飾的核酸代賴一或多個(gè)DNA或RNA雜交配偶體。為了定義嚴(yán)格性水平，可以參考Sambrook等人(2001)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約，或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。OsMADS18樣核酸或其變體可以來自任何天然或人工的來源。核l基因或其變體可以分離自微生物來源，如酵母或真菌，或分離自植物、藻類或動(dòng)物(包括人類)來源.可以通過仔細(xì)的人為IMt在組成和/或基因組環(huán)境上修飾所述核酸的天然形式。優(yōu)選植物來源的核酸，無論來源于同一植物物種(例如對(duì)于其被引入的物種而言)或來源于不同植物物種?？梢詮膯巫尤~物種，優(yōu)選從禾;Mt(戶做cefle),更優(yōu)選從稻分離所述核酸.更優(yōu)選地，A^中分離的OsMADS18樣核^4示為SEQIDNO:1，而OsMADS18樣氨基酸序列表示為SEQIDNO:2.可以通過引入遺傳修飾(優(yōu)選在OsMADS18樣基因座)提高OsMADS18樣多肽或其同源物的活性.本文所定義的基因座意指基因組區(qū)，其包括目的基因和編碼區(qū)上游或下游的10kb.可以通過任一(或多個(gè))如下方法引入遺傳修飾T-DNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化、同源重組或通過在植物中引入和表iiife碼OsMADS18樣多肽或其同源物的核酸。引入遺傳修飾之后的步驟是選擇活性增加的OsMADS18樣多肽，其活性的增加使植物產(chǎn)率增加.T-DNA激活標(biāo)記(Hayashi等人Science(199"1350-1353)包括將通常含有啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA插入在目的基因的基因組區(qū)或基因編碼區(qū)上游或下游10kb，從而在構(gòu)型上使啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)靶向基因的表達(dá)。通常天然啟動(dòng)子對(duì)乾基因表達(dá)的調(diào)控被破壞，基因由新引入的啟動(dòng)子控制。啟動(dòng)子一般包含于T-DNA中。例如，通過農(nóng)桿菌附近的基因it^達(dá)。得到的轉(zhuǎn)基因植物由于引入的啟動(dòng)子附i^因it^達(dá)而表現(xiàn)出顯性表型。引入的啟動(dòng)子可以是任意能夠在所希望的生物體內(nèi)(在本案中是植物)指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，組成型的、組織偏好的、細(xì)胞類型偏好的和誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子都適用于T-DNA激活。也可以通過TILLING(定向誘導(dǎo)的基因組局部突變)技術(shù)將遺傳修飾引入OsMADS18基因座。這是一種誘變技術(shù)，其用于產(chǎn)生、鑒定和分離誘變的能呈現(xiàn)OsMADS18樣活性的OsMADS18樣核酸變體。TILLING還允許選#^攜帶此種突變變體的植物。這些突變變體甚至可能比其天然形式基因呈現(xiàn)更高的OsMADS18樣活性。TILLING結(jié)合了高密度誘變和高通量篩選方法。TILLING—般遵循的步驟有(a)EMS誘變(RedeiGP和KonczC，(1992)/"MethodsinArabidopsisResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ編輯Singapore,WorldScientificPublishingCo,第l"2頁；Feldmann等，(1994)ZMeyerowitzEM,SomervilleCR編輯，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，第137-172頁；Lightner和Caspar,(1998)/wJMartinez國Zapater,JSalinas編輯,MethodsonMolecularBiology,Vol.82.HumanaPress,Totowa，NJ，第91-104頁)；(b)DNA制備和個(gè)體合并；(c)目的區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以形成雜雙鏈體；(e)DHPLC，其中庫中存在的雜雙鏈體會(huì)在色譜圖上檢測(cè)到額外的峰；(f)突變個(gè)體的鑒定；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測(cè)序，TILLING的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的(McCallum等(2002)NatBiotechnol18:455-457，由Stemple綜述(2004)NatRevGenet5(2):145-50)。定點(diǎn)誘變可用于產(chǎn)生OsMADS18樣核酸的變體.可以通過幾種方法來完成定點(diǎn)資變，最常見的是基于PCR的方法(currentprotocolsinmolecularbiology.Wiley編輯http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。定向進(jìn)化也可以用于產(chǎn)生OsMADS18樣核酸的變朱這包括DNA改組的重復(fù)，繼之以適當(dāng)篩選和/或選擇，以產(chǎn)生編碼具有修"飾的生物活性多肽的OsMADS18樣核酸或其變體的變體(Castle等(2004)Science304(5674):1151-4;美國專利5,811,238和6,395,547)。TDNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化是能產(chǎn)生新的等位基因和OsMADS18樣變體的技術(shù)的實(shí)例。同源重組允許向基因組中的指定選擇位置引入所選的核酸。同源重組是生物科學(xué)中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，其用于低等有機(jī)體如酵母或小立碗蘚(physcomitrella)。在植物中執(zhí)行同源重組的方法已經(jīng)不僅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBOJ.9(10):3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotechnol15(2):132-8)。所靶向的核酸(其可能是上文中定義的OsMADS18樣核酸或其變體)不需把向OsMADS18樣基因座，但是可以被引入例如高表達(dá)的區(qū)域，所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替換內(nèi)源基因或額外引入到內(nèi)源基因中.根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，通過在植物中引入和表達(dá)編碼OsMADS18樣多肽或其同源物的核酸，可以提高植物的產(chǎn)率.引入遺傳修飾(在本案中不需引入OsMADS18樣基因座中)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼OsMADS18樣多肽或其同源物的核酸，上述OsMADS18樣多踐其同源物為(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝II型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)M酸中^^有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18>除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)#^酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65%的序列同一仗欲引入植物的核酸可以是全長的核酸或者是上述定義的部分或雜交序列。蛋白質(zhì)的"同源物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，其相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有M酸取代、缺失和/或插入，并且具有與其衍生自的未^務(wù)飾形式蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)活性和功能活性。為了產(chǎn)生這樣的同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸由具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破oc螺旋結(jié)構(gòu)或P片層結(jié)構(gòu)的傾向)的其它氨基酸所替換。保守取代表是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的(例如見Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和上id^1)。術(shù)語"同源物"也包括兩種具體形式的同源物，其包括直系同源(orthologous)序列和旁系同源(paralogous)序列，其涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語"旁系同源"涉M物種基因組內(nèi)部的基因復(fù)制產(chǎn)生的旁系基因。術(shù)語"直系同源"涉及由于物種形成產(chǎn)生的不同有機(jī)體中的同源基因。例如，可以通過所謂的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在單子葉植物種中的直系同源物。這可以通過4吏用查詢序列(例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫，如可在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行一次blast而實(shí)現(xiàn).當(dāng)從核苷酸開始時(shí)可使用BLASTn或tBLASTX(利用標(biāo)準(zhǔn)缺省值)，而當(dāng)從蛋白質(zhì)開始時(shí)可使用BLASTP或TBLASTN(利用標(biāo)準(zhǔn)缺省值)。Blast結(jié)果可以過濾。接著使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的序列針對(duì)查詢序列源自的相同生物體的序列進(jìn)行反向blast(二次blast)(在查詢序列為SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所，則二次blast將會(huì)針對(duì)稻序列)。然后比較第一次和笫二次blast的結(jié)果.如果二次blast中得分靠前的命中亊件來自查詢序列源自的相同物種，則找到了旁系同源物.得分靠前的命中事件使之E值低的命中事件.E值越低，得絲具有顯著性(或者換句話說，偶然發(fā)現(xiàn)此命中事件的幾率越低)。E值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的.在大家族的情況下可以使用ClustalW，繼之以鄰近連接樹來輔助相關(guān)基因的聚類可視4b，以鑒定直系同源物和旁系同源物.同源物可以是蛋白質(zhì)"取代變體"的形式，即在M酸序列中至少有一個(gè)殘基被除去，并在這一位置插入不同的殘基。M酸取代通常是單個(gè)殘基的取代，但是視施加于多肽的功能性限制而定也可能;1^簇取代；插入通常在1到10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)。優(yōu)選地，M酸取代包括保守的絲酸取代。同源物也可以是蛋白質(zhì)的"插入變體"的形式，即在蛋白質(zhì)的預(yù)定位置引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及單個(gè)或多個(gè)M酸的內(nèi)部序列插入。一般，^氨基酸序列內(nèi)部的插入將小于^&或氛基端的融合，數(shù)量級(jí)在約1到10個(gè)殘基。^J^羧基端融合構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白質(zhì)、(組氨酸)6標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、蛋白質(zhì)A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag'100表位、c誦myc表位、FLAG⑧^^位、lacZ、CMP(鉤調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白質(zhì)C表位和VSV表位，蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的同源物特征在于從蛋白質(zhì)中除去一個(gè)或多可通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作容易地得到蛋白質(zhì)的氨基酸變體。用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的DNA序列操作方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的.例如，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟知在DNA預(yù)定位置產(chǎn)生取代突變的技術(shù)，其包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)、QuickChange定點(diǎn)誘變(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其它定點(diǎn)誘變方法.OsMADS18樣多肽或其同源物可以是衍生物."衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與天然產(chǎn)生形式的蛋白質(zhì)，例如SEQIDNO:2所代表的M酸序列相比，其可以包括取代、缺失或添加的天然的和非天然產(chǎn)生的#<*酸殘基.蛋白質(zhì)的"衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與天然產(chǎn)生形式多肽的M酸序列相比，其可以包括天然產(chǎn)生的改變的、糖基化、S^化的氨基酸^或非天然產(chǎn)生的氨基酸戎基。衍生物還可以包括相對(duì)于其源自的M酸序列的一個(gè)或多個(gè)非M酸取代基，例如共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合于M酸序列的凈艮告分子或其它配體，例如與之結(jié)合有利于衍生物檢測(cè)的報(bào)告分子，以^U目對(duì)于天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)的M^列而言非天然產(chǎn)生的氛基酸殘基。OsMADS18樣多肽或其同源物可能由OsMADS18樣核^酸/基因的選擇性剪接變體編碼。本文所用的術(shù)語"選擇性剪接變體"包括其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已被切除、替換或添加的核酸序列變體，或者其中內(nèi)含子已被縮短或增長的核酸序列變體。這樣的變體保持了蛋白質(zhì)的生物活性，這可以通過有選擇地保留蛋白質(zhì)的功能性區(qū)段來實(shí)現(xiàn)。這樣的剪接變體可以是天然的或人工的。產(chǎn)生這類剪接變體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。優(yōu)選的剪接變體是SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16所代表核酸的剪接變體。更優(yōu)選的剪接變體所編碼的多肽包含至少如下特征(i)和(H)^優(yōu)選還包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)為(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝II型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)^*酸中含有糾LPPWMLRT(SEQIDNO:18)，除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65%的序列同一性.同源物還可以由編碼OsMADS18樣多肽或其同源物的核酸的等位基因變體所編碼，優(yōu)選SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16所代表核酸的等位基因變體.更優(yōu)選由等位基因變體編碼的多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，優(yōu)選還包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)為(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝II型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18),除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65%的序列同一性.等位基因變體天然存在，并且這些天然等位基因的用途包含于本發(fā)明的方法中。等位基因變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及小型插A7缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體天然存在的多態(tài)性品系中形成最大的一組序列變體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，OsMADS18樣核酸或其變體的表達(dá)有所增強(qiáng)或增加。獲得增強(qiáng)或增加的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)有充分的記錄，其包括，例如由適當(dāng)?shù)膯?dòng)子驅(qū)動(dòng)的過表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用。可以將用作啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入非異源形式多核苷酸的適當(dāng)位置(一般是上游)，從而上調(diào)OsMADS18樣核酸或其變體的表達(dá)。例如，可以通過突變、缺失和/或取代，體內(nèi)地改變內(nèi)源啟動(dòng)子(見Kmiec，美國專利No.5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868)，或者將分離的啟動(dòng)子在本發(fā)明基因的適當(dāng)方向和距離引入植物細(xì)胞中，從而控制基因的表達(dá).如果期望多M達(dá)，通常要在多肽編碼區(qū)域的3，末端納入多聚腺苦酸化區(qū)域。多聚腺苷酸化區(qū)域可以源自天然基因、多種其它植物基因或T-DNA。例如，加入的3，末端序列可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或備選地源自其它植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其它真核基因.也可以在5，非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列中加入內(nèi)含子序列，來增加在^t中累積的成熟信使的數(shù)量.已顯示，在植物和動(dòng)物表^建體的轉(zhuǎn)錄單位中納入的可剪接內(nèi)含子均可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平增加高達(dá)1000倍的基因表達(dá)，Buchman和Berg，Mol.Cellbiol.8:4395-4405(1988);Callis等，GenesDev.1:1183-1200(1987)。通常這種內(nèi)含子被放置在轉(zhuǎn)錄單位5，末端附近時(shí)，其增強(qiáng)基因表達(dá)的作用達(dá)到最大.玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子l、2和6，Bronzed內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域/iH^的，通常見TheMaizeHandbook^第116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer,N.Y.(1994).本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和栽體，以促進(jìn)用于本發(fā)明方法中的核^列的引入和/或表達(dá)，以產(chǎn)生相對(duì)于相應(yīng)野生型植物產(chǎn)率增加的植物。因此，提供的基因構(gòu)建體含有(i)OsMADS18樣核酸或其變體；(ii)一個(gè)或多個(gè)能驅(qū)動(dòng)(i)中核酸序列表達(dá)的控制序列；和任選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入可商購的、適合于轉(zhuǎn)化it^植物并在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的栽體中，使用含有目的序列(即OsMADS18樣核酸或其變體)的載體轉(zhuǎn)化植物。將目的序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)控制序列(至少連接于啟動(dòng)子)。術(shù)語"調(diào)控元件"、"控制序列"和"啟動(dòng)子"在本文中都可交換的使用，從廣義上是指能夠影響其連接序列表達(dá)的調(diào)控核酸序列。上述術(shù)語包括源自典型真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括具有或沒有CCAAT盒序列的TATA盒，其對(duì)于精確的轉(zhuǎn)錄起始是必需的)，以及另外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，其通過應(yīng)答發(fā)育刺激和/或外部刺激或以組織特異的方式改變基因表達(dá)。該術(shù)語還包括了經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在此情況下可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語"調(diào)控元件"也包含合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或增強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官中核酸分子的表達(dá)。本文所用的術(shù)語"有效連接"指在啟動(dòng)子序列和目的基因之間的功能性連接，以使啟動(dòng)子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的，OsMADS18樣核酸或其變體有效的連接于早期實(shí)尖分生組織(shootapicalmeristem)啟動(dòng)子.如本文所定義的"早期莖尖分生組織啟動(dòng)子"是指M形胚階段到幼苗階段在莖尖分生組織中轉(zhuǎn)錄性激活的啟動(dòng)子；這些階段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。優(yōu)選早期莖尖分生組織啟動(dòng)子是OSH1啟動(dòng)子等(來自稻；SEQIDNO:22(Matsuoka等，(1993)PlantCell5:1039-1048;Sato等，(1996)ProcNatlAcadSciUSA93(15):8117-22),應(yīng)當(dāng)清楚，本發(fā)明的應(yīng)用并不局限于SEQIDNO:1所代表的OsMADS18樣核酸，而且本發(fā)明的應(yīng)用也并不局限于受OSH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OsMADS18樣核酸的表達(dá).其他早期莖尖分生組織啟動(dòng)子的實(shí)例如下表4所示。它們?yōu)閬碜耘韵低椿蛑毕低瑯踊虻腒NOX家族1類同源盒(homeobox)的成員。應(yīng)當(dāng)理解下文列表并不是詳盡無遺的。表4:早期莖尖分生組織啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>任選的，還可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列.術(shù)語"終止子"包括控制序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，傳遞信號(hào)引發(fā)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的3，加工和多聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)子.^域技術(shù)人員將知道適合用于進(jìn)行本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子的序列.這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所7i^或者可以容易地獲得.復(fù)制起點(diǎn)序列。'一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型i傳元件(如質(zhì)?；蛘沉７肿?在細(xì)菌細(xì)胞中維持時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl,遺傳構(gòu)建體可以任選地包括可選擇的標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語"可選擇的標(biāo)記基因"包括賦予細(xì)J^型的任意基因，該基因在細(xì)胞中的表達(dá)有利于鑒定和/或選擇經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可以選自帶有抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的代謝性狀或允許可視選擇?？蛇x擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptn，或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;或提供草甘膦抗性的aroA或gox)、或者提供代謝性狀的基因(例如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA)。視覺標(biāo)記基因?qū)е滦纬深伾?例如P-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、發(fā)光(例如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。本發(fā)明還包括由本發(fā)明方法可獲得的植物。本發(fā)明因此提供由本發(fā)明方法可獲得的植物，該植物中引入了OsMADS18樣核酸或其變體。本發(fā)明還提供產(chǎn)生相對(duì)于相應(yīng)野生型植物產(chǎn)率增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)OsMADS18樣核酸或其變體。更具體地，本發(fā)明提供產(chǎn)生相對(duì)于相應(yīng)野生型植物產(chǎn)率增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物、植物部分或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)OsMADS18樣核酸或其變體；和(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞?？梢詫⒑怂嶂苯右胫参锛?xì)胞或植物本身(包括引^織、器官或植物的任何其它部分)，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸引入植物.本文所指術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，不考慮轉(zhuǎn)移所用的方法，通過器官發(fā)生或者胚胎發(fā)生的能夠隨即克隆增殖的植物組織都可以使用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并從其再生整個(gè)植物.具體的組織選擇將因可提供和最適于轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆增殖系統(tǒng)而改變。示例性的把組織包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、存在的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，以及誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？梢詫⒍嗪塑账崴矔r(shí)的或穩(wěn)定的引入宿主細(xì)胞，并且可以，例如作為質(zhì)粒保持非整合的狀態(tài)。備選地，其可以整合^宿主基因組。得到的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以接著用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式再生為轉(zhuǎn)化的植物。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，可以使用幾種轉(zhuǎn)化方法的任一向適當(dāng)?shù)淖嫦燃?xì)胞引入目的基因。轉(zhuǎn)化方法包括用脂質(zhì)體、電穿孔、增強(qiáng)游離DNA攝取的化學(xué)品、直接向植物注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化和顯微投影(microprojection).方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等，(1882)Nature296，72-74;NegrutiuI.等，(1987)PlantMol.Biol.8:363-373);原生質(zhì)體的電穿孔法(ShillitoR.D.等，1985Bio/Technol3，1099-1102);植物材料的顯微注射(CrosswayA.等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA包被的粒子轟擊(KleinT.M.等，(1987)Nature327:70);(非整合的)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何通#桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生表達(dá)OsMADS18樣基因/核酸的轉(zhuǎn)基因稻的熟知方法，例如在任何以下文獻(xiàn)中描述的方法4S開的歐洲專利申請(qǐng)EP1198985AlAldemita和Hodges(Planta，199:612-617，1996);Chan等(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(PlantJ.6(2):271-282，1994)，其公開的內(nèi)容如同其陳述的4^P內(nèi)容那樣并入本文作為參考。至于谷物轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol.129(1):13-22，2002)中所述，其公開的內(nèi)容如同其陳述的^P內(nèi)容那樣并入本文作為參考.通常在轉(zhuǎn)化以后，選出存在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，所述標(biāo)記由與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，繼之將轉(zhuǎn)化的材料再生成整個(gè)植物.DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評(píng)估推定轉(zhuǎn)化的植物，例如用Southern分析評(píng)價(jià)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組組成。備選的或額外的，可用Northern和/或Western分析監(jiān)測(cè)新引入基因的表達(dá)水平，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如用克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如，笫一代(或Tl)轉(zhuǎn)化的植物可自交得到純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，T2植物進(jìn)一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆的轉(zhuǎn)化體(例如經(jīng)過轉(zhuǎn)化包含表達(dá)盒的所有細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的d^體(例如在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖嫁接到非轉(zhuǎn)化的接穗上)。本發(fā)明顯然t良由本文所述方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有植物的部分和其無性繁殖體。本發(fā)明還涵蓋由任意上述方法產(chǎn)生的初級(jí)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物的后代，所述后代的唯一要求是與本發(fā)明方法產(chǎn)生的親本呈現(xiàn)同樣的基因型和/或表型特性。本發(fā)明也包括含有分離的OsMADS18樣核酸或其變體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞4:植物細(xì)胞。本發(fā)明也延JL植物可收獲的部分，例如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和球莖。本發(fā)明還涉及由這樣的植物的可^部分衍生的產(chǎn)品，如干丸、干粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì).本發(fā)明還包括OsMADS18樣核酸或其變體的用途和OsMADS18樣多肽或其同源物的用途.一種這樣的用途涉及提高植物相對(duì)于野生型植物的產(chǎn)率，特別4一提高種子產(chǎn)率。產(chǎn)率的增加已在前文定義.可以在育種程序中使用OsMADS18樣核酸或其變體，或者OsMADS18樣多肽或其同源物，其中鑒定可以遣傳地連接于OsMADS18樣基因或其變體的DNA標(biāo)記，可以使用OsMADS18樣核^/基因或其變體,或者OsMADS18樣多肽或其同源物界定分子標(biāo)記.接著可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記在育種程序中使用，以選擇具有增加的產(chǎn)率的植物.例如，OsMADS18樣基因或其變體可以是由SEQD)NO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16中任一所代表的核酸。程序。這類育種程序有時(shí)需要使用，例如EMS誘變，通過植物誘變處理引入等位基因變體；備選的，此程序可以以收集無意產(chǎn)生的所謂"天然"起源的等位基因變體開始。然后通過例如PCR鑒定等位基因變體。！^是選擇步驟，用以選擇所討論序列的較好等位基因變體，所述等位基因變體賦予植物增加的產(chǎn)率。一般通過監(jiān)測(cè)含有所研究序列的不同等位基因變體植物的生長行為來進(jìn)行選擇，所述研究序列的不同等位基因變體是例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16中任一的不同等位基因變體?？梢栽跍厥一蛱锏刂斜O(jiān)測(cè)生長行為。更多任選的步驟包括，將經(jīng)鑒定含有較好等位基因變體的植物與另一植物雜交.例如，可使用這種方法產(chǎn)生感興^型特征的組合。OsMADS18樣核酸或其變體還可以作為探針，用于對(duì)為那些基因連鎖性狀的一部分并作為其標(biāo)志物的基因進(jìn)行遺傳和物理的作圖.這樣的信息可以在植物育種中使用，以得到具有所期望表型的品系，OsMADS18樣核酸或其變體的這類應(yīng)用僅需要長至少15個(gè)核苷酸的核酸序列。OsMADS18樣核酸或其變體也可以用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記?？捎肙sMADS18樣核酸或其變體探測(cè)限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual).隨后使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)對(duì)產(chǎn)生的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖謙.此外，可以使用核酸在含有一組個(gè)體的P艮制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA中探測(cè)Sou也ern印跡，所述一組個(gè)體為代表明確的遣傳雜交的親本和子代的一組個(gè)體.記錄DNA多態(tài)性的分離并用于計(jì)算在先前用此*獲得的遺傳困諮中OsMADS18樣核酸或其變體的位置(Botstehi等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中使用的植物基因衍生探針的產(chǎn)生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中，眾多出版物中描述過用上述方法或其變通形式對(duì)特定cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近親同基因系和其它個(gè)體組作圖，這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。核酸探針也可以用于物理作圖(即在物理圖鐠上安置序列；見Hoheisel等In:Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁，及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)t盡管目前FISH作圖的方法傾向用于大的克隆(幾個(gè)到幾百個(gè)KB;見Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏性的提高允許在FISH作圖中應(yīng)用較短的探針。用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.CHn.Med11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核苷^/f申反應(yīng)(Sokolov(19卯)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作困(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807).為實(shí)施這些方法，使用核酸序列i殳計(jì)和產(chǎn)生用于擴(kuò)增及JL或引物延伸反應(yīng)的引物對(duì)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的。使用基于PCR的遺傳作圖的方法，可能需要鑒定跨越相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親;Ma司DNA序列的差異.然而，這對(duì)作圖方法通常不是必要的.根據(jù)本發(fā)明的方法得到如前所述產(chǎn)率提高的植物，產(chǎn)率提高的性狀還可以組合其它經(jīng)濟(jì)上有利的性狀，如進(jìn)一步提高產(chǎn)率的性狀、對(duì)多種脅迫的耐受性、改良多種構(gòu)造特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀.現(xiàn)參考以下附圖描述本發(fā)明，其中圖1顯示了MIKCMADS盒轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)域特征。MADS結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的^JL末端，并編碼DNA結(jié)合和二聚化功能。保守的K結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)二聚化。I和C結(jié)構(gòu)域次保守。C結(jié)構(gòu)域能夠參與轉(zhuǎn)錄激活或參與形成高級(jí)MADS多聚體(來自Jack(2001)PlantMolecBiol46:515-520)。圖2顯示了數(shù)個(gè)SQUAMOSA進(jìn)化枝MADS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的多重比對(duì)，使用的是基于修飾的ClustalW算法(InforMax,Bethesda，MD，http:〃www.informaxinc.com)的VNTIAlignX多重比對(duì)程序，采用缺省i更置，空位開放罰分為IO，空位延伸罰分為0.05。在比對(duì)中，MADS結(jié)構(gòu)域的SQUAMOSA特異性^J^p才I^承包括MADS共有序歹'JoSQUAMOSA進(jìn)化枝中的兩條雙子葉植物亞進(jìn)化枝顯示為雙子葉植物API進(jìn)化枝和雙子葉植物FUL進(jìn)化枝.單子葉植物序列根據(jù)蛋白質(zhì)C末端的保守基序被進(jìn)一步再分為兩個(gè)亞枝LPPWMLRT和LPPWMLSH，粗體加^示。圖3代表無根鄰近連接樹(unrootedneighbourjoiningtree),是利用ClustalW1.83采用缺省值通過序列比對(duì)得到的。兩個(gè)主要的群，包括單子葉植物和雙子葉植物蛋白質(zhì)，各自可進(jìn)一步進(jìn)行分組，對(duì)于雙子葉植物而言是API和FUL亞進(jìn)化枝，而對(duì)于單子葉植物是C末端包含的基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)和LPPWMLSH(SEQIDNO:19).所用多肷序列的來源、描述和登錄號(hào)如下表所示.<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>圖4顯示了雙元載體p064a用于在稻中表達(dá)處于OSH1啟動(dòng)子(內(nèi)參PRO0200)控制之下的稻OsMADS18樣蛋白(內(nèi)參CDS2787)。圖5詳述了用于執(zhí)行本發(fā)明方法的序列的實(shí)例。實(shí)施例現(xiàn)參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅意在舉例說明.DNA操作除非另外說明，重組DNA技術(shù)根據(jù)描述于(Sambrook(2001)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約)或者Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols第一巻和第二巻的標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行.植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfase(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版。《滋辨h差厲義鏖使用稻幼苗cDNA庫(Invitrogen，Paisley,UK)作為;^板通過PCR擴(kuò)增稻OsMADS18樣基因(CDS1522)。從幼苗提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，將cDNA克隆進(jìn)入pCMVSport6.0。該庫平均插入大小為1.6kb，并且原始克隆數(shù)的數(shù)量級(jí)在1.67x107cfu,在6x101Qcfu/ml的第一次擴(kuò)增之后，確定原始滴度為3.34><10、&/1111。提取質(zhì)粒之后，將200ng模板用于50piPCR混合物中.PCR擴(kuò)增所用引物包括Gateway重組的AttB位點(diǎn)，為prm05821(SEQIDNO:20;正義，起始密碼子為粗體，AttBl位點(diǎn)為斜體5，-GGG04Gr7TCT^C4扁^4GC4GGCTTCACAATGGGGAGAGGGCCG3，)和prm05822(SEQIDNO:21;反義，互補(bǔ)的，終止密碼子為粗體，AttB2位點(diǎn)為斜體5，GGGG4CC4CnTCa04^4GCrGGG7TGAGTGGAGTGACGTTTGAGA3')。在標(biāo)準(zhǔn)M下使用HifiTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR。同樣用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化849bp(包括attB位點(diǎn))的PCR片段。接著進(jìn)行Gateway過程的第一步，BP反應(yīng)，在此期間將PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生Gateway術(shù)語所稱的"ii7v(entry)克隆"，p05838。作為Gateway⑧技術(shù)一部分的質(zhì)粒pDONR201購自Invitrogen。接著，將iiX克隆p05838與用于稻轉(zhuǎn)化的指定載體p05294—起被用于LR反應(yīng)。此栽體在T-DNA邊界內(nèi)包含以下部分作為功能性元件植物可選擇的標(biāo)記；可篩選的標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到1克隆中的目的序列進(jìn)行體內(nèi)重組LR的Gateway表達(dá)盒，用于早期早期莖尖分生組織表達(dá)的稻OSH1啟動(dòng)子(PR00129)(SEQIDNO:22)在此Gateway盒的上游(Matsuoka等，PlantCell51993，1039-1048).LR重組步驟之后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體p0643(圖4)轉(zhuǎn)化iiA農(nóng)桿菌菌林LBA4044，1^轉(zhuǎn)化itA稻類植物。使轉(zhuǎn)化的稻類植物生長，隨后檢測(cè)實(shí)施例3中描述的參數(shù)。豸滋辨3.'^于潛OSfl7啟^f控步/之T付OsM4Z)57S邦譯餘及錄耒大約產(chǎn)生了15到20個(gè)獨(dú)立的T0稻類轉(zhuǎn)化體.初級(jí)轉(zhuǎn)化體由組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室生長并收獲T1種子。5個(gè)事件得以保留，其中TlM生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3:l分離，通過監(jiān)測(cè)可視標(biāo)記的表達(dá)，在每一亊件中選出大約10個(gè)含轉(zhuǎn)基因(雜合子和純合子)的Tl幼苗，和大約10個(gè)缺少轉(zhuǎn)基因(無效合子)的Tl幼苗.4個(gè)Tl事件進(jìn)一步在T2代中進(jìn)樹價(jià)，遵循與Tl代相同的評(píng)價(jià)方法，但每個(gè)事件使用更多的個(gè)體.統(tǒng)計(jì)分析F-檢驗(yàn)使用雙因子ANOVA(變異分析)作為植物表型特性整體評(píng)估的統(tǒng)計(jì)模型.在由本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植物中，對(duì)所有測(cè)量J^t進(jìn)行F檢驗(yàn).進(jìn)行F檢驗(yàn)iWr查所有轉(zhuǎn)化事件中基因的效應(yīng)，并a^基因的整體效果，亦稱為整體基因效應(yīng).真實(shí)的整體基因效應(yīng)顯著性的閾值設(shè)定為F檢驗(yàn)的5。/。概率水平。顯著性F檢驗(yàn)值證明基因效應(yīng)，其意味著不僅僅^因的存在或位置引起表型的差異。種子相關(guān)參數(shù)的測(cè)量成熟的原代圓錐花序被收獲、包裝、標(biāo)記條形碼，然后在37'C烘箱中干燥三天。然后敲打圓錐花序并對(duì)所有種子進(jìn)行收集和計(jì)數(shù)。用吹風(fēng)裝置將飽滿的殼與空殼分離。丟棄空殼，并再次計(jì)數(shù)剩余的部分。飽滿的殼在分析天平上稱重。通過計(jì)數(shù)分離步驟之后剩余的飽滿殼數(shù)來確定飽滿種子數(shù)。通過稱量從植物收獲的全部飽滿的殼來測(cè)量總的種子產(chǎn)率。通過計(jì)數(shù)自植物收獲的谷殼數(shù)來測(cè)量每個(gè)植林的種子總數(shù).千粒重(TKW)從已計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重外推得到。利用定制裝置來測(cè)量個(gè)體種子^(包括寬度、長度、面積、重量)，所述裝置由兩個(gè)主要組件稱重裝置和成像裝置構(gòu)成，連接于用于圖像分析的軟件，下面的結(jié)^(表5和表6)顯示了Tl和T2代F檢驗(yàn)的p值。也顯示了轉(zhuǎn)基因和相應(yīng)無效合子之間的百分比差異.Tl和T2代的TKW的都顯著增加(表5和表6)。與此平行，觀察到個(gè)體種子面積的增加，促成了所觀察到的TKW增加.種子面積的增加歸因于個(gè)體種子長度的顯著增加(表5和表6),因?yàn)閭€(gè)體種子寬度未顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)，表6:Tl代的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>權(quán)利要求1.增加相對(duì)于相應(yīng)野生型植物的產(chǎn)率的方法，包括增加植物中OsMADS18樣多肽或其同源物的活性，和任選地選擇產(chǎn)率增加的植物，其中所述OsMADS18樣多肽(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝II型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端的最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO18)，除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)氨基酸取代；且(iv)與SEQIDNO2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中通過優(yōu)選地在編碼OsMADS18樣多肽或其同源物的基因座引入遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)所述增加的活性.3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中通過定點(diǎn)誘變、同源重組、定向進(jìn)化、TILLING和T-DNA激活中任一實(shí)現(xiàn)所述遺傳修飾.4.增加相對(duì)于相應(yīng)野生型植物的產(chǎn)率的方法，包括在植物中引入和表達(dá)核酸或其變體，所述核酸編碼OsMADS18樣多肽，所述OsMADS18樣多肽(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化紀(jì)I型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端的最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)，除了基序笫二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/o的序列同一性.5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述變體是OsMADS18樣核酸的部分或者能與OsMADS18樣核酸雜交的序列，其中所述部分或雜交序列或其互補(bǔ)物編碼單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化^型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子，所述轉(zhuǎn)錄因子具有DNA和蛋白結(jié)合活性，并且(i)在其蛋白C末端的最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)，除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)氨基酸取代；和/或(ii)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/。的序列同一性。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所述OsMADS18樣核酸或其變體在植物中過表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述OsMADS18樣核酸或其變體是植物來源的，優(yōu)選來自單子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選來自禾本科，更加優(yōu)選核酸來自稻。8.根據(jù)權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)的方法，其中所述變體編碼SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白的直系同源物或旁系同源物.9.根據(jù)權(quán)利要求4到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述OsMADS18樣核酸或其變體有效地連接于早期莖尖分生組織啟動(dòng)子.10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述早期莖尖分生組織啟動(dòng)子是OSHl啟動(dòng)子.11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)率選自以下的任一項(xiàng)或多項(xiàng)(i)增加的千粒重(TKW);(ii)增加的種子大??；(iii)增加的種子體積；(iv)增加的種子面積；(v)增加的種子長度和(vi)增加的種子生物量.12.可根據(jù)權(quán)利要求l到ll中任一項(xiàng)的方法獲得的植物.13.構(gòu)建體，含有(a)編碼OsMADS18樣多肽或其變體的核酸，所述OsMADS18樣多肽(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化紀(jì)I型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端的最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18)，除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/。的序列同一性；和(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；和任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13的構(gòu)建體，其中所述控制序列是早期莖尖分生組織啟動(dòng)子。15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述早期莖尖分生組織啟動(dòng)子是OSHl啟動(dòng)子。16.根據(jù)權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述OSHl啟動(dòng)子如SEQIDNO:22所示。17.根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，用于根據(jù)權(quán)利要求4到11中任一項(xiàng)的方法，18.由根據(jù)權(quán)利要求13到17中任一項(xiàng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。19.產(chǎn)生相對(duì)于相應(yīng)野生型植物產(chǎn)率增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(a)在植物、植物部分或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)編碼如下OsMADS18樣多肽或其變體的核酸(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化^tlI型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端的最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18),除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65。/。的序列同一性；(b)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。20.產(chǎn)率增加的轉(zhuǎn)基因植物，其通過將核酸或其變體引入所述植物產(chǎn)生，所述核酸編碼如下OsMADS18樣多肽(i)為單子葉植物SQUAMOSA進(jìn)化枝II型MADS盒轉(zhuǎn)錄因子；且(ii)具有DNA和蛋白結(jié)合活性；且(iii)在其蛋白C末端的最后15個(gè)氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQIDNO:18),除了基序第二位和第四位分別為脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置處允許一個(gè)M酸取代；且(iv)與SEQIDNO:2的OsMADS18蛋白具有至少65y。的序列同一性。21.根據(jù)權(quán)利要求12、18或20的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。22.根據(jù)權(quán)利要求12、18、20或21中任一項(xiàng)的植物的可收獲部分。23.根據(jù)權(quán)利要求22的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子.24.從根據(jù)權(quán)利要求21的植物衍生的產(chǎn)品，和/或從根據(jù)權(quán)利要求22或23的可收獲部分衍生的產(chǎn)品。25.OsMADS18樣核酸/基因或其變體或OsMADS18樣多肽或其同源物在提高產(chǎn)率、特別是種子產(chǎn)率中的用途.26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述種子產(chǎn)率包括以下的一項(xiàng)或多項(xiàng)增加的TKW、增加的種子大小、增加的種子體積、增加的種子面積、增加的種子長度和增加的種子生物量.27.OsMADS18樣核酸/基因或其變體或OsMADS18樣多肽或其同源物作為分子標(biāo)記的用途.全文摘要本發(fā)明涉及通過增加植物中OsMADS18樣多肽或其同源物的活性來增加植物產(chǎn)率的方法，一種這樣的方法包括向植物中引入OsMADS18樣核酸或其變體。本發(fā)明也涉及已向其中引入了OsMADS18樣核酸或其變體的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)率。本發(fā)明也涉及在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。文檔編號(hào)A01H5/10GK101107364SQ200580047177公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2005年11月24日優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日發(fā)明者V·弗蘭卡德申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司