專(zhuān)利名稱(chēng)：一種玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
應(yīng)用基因工程技術(shù)改變玉米淀粉合成途徑來(lái)提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)是國(guó)際上較為熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域。高淀粉的有效合成需要通暢的底物供應(yīng)加以保障。來(lái)自“源器官”的蔗糖有效地轉(zhuǎn)入胚乳細(xì)胞的胞質(zhì)，以及蔗糖降解生成的磷酸葡萄糖和磷酸己糖有效地轉(zhuǎn)入質(zhì)體是淀粉合成及保障淀粉產(chǎn)量水平的前提。因此，分離玉米淀粉代謝與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體是定位于植物細(xì)胞質(zhì)膜上擔(dān)負(fù)著蔗糖跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾d體蛋白。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體在調(diào)控植物“源”器官內(nèi)光合同化物的輸出、光合同化物的分配以及庫(kù)器官內(nèi)光合同化物的輸入過(guò)程中發(fā)揮了重要功能(Hans Weber，LjudmillaBorisjuk，Ute Heim，Norbert Sauer and Ulrich Wobus，(1997)A role for sugartransporters during seed developmentmolecular characterization of a hexoseand a sucrose carrier in fava bean seeds.The Plant Cell 9895-908)。
蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(SUT)蛋白分子具有12次疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域，且該蛋白分子的氮端與碳端均定位于胞質(zhì)區(qū)(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，Alexander Schulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，Hanjo Hellmann，Waltraud Schulze，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2000)Sut2，a putativesucrose sensor in sieve elements.The Plant Cell，121153-1164)。植物體的根、莖、葉、花和果實(shí)等許多器官中均有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的分布。雙子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究進(jìn)展迅速，當(dāng)前的研究主要集中在三個(gè)方面蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的克隆及其性質(zhì)研究；蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控以及與植物組織和器官發(fā)育之間的關(guān)系研究。根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及氨基酸結(jié)構(gòu)方面的特點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的雙子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體可分為三類(lèi)高親和力/低運(yùn)輸量的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SUT1；低親和力/高運(yùn)輸量的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SUT4和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類(lèi)似蛋白亞家族SUT2(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，Alexander Schulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，Hanjo Hellmann，Waltraud Schulze，John M.Ward and WolfB.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrose sensor in sieve elements.The PlantCell，121153-1164)。這三個(gè)亞家族的成員在氨基酸結(jié)構(gòu)、功能、定位等方面存在顯著差異。SUT1和SUT4是具有不同蔗糖分子運(yùn)輸能力的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體。SUT2雖然不具備跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖分子的能力，但是SUT2能夠?qū)ν饨绛h(huán)境中的蔗糖分子產(chǎn)生特異性的應(yīng)答反應(yīng)，在調(diào)控糖信號(hào)介導(dǎo)的相關(guān)基因的表達(dá)和具備蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能載體的活性等方面發(fā)揮重要的生理功能。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)具有組織器官特異性以及發(fā)育階段特異性。SUT調(diào)控方式多種多樣。SUT的轉(zhuǎn)運(yùn)活性在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平都能夠進(jìn)行調(diào)控(Chi-aki Matsukura，Toshikazu Saitoh，Toshiro Hirose，RyuOhsugi，Pierdomenico Perata，and Junji Yamaguchi，(2000)Sugar Uptake andTransport in Rice Embryo.Expression of Companion Cell-Specific SucroseTransporter(OsSUT1)Induced by Sugar and Light.Plant Physiology，12485-94)。外界信號(hào)分子如糖分子等能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的磷酸化狀態(tài)也能影響其轉(zhuǎn)運(yùn)活性(Gabriel Roblin，Soulaiman Sakr，Janine Bonmort，and Serge Delrot，(1998)Regulation of a plant plasma membranesucrose transporter by phosphorylation.FEBS，424165-168)。SUT2、SUT1和SUT4共定位于同一篩分子質(zhì)膜上，而且SUT亞家族成員之間能夠相互作用并形成具有不同蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的同源低聚物或異源低聚物(Anke Reinders，WaltraudSchulze，Christina Kühn，Laurence Barker，Alexander Schulz，John M.Ward andWolf B.Frommer(2002)Protein-protein interactions between sucrosetransporters of different affinities colocalized in the same enucleate sieveelement.The Plant Cell 141567-1577)。
蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體與植物發(fā)育之間的關(guān)系研究主要是通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段實(shí)現(xiàn)的。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的正義與反義實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)“源”器官內(nèi)的光合代謝以及光合產(chǎn)物在植物體的各個(gè)器官間的合理分配是至關(guān)重要的(Lemoine，R.，Kuhn，C.，Thiele，N.，Delrot，S.，and Frommer，W.B.(1996)Antisenseinhibition of the sucrose transporterEffects on amount of carrier andsucrose transport activity.Plant Cell Environ.191124-1131)。而且，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)水平還直接影響到“庫(kù)”器官內(nèi)淀粉蓄積量的大小(Kuhn C，Hajirezaei MR，F(xiàn)ernie AR，Roessner-Tunali U，Czechowski T，Hirner B，F(xiàn)rommerW.B.(2003)The sucrose transporter StSUT1 localizes to sieve elements inpotato tuber phloem and influences tuber physiology and development.PlantPhysiology.31102-13)。
與雙子葉植物相比，單子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究進(jìn)展較為緩慢。Aoki等從玉米葉片中分離出ZmSUT1基因，該基因?qū)儆诟哂H和力/低運(yùn)輸量的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SUT1亞家族成員(Aoki N.，Hirose T.，Takahashi S.，Ono K.，Ishimaru K.andOhsugi R.(1999)Molecular cloning and expression analysis of a gene forsucrose transporter in maize(Zea mays L.).Plant Cell Physiology，401072-1078)。ZmSUT1在玉米種子的萌發(fā)過(guò)程以及玉米籽粒的發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮生理作用。在玉米中進(jìn)行的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究表明，玉米中也可能存在有多個(gè)成員組成的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族。這些蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族在玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中可能具有差異且相互協(xié)同起作用的功能。因此，玉米結(jié)實(shí)器官胚乳中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因家族新成員的克隆及其與植物淀粉代謝關(guān)系研究，可為利用生物技術(shù)應(yīng)用該基因資源，并通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平調(diào)控其他類(lèi)型的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性，從而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)蔗糖分子的跨膜運(yùn)輸，提高玉米貯藏組織的淀粉合成效率、產(chǎn)量水平以及定向改造玉米淀粉結(jié)構(gòu)生產(chǎn)特用工業(yè)化淀粉等，都具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，名稱(chēng)為ZmSUT2，來(lái)源于玉米屬玉米(Zeamays L.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列1由592個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第60位-572位氨基酸殘基為蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)域；自氨基端(N端)第286位-292位氨基酸殘基和自氨基端第348位-357位氨基酸殘基為SUT2亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。
上述玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白編碼基因(ZmSUT2)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由1863個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第36到第1814位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；自5’端第213到第1751位堿基編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)域；自5’端第891到第911位堿基和自5’端第1077到第1106位堿基編碼SUT2亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增ZmSUT2中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)證明玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白ZmSUT2基因在玉米籽粒中的表達(dá)決定了玉米籽粒中的支鏈淀粉和直鏈淀粉含量的高低。可利用本發(fā)明的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因提高籽粒淀粉合成碳素流的供應(yīng)，調(diào)節(jié)玉米籽粒中的蔗糖與淀粉代謝水平，改善光合同化物在玉米植株內(nèi)的分配，提高玉米的淀粉產(chǎn)量，改良玉米淀粉結(jié)構(gòu)，創(chuàng)制工業(yè)化特用高淀粉及高直鏈淀粉玉米種質(zhì)資源。本發(fā)明的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因?qū)⒃谟衩椎挠N中發(fā)揮重要作用。


圖1為不同玉米品種Hamy-ael和Lst853籽粒內(nèi)淀粉含量測(cè)定圖2a為ZmSUT2在不同玉米品種籽粒中的表達(dá)狀態(tài)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖2b為ZmSUT2表達(dá)量的半定量掃描結(jié)果具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、ZmSUT2的獲得根據(jù)部分單子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因，即ZmSUT1、OsSUT1、HvSUT1和HvSUT2的同源性比對(duì)的結(jié)果，選取了兩段同源性較高的序列并據(jù)此設(shè)計(jì)了一對(duì)引物上游引物，5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物，5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。利用這對(duì)引物，以授粉后15天的玉米籽?？俁NA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Taq緩沖液(華美公司)2μl，2.5mM dNTP1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq DNA聚合酶(華美公司)，加水補(bǔ)至總體積20μl。PCR循環(huán)條件94℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。將經(jīng)電泳分離純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-Easy Vector(購(gòu)自Promega公司)連接后轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，選取陽(yáng)性克隆送至上海生工進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，擴(kuò)增片斷是一個(gè)新的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的部分片斷。
以獲得的擴(kuò)增片斷為“探針”在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)ZmDB(http://www.maizegdb.org/)中進(jìn)行Blastn分析，并預(yù)測(cè)出上述擴(kuò)增片斷所代表的新基因的序列。根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果設(shè)計(jì)了擴(kuò)增新基因編碼區(qū)的一對(duì)引物上游引物，5’-CGCCAGCCCCAGCCCAGATCTA-3’；下游引物，5’-GTTGGTGTGATGTTTTACATGG-3’。利用這對(duì)引物，以授粉后15天的玉米籽?？俁NA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Pfx Taq緩沖液(購(gòu)自Invitrigen公司)5μl，2.5mM dNTP 6μl，50mM MgSO41μl，20μM上游引物和下游引物各1μl，1.25U Pfxtaq DNA聚合酶(購(gòu)自Invitrigen公司)，加水補(bǔ)至總體積50μl。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性15秒，54℃退火30秒，68℃延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后68℃延伸10分鐘。將分離純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-Easy Vector連接后轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，選取陽(yáng)性克隆送至上海生工進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。
測(cè)序結(jié)果顯示，得到具有序列表中序列2的核苷酸序列的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白編碼基因(ZmSUT2)，其編碼序列為自5’端第36到第1814位堿基，編碼由592個(gè)氨基酸組成的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白ZmSUT2(序列1)。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行同源性比對(duì)，核苷酸序列同源性比對(duì)的結(jié)果表明，ZmSUT2與OsSUT2和ZmSUT1基因的同源性分別為85.6％和62.9％。將其編碼的氨基酸序列提交至TMPRED數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ch.embnet.org/software/TMPRED.form.html)中進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明ZmSUT2具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)域(序列1的自氨基端第60位-572位氨基酸殘基)，ZmSUT2的中央環(huán)(序列1的自氨基端第277位-362位氨基酸殘基)和氮端(序列1的自氨基端第1位-59位氨基酸殘基)的長(zhǎng)度比ZmSUT1的相應(yīng)區(qū)域長(zhǎng)。而且，ZmSUT2具有雙子葉植物SUT2的兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域序列1的自氨基端第286位-292位氨基酸殘基和自氨基端第348位-357位氨基酸殘基。因此，該基因是SUT2亞家族在單子葉植物中的一個(gè)新成員。
實(shí)施例2、玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體ZmSUT2基因的基本功能1、玉米品種Hamy-ael和Lst853的淀粉含量的測(cè)定Hamy-ael(購(gòu)自吉林省農(nóng)科院)和Lst853(購(gòu)自吉林省農(nóng)科院)的籽粒研磨后經(jīng)100目篩去纖維，70％丙酮溶液脫脂，0.01M氯化鈉溶液去蛋白，80％乙醇溶液脫脂脫蛋白，40％乙醇溶液去除可溶性糖，得到粗提的淀粉顆粒。稱(chēng)取10mg粗提淀粉顆粒，用4ml 1M氫氧化鈉溶液沸水浴攪拌溶解，用鹽酸中和，定容至10ml。取1ml于12,000g離心15min去除沉淀后，即得樣品溶液。制備SepharoseCL-2B凝膠過(guò)濾層析柱，經(jīng)0.01M氫氧化鈉溶液平衡后進(jìn)行洗脫，洗脫速度0.15ml/min，支鏈淀粉先于直鏈淀粉被洗脫出來(lái)，每3ml收集1管。從每管取0.4ml，加0.4ml乙酸鈉緩沖液(pH3.8)，0.2ml碘試劑。反應(yīng)20分鐘后測(cè)量OD595。根據(jù)各組分在595nm處的吸光值繪制淀粉洗脫曲線。結(jié)果如圖1所示，表明Hamy-ael籽粒內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量顯著高于Lst853籽粒內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量，特別是直鏈淀粉的含量。圖中組分5～10之間的峰代表支鏈淀粉，組分10～20之間的峰代表直鏈淀粉。峰面積表示淀粉含量。
2、ZmSUT2基因在Hamy-ael和Lst853籽粒中的表達(dá)檢測(cè)以高淀粉含量玉米品種Hamy-ael和低淀粉含量玉米品種Lst853的授粉后15天籽粒總RNA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因ZmSUT2的表達(dá)。擴(kuò)增引物如下上游引物，5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物，5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。擴(kuò)增體系1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Taq緩沖液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水補(bǔ)至總體積20μl。PCR循環(huán)條件94℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共20個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行ZmSUT2表達(dá)量的半定量掃描(ImageMasterRVDS DE，Amersham Pharmacia Biotech)。結(jié)果如圖2a和圖2b所示，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明在授粉后15天的玉米籽粒中，ZmSUT2在不同玉米品種內(nèi)的表達(dá)存在顯著差異，ZmSUT2在Hamy-ael內(nèi)的表達(dá)要明顯強(qiáng)于Lst853內(nèi)的表達(dá)；半定量掃描的結(jié)果表明ZmSUT2在Hamy-ael內(nèi)的表達(dá)量大約是Lst853內(nèi)的表達(dá)量的5倍。
圖1，圖2a和圖2b的結(jié)果表明玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體ZmSUT2的表達(dá)量與玉米籽粒中淀粉含量之間存在正相關(guān)的關(guān)系，在支鏈淀粉和直鏈淀粉含量更高的品種Hamy-ael的籽粒內(nèi)，ZmSUT2的表達(dá)水平也更強(qiáng)，因此，玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體ZmSUT2是玉米籽粒中淀粉代謝的關(guān)鍵因子，ZmSUT2表達(dá)量的高低決定了玉米籽粒中淀粉含量的高低，進(jìn)而決定玉米籽粒淀粉的品質(zhì)。
序列表<160>2<210>1<211>592<212>PRT<213>玉米屬玉米(Zea mays L)<400>1Met Asp Ala Gly Ala Gly Ala Thr Ala Ile Arg Val Pro Tyr Arg His1 5 10 15Leu Arg Asp Ala Glu Met Glu Leu Val Ser Leu Asn Gly Gly Ala Pro20 25 30Gly Gly Asp Thr Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asp Gln Pro Arg35 40 45Ser Arg Ala Asp Arg Thr Lys Leu Val Leu Ala Cys Met Val Ala Ala50 55 60Gly Val Gln Phe Gly Trp Ala Leu Gln Leu Ser Leu Leu Thr Pro Tyr65 70 75 80Ile Gln Thr Leu Gly Ile Asp His Ala Met Ala Ser Phe Ile Trp Leu85 90 95Cys Gly Pro Ile Thr Gly Phe Val Val Gln Pro Cys Val Gly Val Trp100 105 110Ser Asp Lys Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Leu115 120 125Ala Gly Cys Ile Met Ile Cys Ala Ala Val Thr Leu Ile Gly Phe Ser130 135 140Ala Asp Leu Gly Tyr Ile Leu Gly Asp Thr Thr Glu His Cys Arg Thr145 150 155 160Tyr Lys Gly Ser Arg Phe Arg Ala Ala Ile Val Phe Ile Leu Gly Phe165 170 175
Trp Met Leu Asp Leu Ala Asn Asn Thr Val Gln Gly Pro Ala Arg Ala180 185 190Leu Leu Ala Asp Leu Ser Gly Pro Asp Gln Cys Asn Ser Ala Asn Ala195 200 205Ile Phe Cys Ser Trp Met Ala Val Gly Asn Ile Leu Gly Phe Ser Ala210 215 220Gly Ala Ser Gly Glu Trp His Lys Trp Phe Pro Phe Leu Thr Thr Arg225 230 235 240Ala Cys Cys Glu Ala Cys Gly Asn Leu Lys Ala Ala Phe Leu Val Ala245 250 255Val Val Phe Leu Leu Leu Cys Met Ser Val Thr Leu Tyr Phe Ala Glu260 265 270Glu Ser Pro Leu Asp Pro Lys Asp Thr Gln Gly Leu Ser Asp Ser Ala275 280 285Pro Leu Leu Asn Gly Ser Arg Asp Ala Ala His Ala Ser Asn Glu Pro290 295 300Asn Asn Glu Arg Phe Pro Asn Gly His Val Gly Leu Asn Asn Val Ser305 310 315 320Ala Asn Asn Asn Thr Glu Glu Phe Thr Asn Val Asn Ser Asn Thr Glu325 330 335Lys Gly Gly Val Phe Asn Asp Gly Pro Gly Ala Val Leu Val Asn Ile340 345 350Leu Thr Arg Met Arg His Leu Pro Pro Gly Met His Ser Val Leu Leu355 360 365Val Met Ala Leu Thr Trp Leu Ser Trp Phe Pro Phe Phe Leu Phe Asp370 375 380Thr Asp Trp Met Gly Arg Glu Val Tyr His Gly Asp Pro Asn Gly Asp385 390 395 400Leu Ser Glu Arg Lys Ala Tyr Asp Asn Gly Val Arg Glu Gly Ala Phe405 410 415Gly Leu Leu Leu Asn Ser Val Val Leu Gly Val Gly Ser Phe Leu Val420 425 430
Asp Pro Leu Cys Arg Met Ile Gly Ala Arg Leu Val Trp Ala Ile Ser435 440 445Asn Phe Thr Val Phe Ile Cys Met Met Ala Thr Thr Ile Leu Ser Trp450 455 460Ile Ser Ser Asp Leu Tyr Ser Ser Lys Leu His His Ile Ile Gly Ala465 470 475 480Asn Lys Thr Val Lys Ile Thr Ala Leu Val Val Phe Ser Leu Leu Gly485 490 495Leu Pro Leu Ser Ile Thr Tyr Ser Val Pro Phe Ser Val Thr Ala Glu500 505 510Leu Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gln Gly Leu Ala Thr Gly Val Leu515 520 525Asn Leu Ala Ile Val Val Pro Gln Ile Val Val Ser Leu Gly Ala Gly530 535 540Pro Trp Asp Ala Leu Tyr Gly Gly Gly Asn Thr Pro Ala Phe Val Leu545 550 555 560Ala Ser Val Phe Ser Leu Ala Ala Gly Val Leu Ala Val Leu Lys Leu565 570 575Pro Lys Leu Ser Asn Ser Tyr Gln Ser Ala Gly Phe His Gly Phe Gly580 585 590<210>2<211>1863<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>2cgccagcccc agcccagatc tacggcgcgc ccgccatgga cgccggcgcc ggggccacgg 60ccatccgagt gccctaccgc cacctccgcg acgccgagat ggagctcgtc agcctcaacg 120gcggcgctcc cggaggggac acgggcccgc ccccgccacc gcccaaggac cagccgcgga 180gccgcgccga caggaccaag ctcgtgctcg cctgcatggt cgccgcgggc gtccagttcg 240gatgggcgct gcagctctcc ctccttacgc catacatcca gaccctagga atagaccatg 300
ccatggcatc atttatttgg ttgtgtgggc ctataactgg ttttgtggtt caaccttgtg 360ttggtgtttg gagtgataag tgccgttcaa agtatgggag gagaagacca tttattttgg 420ctggatgcat aatgatatgt gctgctgtaa ctctaatcgg gttttctgca gacctcggtt 480acatcttagg ggacaccact gagcactgca gaacatataa aggttcaagg tttcgagctg 540ctattgtttt cattctagga ttctggatgt tggacctggc aaacaataca gtgcaaggtc 600ctgcgcgtgc tcttctagct gatctttcag gtcctgatca gtgcaattct gcaaatgcaa 660tattctgctc atggatggct gttgggaata ttcttggttt ttcagctgga gcgagtgggg 720aatggcacaa gtggtttcca tttctaacga caagagcatg ctgtgaagct tgcggtaatt 780tgaaagcagc tttcttagtt gcagttgtat ttcttttgtt atgtatgtct gttaccctgt 840acttcgctga agagagccca ctagatccaa aagatacaca aggactatca gattctgctc 900ctctgctgaa cggttctaga gatgctgccc atgcatcaaa tgaaccaaat aatgaaagat 960ttcctaatgg ccatgtgggt ttaaacaatg tgtcggctaa caacaacact gaggaattta1020caaatgtgaa ttccaacaca gagaaaggag gagtcttcaa tgatgggcca ggagcagttt1080tggttaacat tttgaccaga atgaggcatc tacctcctgg gatgcattca gtgcttctag1140ttatggccct aacatggttg tcatggtttc cctttttcct ttttgacact gactggatgg1200gacgcgaagt ttaccatggg gatccaaatg gagatttgag tgagaggaaa gcttatgaca1260atggtgtccg agaaggtgca tttggtttgc tattgaattc agttgtcctt ggcgttggtt1320cattccttgt tgatccacta tgccggatga ttggtgcaag attagtttgg gccattagca1380acttcacggt gtttatttgc atgatggcta caacgatatt aagttggatc tcttctgatc1440tgtactcaag caaacttcat cacatcatcg gggcaaataa aacagtcaag atcacggcat1500tggttgtttt ctctcttctc ggattgccac tctccatcac ttacagcgtt ccgttttctg1560tgactgctga gctgactgcc ggtacaggag gtggacaagg tttggccaca ggagtcctaa1620atcttgctat cgtggttccc cagatagtag tgtcgcttgg agcaggtcca tgggacgctc1680tgtatggagg agggaatacc ccggcgttcg tcttggcttc ggtcttctcc ctggcagcag1740gtgtgctcgc agttctcaag ctgccaaagc tgtccaactc gtaccaatct gccgggttcc1800atggatttgg ctgatgctca tgcccaaaac acccccgtct gccatgtaaa acatcacacc1860aac 186權(quán)利要求
1.一種玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，其特征在于所述SEQ ID №1的自氨基端第60位-572位氨基酸殘基為蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的12次跨膜結(jié)構(gòu)域；自氨基端第286位-292位氨基酸殘基和自氨基端第348位-357位氨基酸殘基為SUT2亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2所述的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因的編碼序列為SEQ ID №2的自5’端第36到第1814位堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的基因，其特征在于所述SEQ ID №2的自5’端第213到第1751位堿基編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的12次跨膜結(jié)構(gòu)域；自5’端第891到第911位堿基和自5’端第1077到第1106位堿基編碼SUT2亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。
7.含有權(quán)利要求3-6中任一所述的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白編碼基因的表達(dá)載體。
8.含有權(quán)利要求3-6中任一所述的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白編碼基因的細(xì)胞系及宿主菌。
9.擴(kuò)增權(quán)利要求3-6中任一所述的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白編碼基因的引物對(duì)。
10.權(quán)利要求1或2所述的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因在玉米育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能的蛋白質(zhì)?？衫帽景l(fā)明的玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白及其編碼基因提高籽粒淀粉合成碳素流的供應(yīng)，調(diào)節(jié)玉米籽粒中的蔗糖與淀粉代謝水平，改善光合同化物在玉米植株內(nèi)的分配，提高玉米的淀粉產(chǎn)量，改良玉米淀粉結(jié)構(gòu)，創(chuàng)制工業(yè)化特用高淀粉及高直鏈淀粉玉米種質(zhì)資源。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1781942SQ200410096628
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者王英典, 王欣生, 程偉 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)