專利名稱：氨基酸含量提高的轉(zhuǎn)基因玉米種子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文公開(kāi)的是氨基酸水平提高的轉(zhuǎn)基因玉米種子、用以產(chǎn)生基因抑制性反義RNA環(huán)的重組DNA構(gòu)建物以及制備和使用表達(dá)基因抑制性反義RNA環(huán)的這種構(gòu)建物和轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景某些植物與其他植物相比特定氨基酸水平較低，例如玉米的賴氨酸、甲硫氨酸和色氨酸水平較低。為提高轉(zhuǎn)基因植物的氨基酸水平的努力包括以比天然基因更高的水平表達(dá)編碼氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)的重組DNA。一種這樣的用以在玉米中產(chǎn)生水平提供的賴氨酸的基因是美國(guó)專利第5,288,300號(hào)(Glassman等)、第6,459,019號(hào)(Falco等)和專利申請(qǐng)公開(kāi)U.S.2003/0056242 A1中公開(kāi)的細(xì)菌二氫吡啶二羧酸合酶基因，所述專利每一個(gè)通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。一種使氨基酸水平更高的設(shè)想包括抑制編碼氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的基因。
基因抑制包括任何公知的用以抑制基因轉(zhuǎn)錄或?qū)?yīng)于該基因的mRNA的積累以防止轉(zhuǎn)錄物被翻譯成蛋白質(zhì)的方法。更具體的說(shuō)，美國(guó)專利第5,107,065號(hào)(Shewmaker等)和美國(guó)專利第5,759,829號(hào)(Shewmaker等)公開(kāi)了通過(guò)插入帶反義方向DNA的重組DNA構(gòu)建物，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的基因表達(dá)來(lái)介導(dǎo)的基因抑制。如Redenbaugh等在“Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr SavrTMTomato”，CRC Press，Inc.(1992)中所公開(kāi)，用這種反義方向DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化以抑制基因的植物可包含排列成反向重復(fù)序列的整合DNA，所述反向重復(fù)序列通過(guò)土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化將幾個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)共插入到植物中而產(chǎn)生。反向重復(fù)序列插入物可包含部分或全部T-DNA，例如含有完全或部分反義構(gòu)建物的反向重復(fù)序列。當(dāng)轉(zhuǎn)化構(gòu)建物是簡(jiǎn)單的反義DNA構(gòu)建物時(shí)，對(duì)包含反向重復(fù)序列元件的插入DNA的篩選可提高鑒定對(duì)基因沉默有效的轉(zhuǎn)化事件的效率。
美國(guó)專利第5,283,184號(hào)(Jorgensen等)和美國(guó)專利第5,231,020號(hào)(Jorgensen等)公開(kāi)了通過(guò)插入帶有義方向DNA的重組DNA構(gòu)建物，調(diào)節(jié)植物的基因抑制來(lái)引發(fā)的基因抑制。如Jorgensen等，Mol.Gen.Genet.，207471-477(1987)所公開(kāi)，在用這種有義構(gòu)建物通過(guò)土壤桿菌轉(zhuǎn)化的植物中，提供基因抑制的插入T-DNA主要組織成反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。另參見(jiàn)Stam等，The Plant Journal，1263-82(1997)和De Buck等，Plant Mol.Biol.46 433-445(2001)，他們采用分離研究支持了Jorgensen的發(fā)現(xiàn)，即在許多事件中基因沉默是通過(guò)多聚轉(zhuǎn)基因T-DNA來(lái)介導(dǎo)的，其中T-DNA排列成反向重復(fù)序列。當(dāng)用簡(jiǎn)單的有義方向DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化時(shí)，對(duì)包含反向重復(fù)序列元件的插入DNA的篩選可提高基因沉默的效率。
例如Shewmaker等在美國(guó)專利第5,107,065號(hào)中所公開(kāi)，基因沉默也可通過(guò)用兩個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄單位從有義和反義方向DNA轉(zhuǎn)錄RNA來(lái)實(shí)現(xiàn)，在所述專利的實(shí)施例1中制備了帶有義和反義aroA基因的二元載體。國(guó)際申請(qǐng)WO 99/53050(Waterhouse等)中公開(kāi)了類似的構(gòu)建物。另參見(jiàn)美國(guó)專利第6,326,193號(hào)，在該專利中，基因?qū)駾NA有效連接到相反(opposing)啟動(dòng)子。
通過(guò)提供能夠產(chǎn)生可在其至少一部分長(zhǎng)度上形成雙鏈RNA的RNA的轉(zhuǎn)化構(gòu)建物，可在植物中實(shí)現(xiàn)基因抑制。EP 0426195 A1(Goldbach等)公開(kāi)了植物的基因抑制，在該專利中，供轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾RNA的重組DNA構(gòu)建物為轉(zhuǎn)基因植物提供了對(duì)煙草斑萎病病毒的抗性。另參見(jiàn)Sijen等，The Plant Cell，第8卷，第2277-2294頁(yè)(1996)，其公開(kāi)了將攜有豇豆花葉病毒基因反向重復(fù)序列(有義序列緊接著反義序列)的構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)基因植物中來(lái)介導(dǎo)病毒抗性。另參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)98/53083(Grierson等)和相關(guān)的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0175965 A1(Lowe等)，它們公開(kāi)了用包含5′UTR的反向重復(fù)序列和緊接著的基因編碼序列的雙鏈RNA構(gòu)建物進(jìn)行基因抑制。國(guó)際公開(kāi)WO 99/53050(Waterhouse等)和國(guó)際公開(kāi)WO 99/49029(Graham等)中也公開(kāi)了通過(guò)靶基因的雙鏈RNA用以在植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因抑制的構(gòu)建物。另參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2002/0048814 A1(Oeller)，在該專利中，DNA構(gòu)建物被轉(zhuǎn)錄成帶形成發(fā)夾的poly(T)-poly(A)尾的有義或反義RNA。另參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0018993 A1(Gutterson等)，在該專利中，有義或反義DNA之后緊跟著NOS基因3′非翻譯區(qū)的反向重復(fù)序列。另參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0036197 A1(Glassman等)，在該專利中，用以減少靶mRNA表達(dá)的RNA包含與靶mRNA有同源性的部分和帶與內(nèi)源RNA不相關(guān)的互補(bǔ)RNA區(qū)域的部分。
美國(guó)專利第6,506,559號(hào)(Fire等)公開(kāi)了在植物中產(chǎn)生dsRNA以抑制例如以植物為生的線蟲(chóng)中的基因表達(dá)。美國(guó)專利申請(qǐng)10/465,800(Fillatti)公開(kāi)了供用于植物的多基因抑制載體。
轉(zhuǎn)錄抑制如啟動(dòng)子反式抑制可通過(guò)表達(dá)包含啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子有效連接到靶基因啟動(dòng)子DNA的反向重復(fù)序列。Mette等，The EMBO Journal，第18卷，第241-148頁(yè)，(1999)和Mette等，The EMBO Journal，第19卷，第5194-5201頁(yè)-148，(2000)公開(kāi)了可用于這種由啟動(dòng)子反式抑制介導(dǎo)的基因抑制的構(gòu)建物，這兩篇文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
公開(kāi)了在植物中進(jìn)行基因抑制的材料和方法的所有上述專利、專利申請(qǐng)和國(guó)際公開(kāi)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
發(fā)明概述本發(fā)明提供氨基酸含量提高的轉(zhuǎn)基因玉米種子。這種種仁中氨基酸含量提高的轉(zhuǎn)基因玉米在其基因組中整合了重組DNA構(gòu)建物，所述重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄出能抑制氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的反義方向RNA。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述種子具有用以抑制賴氨酸分解代謝途徑的蛋白質(zhì)(例如預(yù)聚物(pre-polymer)賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶)的編碼基因的重組DNA。供抑制的有用蛋白質(zhì)靶標(biāo)是酮戊二酸還原酶。也可通過(guò)同時(shí)表達(dá)氨基酸合成途徑中的基因，例如編碼賴氨酸合成途徑中的二氫吡啶二羧酸合酶的外源基因，來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸含量的增加。因此，本發(fā)明還提供種子和方法，其中重組DNA用以抑制氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)，并表達(dá)(例如過(guò)量表達(dá))氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供通過(guò)在發(fā)育的玉米種子中表達(dá)重組DNA構(gòu)建物，來(lái)提高玉米種仁中的氨基酸含量(例如賴氨酸含量)的方法，所述重組DNA構(gòu)建物用以抑制氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并任選表達(dá)氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建物包含來(lái)自被靶向抑制的基因的反義方向DNA元件。所述構(gòu)建物還包含轉(zhuǎn)錄與至少一部分反義方向RNA互補(bǔ)的RNA的有義方向DNA。在本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建物的一個(gè)優(yōu)選方面，有義方向DNA元件比反義方向DNA元件要短，有義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與反義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的最5′部分互補(bǔ)。這種轉(zhuǎn)錄的RNA形成用以抑制氨基酸分解代謝途徑中的至少一個(gè)靶蛋白質(zhì)基因的反義方向RNA環(huán)。
重組DNA構(gòu)建物包含與被轉(zhuǎn)錄成反義方向RNA(例如形成反義方向RNA環(huán)的反義方向RNA)的DNA有效連接的啟動(dòng)子(例如種子特異性啟動(dòng)子)。這種重組DNA可用于生產(chǎn)與對(duì)照玉米植物的子代種子相比氨基酸含量提高的玉米種子，所述對(duì)照玉米植物例如為野生型祖玉米植物或轉(zhuǎn)基因玉米植物的負(fù)分離子，其中氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)不被抑制。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，種子特異性啟動(dòng)子是胚芽特異性啟動(dòng)子或胚乳特異性啟動(dòng)子，重組DNA構(gòu)建物產(chǎn)生用以抑制賴氨酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)(例如賴氨酸酮戊二酸還原酶和/或酵母氨酸脫氫酶)的編碼基因的反義方向RNA。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在其基因組中進(jìn)一步整合了表達(dá)氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)(例如二氫吡啶二羧酸合酶)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因玉米中，氨基酸含量得以提高。因此，本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)特方面提供了使用重組DNA構(gòu)建物的種子和方法，所述重組DNA構(gòu)建物用以在植物中產(chǎn)生對(duì)賴氨酸酮戊二酸還原酶和/或酵母氨酸脫氫酶進(jìn)行基因抑制的反義方向RNA環(huán)，以及用以表達(dá)編碼二氫吡啶二羧酸合酶的外源基因。這種構(gòu)建物以5′至3′順序包含與反義方向DNA元件有效連接的種子特異性啟動(dòng)子元件、來(lái)自前體蛋白質(zhì)賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶的編碼基因的反義方向DNA元件和有義方向DNA元件。有義方向DNA元件比反義方向DNA要短，有義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與反義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的最5′區(qū)段互補(bǔ)。所述DNA元件轉(zhuǎn)錄成的RNA形成反義方向RNA環(huán)，用以抑制編碼賴氨酸酮戊二酸還原酶的天然基因的表達(dá)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是可在本發(fā)明中用以產(chǎn)生反義方向RNA環(huán)的重組DNA構(gòu)建物的示意圖。
圖2是說(shuō)明用本發(fā)明構(gòu)建物進(jìn)行的基因抑制的蛋白質(zhì)印跡分析。詳述SEQ ID NO1是用于轉(zhuǎn)錄RNA的重組DNA構(gòu)建物的核苷酸序列，所述RNA可形成用以抑制轉(zhuǎn)基因植物中一個(gè)或多個(gè)基因的反義方向RNA環(huán)。有關(guān)各元件的描述見(jiàn)表1。
本文所用的“互補(bǔ)”指由于允許C-G和A-T或A-U鍵合的比對(duì)核苷酸的互補(bǔ)性而能夠雜交的多核苷酸，例如DNA的有義鏈和反義鏈或者RNA的自身互補(bǔ)鏈。
本文所用的“載體”指能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA分子和/或另一個(gè)DNA區(qū)段可與其有效連接以使被連接區(qū)段得以復(fù)制的DNA分子。質(zhì)粒是代表性的載體。
本文所用的“轉(zhuǎn)基因”生物(例如植物或種子)是其基因組已通過(guò)整合包含外源遺傳物質(zhì)或天然遺傳物質(zhì)額外拷貝的重組DNA而加以改變的生物，例如通過(guò)轉(zhuǎn)化或重組所述生物或祖生物。轉(zhuǎn)基因植物包括衍生自轉(zhuǎn)化過(guò)程的原始植物的子代植物，包括將轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物或其他轉(zhuǎn)基因植物育種得到的子代。在本發(fā)明中具有特殊意義的莊稼植物包括但不限于玉米、大豆、棉花、卡諾拉(油菜)、小麥、水稻、向日葵、紅花和亞麻。其他有意義的作物包括生產(chǎn)蔬菜、水果、草和木的植物。
用于植物轉(zhuǎn)化的重組DNA構(gòu)建物用以在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生成環(huán)反義RNA基因抑制劑的重組DNA構(gòu)建物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備出來(lái)。通常，這種DNA構(gòu)建物最少包含在被靶向抑制的組織中有活性的啟動(dòng)子、其序列與被靶向抑制基因的核苷酸序列互補(bǔ)的可轉(zhuǎn)錄DNA元件以及轉(zhuǎn)錄終止子元件。被拷貝用于基因抑制構(gòu)建物中可轉(zhuǎn)錄DNA中的被靶向基因元件可為啟動(dòng)子元件、內(nèi)含子元件、外顯子元件、5’UTR元件或3’UTR元件。盡管認(rèn)為從被靶向抑制基因的序列拷貝的DNA其最小大小為約21或23個(gè)核苷酸，但優(yōu)選更大的核苷酸區(qū)段，例如最大達(dá)被靶向基因的全長(zhǎng)。DNA元件可包含基因的多個(gè)部分，例如與UTR、外顯子和內(nèi)含子的連續(xù)或分離基因元件互補(bǔ)的核苷酸。這種構(gòu)建物還可按需包含其他調(diào)節(jié)元件，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽、信號(hào)肽、選擇性標(biāo)記和可篩選標(biāo)記的DNA。為形成反義方向RNA環(huán)，互補(bǔ)的DNA元件宜不超過(guò)反義方向DNA元件的約二分之一長(zhǎng)度，常常不超過(guò)所述反義方向DNA元件的三分之一長(zhǎng)度，例如不超過(guò)所述反義方向DNA元件的四分之一長(zhǎng)度。各DNA元件組合在一起的總長(zhǎng)度可不同。例如，反義方向DNA元件可由500-5000個(gè)核苷酸組成，互補(bǔ)DNA元件可由50-500個(gè)核苷酸組成。
可設(shè)計(jì)反義轉(zhuǎn)錄單位，以抑制多個(gè)基因，其中所述DNA排列為兩個(gè)或更多個(gè)來(lái)自不同被靶向抑制基因的反義方向元件，其后是互補(bǔ)的有義方向元件，例如與至少最5′部分的反義元件互補(bǔ))。
圖1示意說(shuō)明了包含啟動(dòng)子元件、反義方向DNA元件(標(biāo)示為“a/sDNA”)、互補(bǔ)的有義方向DNA元件(標(biāo)示為“s DNA”)和提供聚腺苷酸化信號(hào)和位點(diǎn)的DNA(標(biāo)示為“polyA位點(diǎn)”)的重組DNA構(gòu)建物。所述DNA構(gòu)建物被轉(zhuǎn)錄成包含反義方向RNA區(qū)段和與反義方向RNA區(qū)段的最5′末端互補(bǔ)的互補(bǔ)RNA區(qū)段的RNA。反義RNA的5′和3′末端可自身雜交，形成能閉合成反義方向RNA環(huán)的雙鏈RNA區(qū)段。例如，如果被轉(zhuǎn)錄的反義方向DNA鏈的最5′末端的核苷酸序列是5′-CGGCATA---，則被轉(zhuǎn)錄的反向重復(fù)DNA鏈的最3′末端的序列將是---TATGCCG-3′，其可容易地從提供反義元件的源DNA克隆。有了這種序列，反義方向RNA環(huán)將從dsRNA區(qū)段的一側(cè)延伸，例如5′-GCCGUAU--------3′-CGGCAUA--------反義方向DNA及其自身互補(bǔ)DNA可為連續(xù)的，或被載體DNA所分開(kāi)，例如最長(zhǎng)約100個(gè)核苷酸左右的載體DNA分開(kāi)用于載體裝配的限制位點(diǎn)。
重組DNA構(gòu)建物可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的市售材料和方法來(lái)裝配。一種用以構(gòu)建轉(zhuǎn)化用DNA構(gòu)建物和載體的有用技術(shù)是GATEWAYTM克隆技術(shù)(可獲自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，美國(guó)加州)，該技術(shù)使用來(lái)自λ噬菌體載體構(gòu)建物的整合酶att系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶LR克隆反應(yīng)，而不是限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶。LR克隆反應(yīng)公開(kāi)于美國(guó)專利第5,888,732號(hào)和第6,277,608號(hào)，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2001283529、2001282319和20020007051，所有這些專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。同樣由Invitrogen提供的GATEWAYTM克隆技術(shù)操作說(shuō)明書還給出了有關(guān)將任何所需DNA常規(guī)克隆到包含可操作植物表達(dá)元件的載體中的簡(jiǎn)要指導(dǎo)。
另一種載體構(gòu)建方法采用Aslanidis，C.等Nucleic Acids Res.，18，6069-6074，1990和Rashtchian，A.等，Biochem.，206，91-97，1992所公開(kāi)的不依賴于連接反應(yīng)的克隆法，其中將帶單鏈5′和3′末端的DNA片斷連接到所需的載體中，然后可在體內(nèi)擴(kuò)增載體。
文獻(xiàn)中已描述了多種在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括存在于植物基因組中的啟動(dòng)子以及來(lái)自其他來(lái)源的啟動(dòng)子，包括根瘤土壤桿菌(Agrobacteriurn tumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)性質(zhì)粒上攜帶的胭脂氨酸合酶(nos)啟動(dòng)子和章魚(yú)氨酸合酶(ocs)啟動(dòng)子，花椰菜花葉病毒(caulimovirus)啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)或玄參花葉病毒啟動(dòng)子。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利第5,322,938和5,858,742號(hào)，其公開(kāi)了衍生自花椰菜花葉病毒(CaMV35S)的組成型啟動(dòng)子版本；美國(guó)專利第5,378,619號(hào)，其公開(kāi)了玄參花葉病毒(FMV)35S啟動(dòng)子；美國(guó)專利第5,420,034號(hào)，其公開(kāi)了油菜籽蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,437,217號(hào)，其公開(kāi)了玉米R(shí)S81啟動(dòng)子；美國(guó)專利第5,641,876號(hào)，其公開(kāi)了水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,426,446號(hào)，其公開(kāi)了玉米R(shí)S324啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,429,362號(hào)，其公開(kāi)了玉米PR-1啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,232,526號(hào)，其公開(kāi)了玉米A3啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,177,611號(hào)，其公開(kāi)了組成型玉米啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,433,252號(hào)，其公開(kāi)了玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,429,357號(hào)，其公開(kāi)了水稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子和內(nèi)含子；美國(guó)專利第5,837,848號(hào)，其公開(kāi)了根特異性啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,084,089號(hào)，其公開(kāi)了冷可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,294,714號(hào)，其公開(kāi)了光可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,140,078號(hào)，其公開(kāi)了鹽可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,252,138號(hào)，其公開(kāi)了病原體可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,175,060號(hào)，其公開(kāi)了磷缺乏可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；美國(guó)專利第6,635,806號(hào)，其公開(kāi)了coixin啟動(dòng)子；U.S.2002/0192813 A1，其公開(kāi)了可用于設(shè)計(jì)有效的植物表達(dá)載體的5′，3′元件和內(nèi)含子元件；U.S.2004/0216189 A1，其公開(kāi)了玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子和U.S.2004/0123347 A1，其公開(kāi)了水分虧缺可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所有這些專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這些和其他多種在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可供用于本發(fā)明的重組多核苷酸中，以便在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)所需的基因。
此外，可改變啟動(dòng)子，使其含有多個(gè)“增強(qiáng)子序列”，以幫助提高基因表達(dá)。這種增強(qiáng)子是本領(lǐng)域公知的。通過(guò)將增強(qiáng)子序列包含于這種構(gòu)建物中，可增強(qiáng)選定的蛋白質(zhì)的表達(dá)。這些增強(qiáng)子常見(jiàn)于在真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的5′，但?？刹迦氲骄幋a序列的上游(5′)或下游(3′)。在某些情況下，這些5′增強(qiáng)元件是內(nèi)含子。水稻肌動(dòng)蛋白1基因(參見(jiàn)美國(guó)專利第5,641,876號(hào))和水稻肌動(dòng)蛋白2基因的5′內(nèi)含子、玉米醇脫氫酶基因內(nèi)含子、玉米熱激蛋白70基因內(nèi)含子(美國(guó)專利第5,593,874號(hào))和玉米皺縮1基因作為增強(qiáng)子特別有用。
在本發(fā)明的其他方面，需要在植物種子組織中有足夠的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)種子組成的改進(jìn)。用于種子組成改進(jìn)的代表性啟動(dòng)子包括來(lái)自種子基因的啟動(dòng)子，如來(lái)自油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉米L3油質(zhì)蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)157-166)、球蛋白1(Belanger等(1991)Genetics 129863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)出處同上)和過(guò)氧化物氧還蛋白抗氧化劑(Perl)(Stacy等(1996)Plant Mol Biol.31(6)1205-1216)的基因。
根據(jù)本發(fā)明制備的重組DNA構(gòu)建物往往包括通常含有聚腺苷酸化信號(hào)和位點(diǎn)的3′元件，尤其是當(dāng)打算將重組DNA用于蛋白質(zhì)表達(dá)以及基因抑制時(shí)。公知的3′元件包括例如U.S.6,090,627(其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)所公開(kāi)的來(lái)自根瘤土壤桿菌基因如nos 3′、tml 3′、tmr 3′、tms 3′、ocs 3′、tr7 3′的3′元件；來(lái)自植物基因如小麥(Triticum aesevitum)熱激蛋白17(Hsp17 3′)基因、小麥遍在蛋白基因、小麥果糖-1，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脫氫酶基因和水稻β-微管蛋白基因的3′元件，所有這些植物基因均公開(kāi)于美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2002/0192813 A1(其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)；以及豌豆(Pisum sativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs 3′)；還有來(lái)自宿主植物當(dāng)中的基因的3′元件。
基因抑制性重組DNA構(gòu)建物也可與賦予其他具有農(nóng)學(xué)意義的性狀的DNA一起疊加(stack)，包括提供除草劑抗性或昆蟲(chóng)抗性的DNA，如用來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)的基因來(lái)提供對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)、coliopteran、同翅目昆蟲(chóng)、半翅目昆蟲(chóng)和其他昆蟲(chóng)的抗性。植物中對(duì)其抗性有用的除草劑包括草甘磷除草劑、膦絲菌素除草劑、oxynil除草劑、咪唑啉酮除草劑、二硝基苯胺除草劑、吡啶除草劑、磺酰脲除草劑、雙丙氨酰膦除草劑、磺胺除草劑和草銨膦除草劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)參考美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0106096 A1和2002/0112260 A1及美國(guó)專利第5,034,322號(hào)；第5,776,760號(hào)；第6,107,549號(hào)和第6,376,754號(hào)，能夠提供疊加性狀，對(duì)于昆蟲(chóng)/線蟲(chóng)/病毒抗性，參考美國(guó)專利第5,250,515號(hào)；第5,880,275號(hào)；第6,506,599號(hào)；第5,986,175號(hào)和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0150017 A1，以上所有專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
轉(zhuǎn)化方法-有多種用重組DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，它們可用于本發(fā)明中。兩種常用的植物轉(zhuǎn)化方法是土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。微粒轟擊方法闡述于美國(guó)專利第5,015,580號(hào)(大豆)；第5,550,318號(hào)(玉米)；第5,538,880號(hào)(玉米)；第5,914,451號(hào)(大豆)；第6,160,208號(hào)(玉米)；第6,399,861號(hào)(玉米)和第6,153,812號(hào)(小麥)，土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化描述于美國(guó)專利第5,159,135號(hào)(棉花)；第5,824,877號(hào)(大豆)；第5,591,616號(hào)(玉米)和第6,384,301號(hào)(大豆)，以上所有專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。對(duì)于基于根瘤土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，存在于轉(zhuǎn)化構(gòu)建物上的另外元件包括T-DNA左緣和右緣序列，用以促進(jìn)重組多核苷酸摻入到植物基因組中。
一般來(lái)說(shuō)，將重組DNA隨機(jī)(即在非特異性位置)引入到靶植物系的基因組中是有用的。在特殊的情況下，對(duì)重組DNA插入進(jìn)行導(dǎo)向以便實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性整合，例如以便取代基因組中的現(xiàn)有基因，以便使用植物基因組中的現(xiàn)有啟動(dòng)子，或者以便在已知對(duì)于基因表達(dá)有活性的預(yù)定位點(diǎn)插入重組多核苷酸，這是有用的。存在幾種已知使插入物有功能的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，包括美國(guó)專利第4,959,317號(hào)所公開(kāi)的cre-lox和美國(guó)專利第5,527,695號(hào)所公開(kāi)的FLP-FRT，所述兩個(gè)專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選在控制環(huán)境下在培養(yǎng)基上的組織培養(yǎng)物中實(shí)施?！芭囵B(yǎng)基”指用以在體外(即在完整活生物的外部)生長(zhǎng)細(xì)胞的多種營(yíng)養(yǎng)物混合物。受體細(xì)胞靶標(biāo)包括但不限于分生細(xì)胞、愈傷組織、未成熟胚芽和和配子細(xì)胞如小孢子、花粉、精子和卵細(xì)胞。設(shè)想可將任何可從中再生出能育植物的細(xì)胞用作受體細(xì)胞。愈傷組織可從組織來(lái)源引起，包括但不限于未成熟胚芽、幼苗頂端分生組織、小孢子等。能夠增殖成愈傷組織的細(xì)胞也是遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。用以產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)用轉(zhuǎn)化方法和材料，例如各種培養(yǎng)基和受體靶細(xì)胞、未成熟胚芽的轉(zhuǎn)化和隨后能育轉(zhuǎn)基因植物的再生，公開(kāi)于美國(guó)專利第6,194,636號(hào)和第6,232,526號(hào)，這兩個(gè)專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
轉(zhuǎn)基因植物種子可從能育轉(zhuǎn)基因植物收獲，并用來(lái)生長(zhǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物(包括雜交植物)的子代，以篩選農(nóng)學(xué)性狀增強(qiáng)的植物。除了直接用重組DNA轉(zhuǎn)化植物外，也可通過(guò)使具有重組DNA的第一植物與缺乏該DNA的第二植物雜交來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將重組DNA引入到易于轉(zhuǎn)化的第一植物系中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，后者可與第二植物系雜交，以將重組DNA漸滲到第二植物系中。帶有能使農(nóng)學(xué)性狀增強(qiáng)(例如產(chǎn)量提高)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物可與帶有能賦予別的性狀(例如除草劑抗性或害蟲(chóng)抗性)的其他重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物系雜交，以產(chǎn)生帶有能賦予兩種性狀的重組DNA的子代植物。通常，在這種針對(duì)組合性狀的育種中，供給附加性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雄性系，攜帶基礎(chǔ)性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雌性系。這種雜交的子代將分離，這樣有些植物將攜帶產(chǎn)生兩種親代性狀的DNA，有些將攜帶產(chǎn)生一種親代性狀的DNA；這種植物可通過(guò)與親代重組DNA有關(guān)的標(biāo)記來(lái)鑒定。可將攜帶產(chǎn)生兩種親代性狀的DNA的子代植物多次回交到雌性親代系，例如通常6-8代，以產(chǎn)生除具有另一種轉(zhuǎn)基因親代系的重組DNA外具有與一種原始轉(zhuǎn)基因親代系基本相同的基因型的子代植物。
在轉(zhuǎn)化的實(shí)施中，通常在任何一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中都只是將DNA引入到一小部分靶細(xì)胞中。用標(biāo)記基因來(lái)提供有效的鑒定系統(tǒng)，以鑒定出通過(guò)接受和整合轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建物到其基因組中而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供能賦予對(duì)選擇劑(如抗生素或除草劑)的抗性的選擇性標(biāo)記。本發(fā)明植物可對(duì)其有抗性的任何除草劑都是有用的選擇性標(biāo)記選擇劑?？蓪撛谵D(zhuǎn)化的細(xì)胞暴露于選擇劑。在存活細(xì)胞群體中將有這樣的細(xì)胞，通常其中整合有抗性賦予基因并以足夠的水平表達(dá)，以允許細(xì)胞存活?？蓪?duì)細(xì)胞作進(jìn)一步的測(cè)試，以確認(rèn)外源DNA的穩(wěn)定整合。常用的選擇性標(biāo)記基因包括賦予對(duì)抗生素如卡那霉素和巴龍霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和慶大霉素(aac3和aacC4)或者除草劑如草銨膦(bar或pat)和草甘磷(aroA或EPSPS)的抗性的基因。這種選擇性標(biāo)記的實(shí)例在美國(guó)專利第5,550,318號(hào)；第5,633,435號(hào)；第5,780,708號(hào)和第6,118,047號(hào)中有說(shuō)明，所有這些專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。也可采用提供目視鑒定轉(zhuǎn)化體的能力的可篩選標(biāo)記，例如表達(dá)有色或熒光蛋白質(zhì)如熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基因，或者表達(dá)已知有多種顯色底物的β-葡糖醛酸酶的基因或uidA基因(GUS)。
可在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)暴露于選擇劑而存活的細(xì)胞或者在篩選試驗(yàn)中被評(píng)為陽(yáng)性的細(xì)胞，并讓它們成熟為植物。將可發(fā)育的小植物轉(zhuǎn)移到植物生長(zhǎng)混合液(mix)中，在例如相對(duì)濕度約為85％、CO2600ppm、光照25-250微愛(ài)因斯坦m-2s-1的環(huán)境控制箱中鍛煉(harden)，然后再轉(zhuǎn)移到溫室或生長(zhǎng)箱中以待成熟。取決于起始的組織，鑒定出轉(zhuǎn)化體后，使植物再生約6周至10個(gè)月?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)植物育種方法對(duì)植物授粉以產(chǎn)生種子，例如轉(zhuǎn)基因玉米常用自花傳粉?？舍槍?duì)重組DNA的表達(dá)測(cè)試再生的轉(zhuǎn)化植物或其子代種子或植物，并針對(duì)是否存在農(nóng)學(xué)性狀增強(qiáng)進(jìn)行篩選。
轉(zhuǎn)基因植物和種子使本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因植物種子生長(zhǎng)，以產(chǎn)生與對(duì)照植物相比性狀增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。這種農(nóng)學(xué)性狀增強(qiáng)的植物的種子可通過(guò)篩選轉(zhuǎn)化植物或后代種子的增強(qiáng)性狀來(lái)鑒定。出于效率考慮，設(shè)計(jì)篩選方案，以評(píng)估包含重組DNA的多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物(事件)，例如2-20個(gè)或更多的轉(zhuǎn)基因事件的多個(gè)植物。
從本文提供的轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)基因植物顯示能導(dǎo)致產(chǎn)量增加的改進(jìn)農(nóng)學(xué)性狀或能使植物價(jià)值提高的其他性狀，所述植物價(jià)值包括例如種子質(zhì)量提高，如某些氨基酸(例如賴氨酸)水平提高。
許多可存活到能產(chǎn)生種子和后代植物的能育轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因事件可能不顯示增強(qiáng)的農(nóng)學(xué)性狀。有必要通過(guò)針對(duì)增強(qiáng)的性狀和對(duì)其他農(nóng)學(xué)性狀的最小影響評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物，來(lái)進(jìn)行篩選，以從按本文所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物群體中鑒定出農(nóng)學(xué)性狀增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。這些試驗(yàn)也可采取多種形式，包括但不限于檢測(cè)植物化學(xué)組成、生物量、生理特性和形態(tài)的變化的各種分析。
本發(fā)明的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了用以設(shè)計(jì)重組DNA構(gòu)建物、培育轉(zhuǎn)基因植物、篩選種子中氨基酸水平提高和對(duì)其他農(nóng)學(xué)性狀的不利影響最小的手段，以提供本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子。這種種子可用來(lái)生產(chǎn)其基因組中整合了重組DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因玉米植物，所述重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄出能抑制氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的水平的反義方向RNA。
以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的各方面。
實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明可用來(lái)將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建物插入到轉(zhuǎn)基因植物中以實(shí)施本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化載體的制備。
LKR/SDH基因編碼賴氨酸分解代謝途徑中的酶——賴氨酸酮戊二酸還原酶(LKR)和酵母氨酸脫氫酶(SDH)的前體蛋白質(zhì)。LKR的抑制由賴氨酸含量的改變(例如提高)來(lái)證明。LKR的抑制通過(guò)在植物中表達(dá)重組DNA構(gòu)建物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述重組DNA構(gòu)建物能產(chǎn)生從反義方向LKR DNA和有義方向LKR DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的穩(wěn)定化反義RNA，所述反義RNA形成反義方向RNA環(huán)。制備包含在根瘤土壤桿菌右緣和左緣之間的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)化載體。一個(gè)用于標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄單位包含(a)水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子的DNA，(b)擬南芥(Arabidopsis)EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA，(c)根瘤土壤桿菌aroA(草甘磷抗性標(biāo)記)的DNA，(d)根瘤土壤桿菌NOS終止子的DNA，另一個(gè)用于LKR基因抑制的轉(zhuǎn)錄單位包含(a)玉米(Zea mays)GLB1啟動(dòng)子的DNA，(b)玉米ADH1內(nèi)含子的DNA，(c)玉米LKR的反義方向DNA片斷，(d)玉米LKR的有義方向DNA片斷，(e)玉米GLB1終止子的DNA，SEQ ID NO1是包含上述標(biāo)記轉(zhuǎn)錄單位和基因抑制轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)化載體的DNA序列。有關(guān)SEQ ID NO1當(dāng)中所包含的轉(zhuǎn)化載體各元件的描述見(jiàn)下表1。
表1
用由表1所列元件制備的載體用于轉(zhuǎn)化玉米植物組織。轉(zhuǎn)基因玉米植物通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得。使得自兩個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因插入事件的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)，以產(chǎn)生F1種子。分析每個(gè)事件的六顆成熟種子，以確定轉(zhuǎn)化成功和LKR被抑制。將成熟的轉(zhuǎn)基因種子切成碎片，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。參考圖2，得自一個(gè)事件的種子與野生型相比不顯示LKR降低；而得自另一個(gè)事件的種子顯示發(fā)生分離(1∶1半合子∶野生型)，因?yàn)榱w種子中有三顆與野生型相比顯示實(shí)質(zhì)上的LKR降低。
實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明賴氨酸增高的轉(zhuǎn)基因玉米。實(shí)施例1制備的轉(zhuǎn)化載體通過(guò)插入包含種子特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行修飾，所述啟動(dòng)子有效連接到編碼二氫吡啶二羧酸合酶的DNA。更具體的說(shuō)，所述轉(zhuǎn)錄單位包含玉米球蛋白1啟動(dòng)子(bp 48-1440；Kriz，Biochem.Genet.27239-251，1989；Belanger和Kriz，Genetics，129863-872，1991及美國(guó)專利第6329574號(hào))、水稻肌動(dòng)蛋白1內(nèi)含子(bp 1448-1928；McElroy等，Plant Cell，2163-171，1990)、玉米DHDPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(bp 1930-2100；Frisch等，Mol.Gen.Genet.，228287-293，1991)、棒桿菌(Corynebacterium)DHDPS基因(bp 2101-3003；Bonnassie等，NucleicAcids Research，186421，1990；Richaud等，J.Bacteriol.，166297-300，1986)、玉米球蛋白13′非翻譯區(qū)(bp 3080-4079；Belanger和Kriz，1991)的DNA。用以抑制賴氨酸酮戊二酸合酶和表達(dá)二氫吡啶二羧酸合酶的啟動(dòng)子相鄰，以向相反的方向轉(zhuǎn)錄RNA。從轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)出的玉米與典型玉米中基本不含賴氨酸相比，賴氨酸水平更高，例如在3000-4000ppm的范圍內(nèi)。
可按以上公開(kāi)內(nèi)容的指導(dǎo)，不必進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可制備和使用本文所公開(kāi)和要求保護(hù)的所有材料和方法。雖然本發(fā)明的材料和方法已用優(yōu)選實(shí)施方案和說(shuō)明性實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍，對(duì)本文描述的材料和方法進(jìn)行各種改變。所有這種對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的類似替代和修改視為落入后附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明精神、范圍和概念之內(nèi)。
序列表<110>Malvar，ThomasHuang，ShihshiehLuethy，Michael<120>氨基酸含量提高的轉(zhuǎn)基因玉米種子<130>38-15(53490)B<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>8296<212>DNA<213>人工<220>
<223>質(zhì)粒中土壤桿菌各緣之間的重組DNA構(gòu)建物<400>1ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga 60caatctgatc cccatcaagc ttactcgagg tcattcatat gcttgagaag agagtcggga120tagtccaaaa taaaacaaag gtaagattac ctggtcaaaa gtgaaaacat cagttaaaag180gtggtataaa gtaaaatatc ggtaataaaa ggtggcccaa agtgaaattt actcttttct240actattataa aaattgagga tgtttttgtc ggtactttga tacgtcattt ttgtatgaat300tggtttttaa gtttattcgc ttttggaaat gcatatctgt atttgagtcg ggttttaagt360tcgtttgctt ttgtaaatac agagggattt gtataagaaa tatctttaga aaaacccata420tgctaatttg acataatttt tgagaaaaat atatattcag gcgaattctc acaatgaaca480ataataagat taaaatagct ttcccccgtt gcagcgcatg ggtatttttt ctagtaaaaa540taaaagataa acttagactc aaaacattta caaaaacaac ccctaaagtt cctaaagccc600aaagtgctat ccacgatcca tagcaagccc agcccaaccc aacccaaccc agcccacccc660agtccagcca actggacaat agtctccaca cccccccact atcaccgtga gttgtccgca720
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1.一種用以生產(chǎn)氨基酸含量提高的轉(zhuǎn)基因玉米的種子，所述種子在其基因組中整合了轉(zhuǎn)錄反義方向RNA的重組DNA構(gòu)建物，所述RNA抑制氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，其中所述重組DNA包含有效連接到被轉(zhuǎn)錄成所述RNA的DNA的種子特異性啟動(dòng)子，且其中所述種子與其中所述蛋白質(zhì)的產(chǎn)生不被抑制的對(duì)照玉米植物的后代種子相比，氨基酸含量提高。
2.權(quán)利要求1的種子，其中所述被轉(zhuǎn)錄成所述RNA的DNA包含反義方向DNA元件和有義方向DNA元件，其中有義方向DNA元件比反義方向DNA元件要短，其中有義方向DNA所轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與反義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的最5′末端互補(bǔ)，其中所述轉(zhuǎn)錄RNA形成反義方向RNA環(huán)用以抑制所述氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的種子，其中所述種子特異性啟動(dòng)子是胚芽特異性啟動(dòng)子或胚乳特異性啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求1的種子，其中所述重組DNA構(gòu)建物產(chǎn)生用以抑制賴氨酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的編碼基因的RNA。
5.權(quán)利要求4的種子，其中所述賴氨酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)是賴氨酸酮戊二酸還原酶、酵母氨酸脫氫酶或兩者。
6.權(quán)利要求1的種子，所述種子其基因組中進(jìn)一步整合了表達(dá)氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)的重組DNA。
7.權(quán)利要求6的種子，其中所述氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)是二氫吡啶二羧酸合酶。
8.權(quán)利要求3的種子，其中所述氨基酸是賴氨酸，所述氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)是賴氨酸酮戊二酸還原酶，所述氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)是二氫吡啶二羧酸合酶。
9.一種用以在植物中產(chǎn)生基因抑制用反義方向RNA環(huán)的重組DNA構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物以5′至3′順序包含與反義方向DNA元件有效連接的種子特異性啟動(dòng)子元件和有義方向DNA元件，其中所述有義方向DNA元件比反義方向DNA元件短，其中有義方向DNA所轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與反義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的最5′區(qū)段互補(bǔ)，其中所述DNA元件被轉(zhuǎn)錄成能形成反義方向RNA環(huán)的RNA，所述RNA用以抑制至少一個(gè)基因的表達(dá)；其中所述被靶向抑制的基因表達(dá)賴氨酸酮戊二酸還原酶。
10.一種提高玉米種子中的賴氨酸水平的方法，所述方法通過(guò)在發(fā)育的玉米種子中表達(dá)權(quán)利要求9的重組DNA構(gòu)建物來(lái)進(jìn)行。
11.一種生產(chǎn)氨基酸水平提高的玉米種子的方法，所述方法包括從轉(zhuǎn)基因種子生長(zhǎng)玉米植物，所述轉(zhuǎn)基因種子的基因組中整合了用以抑制氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的表達(dá)的重組DNA構(gòu)建物，其中所述重組DNA構(gòu)建物包含種子特異性啟動(dòng)子，所述種子特異性啟動(dòng)子有效連接到被轉(zhuǎn)錄成與所述蛋白質(zhì)的信使RNA互補(bǔ)的反義方向RNA的DNA，且其中所述轉(zhuǎn)基因玉米與其中所述蛋白質(zhì)不被抑制的對(duì)照玉米植物相比其種仁中氨基酸含量提高。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建物以5′至3′順序包含與反義方向DNA元件有效連接的所述種子特異性啟動(dòng)子元件和有義方向DNA元件，其中所述有義方向DNA元件比所述反義方向DNA元件短，其中有義方向DNA所轉(zhuǎn)錄的有義方向RNA與反義方向DNA元件所轉(zhuǎn)錄的反義方向RNA的最5′區(qū)段互補(bǔ)，且其中所述DNA元件被轉(zhuǎn)錄成能形成反義方向RNA環(huán)的RNA，所述RNA用以抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述種子特異性啟動(dòng)子是胚芽特異性啟動(dòng)子和胚乳特異性啟動(dòng)子。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建物產(chǎn)生用以抑制賴氨酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)的表達(dá)的RNA。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述賴氨酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)是賴氨酸酮戊二酸還原酶、酵母氨酸脫氫酶或兩者。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述種子的基因組中進(jìn)一步整合了表達(dá)氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)的重組DNA。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)是二氫吡啶二羧酸合酶。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述氨基酸是賴氨酸，所述氨基酸分解代謝途徑中的蛋白質(zhì)是賴氨酸酮戊二酸還原酶，所述氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)是二氫吡啶二羧酸合酶。
全文摘要
通過(guò)從以5′至3′順序包含與反義方向DNA元件有效連接的啟動(dòng)子元件和互補(bǔ)DNA元件的重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)基因生物(例如植物)的細(xì)胞中產(chǎn)生反義方向RNA環(huán)形式的反義方向RNA基因抑制劑。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1942580SQ200580012014
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月10日
發(fā)明者T·M·馬爾瓦, 黃士杰, M·H·呂蒂 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司