專利名稱：一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種雜交稻種子的生產(chǎn)方法，特別是一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法。
背景技術：
水稻是全球近一半人的主食。全球每年被病蟲草害奪走大約三分之一。據(jù)估計，造成的經(jīng)濟損失每年達1200萬美元以上。為了對付病蟲草害，每年還要生產(chǎn)大約200多萬噸的農(nóng)藥。例如二化螟和稻飛虱是北方稻田的兩大主要蟲害，每年可使水稻減產(chǎn)10％-20％，嚴重者還會造成絕收。當前防治蟲害的主要措施是大量使用殺蟲雙和呋喃丹等殺蟲劑，每年的用量可達1000萬公斤以上，價值在2000萬元左右，不僅造成人力和財力的浪費，而且還造成環(huán)境污染，隨著時間的推移，農(nóng)藥的殘毒、害蟲的抗藥性也會日益突出，當今在推廣雜交稻種植中同樣遇到上述蟲害問題，還遇到雜交稻種不純的問題，二者嚴重制約了雜交稻的推廣與應用。即抗蟲性差，不能確保穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)；稻種不純，不宜大面積種植。這兩個問題難以用常規(guī)育種方法有效解決，如在雜交稻制種中極易引起生物學和機械性混雜，尤其是兩系雜交稻的自身混雜。為此，人們在探索其解決方法并取得了成果，如中國專利申請?zhí)?9115125.9申請文件中涉及到了將抗除草劑基因?qū)肴惦s交稻保持系以使其系獲得抗除草劑基因，使之具備抗除草劑特性。又如中國專利申請?zhí)?7109814.X文件中涉及到將抗除草劑基因轉(zhuǎn)入三系或二系雜交稻恢復系，使之獲得抗除草劑基因，具備抗除草劑特性，以保在培育中用除草劑除草時只除掉草，而不傷害雜交稻苗，以生產(chǎn)出純度高的稻種，在這兩申請案中均未涉及雜交稻制種導入抗除蟲劑基因的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，提供一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，既能克服雜交稻種子因純度不夠大而不能大面積生產(chǎn)的問題，又能增強雜交稻的抗蟲性，提高產(chǎn)量。
本發(fā)明的技術方案是將抗除草劑基因和抗螟蟲基因轉(zhuǎn)入三系雜交稻或兩系雜交稻的恢復系，使恢復系獲得抗除草劑基因和抗二化螟基因，具備抗除草劑和二化螟特性；將抗稻飛虱基因轉(zhuǎn)入三系雜交稻的保持系，使保持系獲得抗稻飛虱基因，具備抗稻飛虱特性；通過不育系與保持系雜交，使不育系獲得抗稻飛虱基因，具備抗稻飛虱特性；再利用所得到的恢復系與不育系雜交，生產(chǎn)雜交稻種子。也就是說將抗稻飛虱的雪花蓮外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)基因?qū)氲诫s交稻的保持系早花二B中，以抗潮霉素(Hygromycinphosphotransferase，Hyg)基因作為篩選標記基因；將修飾后的抗螟蟲的豇豆胰蛋白酶抑制劑(modified cowpea trypsin inhibitor，modifiedCpTI＝SCK)基因?qū)氲诫s交稻恢復系超優(yōu)一號中，以抗除草劑Basta的bar基因作為篩選標記基因，同時也作為目的基因。這樣在不育系的繁種過程中，不育系早花二A就獲得了抗稻飛虱特性；通過雜交稻制種過程，雜交稻就獲得了親本中的兩種抗蟲性和抗除草劑特性。
多抗轉(zhuǎn)基因雜交粳稻的組配親本1轉(zhuǎn)基因恢復系轉(zhuǎn)化的基因1.1抗二化螟基因目的基因。所用SCK基因為修飾后的豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea trypsin inhibitor，CpTI.Modified CpTI＝SCK)基因，來源于栽培豇豆品種加利福尼亞黑眼豆(Vigna unguiculata L.Walp，cv.CaliforniaBlack-eye)，是絲氨酸蛋白酶抑制劑的一種，屬于Bowman-Birk類型的雙頭蛋白酶抑制劑，即一個抑制劑分子可以抑制兩個胰蛋白酶分子的催化活性(Hilder，V.A等人，1989)。CpTI主要存在于豇豆的可食部分種子內(nèi)，屬于白蛋白類型的種子貯藏蛋白。CpTI基因在種子灌漿早期開始表達，并迅速合成CpTI，最終成熟種子內(nèi)CpTI的含量可達總蛋白含量的10％左右(Hilder，V.A等人，1990)。
目的基因序列全長415bps，編碼136個氨基酸和一個終止密碼子，前端為25氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號Signal，末端為4氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL，中間為324bps的CpTI基因，編碼107個氨基酸殘基。其中包括27個氨基酸前導肽序列和80個氨基酸的成熟蛋白序列。
SCK基因引物序列5′5′-AAA ATC AAG AGC ACC ATC TTC 3′3′5′-TCT AGA GTT CAT CTT TCT CAT C 3′1.2抗除草劑基因標記基因和目的基因。它是從吸水鏈霉菌(StrepTomyceshygroscopicus)中分離出來的抗PPT(Phosphinotricin)的bar基因，PPT是一種谷氨酰胺合成酶的抑制劑，一般認為植物體內(nèi)生成的PPT會抑制谷氨酰胺合成酶導致氨積累，最后使植物因氨累積而中毒死亡。bar基因編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT(Phosphinotricin acetyltransferase)，PAT使乙酰與PPT的游離氨基結合，并使PPT失去活性，不能抑制谷氨酰胺合成酶。因此，可提供對PPT的抗性。bar基因編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT，主要存在于植物的葉子部分，在植物的籽粒部分不表達。
bar基因引物序列5′5′-TCA AAT CTC GGT GAC GGG C 3′3′5′-CAC CAT CGT CAA CCA CTA C 3′2、轉(zhuǎn)基因保持系轉(zhuǎn)化的基因2.1抗稻飛虱基因目的基因。所用基因為雪花蓮外源凝集素(galanthus nivalisagglutinin，GNA)基因，來源于雪花蓮。雪花蓮(galanthus nivalis)屬于石蒜科(wmarvillidaceace)觀賞植物，在雪花蓮一定生長階段的大多數(shù)組織中含有GNA，GNA只專一識別并結合α-1，3和α-1，6甘露糖。外源凝集素的毒性基于它們特異結合到昆蟲腸道的糖綴合物上，這種結合影響了營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收(powell，1993；van damme，1988).另外，還有研究報道，外源凝集素可促進昆蟲消化道內(nèi)細菌繁殖，并誘發(fā)病兆(liener，1986)，最終對害蟲造成嚴重危害，抑制害蟲生長繁殖，從而達到殺蟲的目的。
目的基因序列全長484bps，編碼157個氨基酸和兩個終止密碼子，N-端為23氨基酸的信號肽，末端為29氨基酸的C-端序列，中間編碼105個氨基酸的成熟蛋白。
GNA引物序列為5′5′-CAA AAT GGC TAA GGC AAG TC-3′3′5′-CGG TCA TTA CTT TGC CGT CA-3′2.2抗潮霉素基因標記基因。為潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin Bphosphotransferase，hyg)基因，又稱aph(4)-Ta或hpt，hph基因，來自streptomyces hygroscopicus(Gritz，L.& Davies，J.，1983)。aph(4)-Ta編碼氨基酸糖苷4-磷酸轉(zhuǎn)移酶[APH(4)-Ta]，又稱潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。潮霉素B可抑制蛋白質(zhì)的合成，APH(4)-Ta可將ATPXa-位磷轉(zhuǎn)移至潮霉素B的第4位羥基上，并使其失去抑制活性。因此，其可提供對潮霉素的抗性。
以上基因的轉(zhuǎn)化方法為基因槍轟擊法。
3、轉(zhuǎn)基因不育系轉(zhuǎn)化的基因抗稻飛虱基因和抗潮霉素基因，由轉(zhuǎn)基因保持系繁殖獲得。
多抗轉(zhuǎn)基因雜交粳稻的組配方法1、轉(zhuǎn)基因不育系的繁種過程如圖所示普通不育系×轉(zhuǎn)基因保持系(含GNA基因)↓(抗稻飛虱)↓轉(zhuǎn)基因不育系(含GNA基因)(抗稻飛虱)2、多抗轉(zhuǎn)基因雜交粳稻的制種過程如圖所示轉(zhuǎn)基因不育系×轉(zhuǎn)基因恢復系(含GNA基因)↓(含SCK、bar基因)(抗稻飛虱)↓(抗二化螟，抗除草劑)↓多抗轉(zhuǎn)基因雜交粳稻(含有SCK、GNA、bar三個外源基因)(抗二化螟，抗稻飛虱，抗除草劑)多抗轉(zhuǎn)基因雜交粳稻的組配優(yōu)點1、應用本發(fā)明的方法，只要隨機取樣播種，苗期噴施除草劑Basta，一個星期之內(nèi)就能簡便、精確地統(tǒng)計出每一批制種雜交稻的純度，鑒定時間短，鑒定效率高。
2、應用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的雜交稻種子在播種秧田期可通過噴施除草劑Basta及時把假雜種清除掉，同時還可消滅雜草，從而提高生產(chǎn)田的純度，更好地體現(xiàn)雜種優(yōu)勢。
3、應用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的雜交稻種子具有抗二化螟和抗稻飛虱的特性，可以抵抗螟蟲和稻飛虱的危害，提高水稻產(chǎn)量，而且因大量減少了農(nóng)藥的使用而節(jié)省了費用，減輕了農(nóng)藥對益蟲的殺害和對產(chǎn)品產(chǎn)生的毒害(殘留)，同時也保護了環(huán)境。因此種植抗蟲雜交稻比常規(guī)雜交稻能獲得更好的社會效益和更大的經(jīng)濟效益。
4、應用本發(fā)明生產(chǎn)的雜交稻可為社會提供更多的優(yōu)質(zhì)、少污染大米。隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對大米的品質(zhì)要求越來越高，特別是優(yōu)質(zhì)、不被農(nóng)藥污染的稻米將有著極為廣闊的市場。雜交稻本身的制種和繁種過程，賦予了雜交稻以廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實施例方式
三系法生產(chǎn)雜交稻種子實例1、親本1.1恢復系1.1.1基因轉(zhuǎn)化受體為天津市水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)粳稻恢復系超優(yōu)一號(又叫津稻1229)。在京津地區(qū)栽培全生育期145天，畝產(chǎn)500-600Kg。株高110cm左右，穗大，穗長22cm，平均每穗116粒；粒大，千粒重26-27g，結實率91％。經(jīng)農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督、檢驗測試中心檢驗，各項指標均達到國家一級優(yōu)質(zhì)米標準。
1.1.2轉(zhuǎn)基因恢復系全生育期同轉(zhuǎn)化受體，145天左右。株高115cm左右，穗長26cm左右，平均每穗163粒；千粒重25g左右，結實率81％左右。增加了抗蟲性和抗除草劑特性。
1.2保持系1.2.1基因轉(zhuǎn)化受體為天津市水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)粳稻保持系早花二B。全生育期160天左右，適于做早、中稻栽培。一般畝產(chǎn)550Kg。莖稈矮壯、堅硬，抗倒力強。株高85cm左右，棒狀穗，著粒較密。平均每穗135粒左右，穗長17cm左右，結實率94％，粒型橢圓，千粒重23g。無芒或有短頂芒。
1.2.2轉(zhuǎn)基因保持系全生育期同受體材料。株高90cm左右，比受體稍高些；穗型比受體稍散一些，其他性狀同受體。增加了抗稻飛虱和潮霉素特性。
1.3不育系1.3.1轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化受體為天津市水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)粳稻不育系早花二A。全生育期160天左右。莖稈矮壯、堅硬，抗倒力強。株高85cm左右，棒狀穗，著粒較密。平均每穗130粒左右，穗長16cm左右，自交結實率為0，異交率30％左右，粒型橢圓，無芒或有短頂芒。
1.3.2轉(zhuǎn)基因不育系由轉(zhuǎn)基因保持系進行繁殖。其生育期及其他農(nóng)藝性狀同早花二A。自交結實率為0。異交率30％左右。增加了抗稻飛虱和潮霉素特性。
2、組配方法
2.1轉(zhuǎn)基因不育系的繁種過程如圖所示普通不育系早花二A×轉(zhuǎn)基因保持系T早花二B(含GNA基因)↓ (抗稻飛虱)↓轉(zhuǎn)基因不育系T早花二A(含GNA基因)(抗稻飛虱)2.2多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻的制種過程如圖所示轉(zhuǎn)基因不育系T早花二A×轉(zhuǎn)基因恢復系T超優(yōu)一號(含GNA基因) ↓ (含SCK、bar基因)(抗稻飛虱) ↓ (抗二化螟，抗除草劑)↓多抗轉(zhuǎn)基因雜交粳稻組合(含有SCK、GNA、bar三個外源基因)(抗二化螟，抗稻飛虱，抗除草劑)3、除草劑處理結果


權利要求
1.一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于將抗除草劑基因和抗螟蟲基因轉(zhuǎn)入三系雜交稻或兩系雜交稻的恢復系，使恢復系獲得抗除草劑基因和抗二化螟基因，具備抗除草劑和二化螟特性；將抗稻飛虱基因轉(zhuǎn)入三系雜交稻的保持系，使保持系獲得抗稻飛虱基因，具備抗稻飛虱特性；通過不育系與保持系雜交，使不育系獲得抗稻飛虱基因，具備抗稻飛虱特性；再利用所得到的恢復系與不育系雜交，生產(chǎn)雜交稻種子。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于其抗草劑基因為是bar基因。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于其抗螟蟲基因是SCK基因(修飾后的CpTI，豇豆胰蛋白酶抑制劑基因)。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于其抗稻飛虱基因是GNA基因(雪花蓮外源凝集素基因)。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于其三系雜交稻的轉(zhuǎn)基因不育系是T早花二A系，由表現(xiàn)抗稻飛虱的轉(zhuǎn)基因保持系T早花二B繁育獲得。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于其轉(zhuǎn)基因恢復系是表現(xiàn)抗Basta的T超優(yōu)一號。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，其特征在于其轉(zhuǎn)化方法可以是基因槍轟擊法。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種多抗轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的生產(chǎn)方法，將抗除草劑基因和抗螟蟲基因轉(zhuǎn)入三系雜交稻或兩系雜交稻的恢復系，使恢復系獲得抗除草劑基因和抗螟蟲基因，具備抗除草劑特性和抗二化螟特性；將抗稻飛虱基因轉(zhuǎn)入三系雜交稻的保持系，使保持系獲得抗稻飛虱基因，具備抗稻飛虱特性。通過不育系與保持系雜交，使不育系獲得抗稻飛虱基因，具備抗稻飛虱特性；再利用所得到的轉(zhuǎn)基因恢復系與轉(zhuǎn)基因不育系雜交，生產(chǎn)雜交稻種子。該方法可以克服雜交稻純度偏低、抗蟲性偏差的問題。
文檔編號A01H1/02GK1625939SQ200310107230
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權日2003年12月8日
發(fā)明者李艷萍, 牛芝霞, 牛景, 鄒美智, 孫海波, 周維, 朱禎, 鄧朝陽, 徐鴻林 申請人:天津市水稻研究所, 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所, 天津市農(nóng)業(yè)生物技術研究中心