專利名稱：百葉草離體快繁方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體說涉及百葉草離體快繁的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
百葉草(Euteralis stellata)屬唇形科水生植物，植株葉長可達(dá)6cm，葉寬約0.5cm。葉片緊密輪生在粗壯的主莖上，每輪葉片最多可達(dá)12片。依光照條件不同，葉色可隨光照條件變化由綠色到紅紫色。整株造型優(yōu)美，葉片變化多姿，極具觀賞性，因而成為觀賞水族箱中常用水草品種。另外，百葉草還含有藥用成分，可防止便秘，消化不良，促進(jìn)小腸蠕動等功效。但是，百葉草是以扦插繁殖的，且繁殖極困難，故大部分是從國外進(jìn)口的，價格不菲。目前，尚沒有對于百葉草種苗的大量離體快繁技術(shù)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要能對百葉草進(jìn)行離體快繁的方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種百葉草離體快繁技術(shù)，快速得到能夠大規(guī)模繁殖所用的種苗。
在本發(fā)明的一個方面，公開了一種百葉草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有1/2MS；0.25-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.02-1.5mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
在該方面的一個優(yōu)選例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1/2MS；0.5mg/l芐基氨基嘌呤和0.1mg/l萘乙酸。
在本發(fā)明的另一個方面，公開了一種百葉草不定芽增殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有1/2MS；0.025-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.001-0.10mg/l萘乙酸，其中1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
在該方面的一個優(yōu)選例中，該增殖培養(yǎng)基含有1/2MS；0.05mg/l芐基氨基嘌呤和0.10mg/l萘乙酸。
在本發(fā)明的另一個方面，還公開了一種百葉草離體快繁方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)將百葉草的芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20-30攝氏度下，光照強(qiáng)度為2000-4000lx，光照8-12小時/天下培養(yǎng)10-50天，優(yōu)選30天；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1/2MS；0.25-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.02-1.5mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％；(b)將步驟(a)產(chǎn)生的植株轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，在20-30攝氏度下，光照強(qiáng)度2000-4000lx，光照10-15小時/天條件下培養(yǎng)10-50天，優(yōu)選30天；所述增殖培養(yǎng)基含有1/2MS；0.025-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.001-0.10mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％；(c)將步驟(b)得到的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在25-30攝氏度下，光照強(qiáng)度3000-5000lx，光照12-16小時/天條件下培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基含有1/2MS；0.05mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
在該方法的一個優(yōu)選例中，還包括在接種前消毒漂洗所述百葉草的芽；所述消毒劑選自70％-75％體積的酒精溶液，2％-5％體積的次氯酸溶液，0.1％-0.2％體積的升汞溶液。更優(yōu)選的是2％體積的次氯酸升汞溶液。
在該方面的一個優(yōu)選例中，芽選自頂芽、腋芽、或帶有腋芽的節(jié)段。
在該方面的另一個優(yōu)選例中，其特征在于，所述步驟(a)中的培養(yǎng)條件為25-27攝氏度，光照強(qiáng)度為3000±250lx，光照時間為10小時/天。
在該方面的還有一個優(yōu)選例中，步驟(b)中的培養(yǎng)條件為24-25攝氏度，光照強(qiáng)度為3000±250lx，12小時/天。
在該方面的另一個優(yōu)選例中，步驟(c)中的培養(yǎng)條件是27攝氏度，光照強(qiáng)度為4000±250lx，14小時/天。


圖1-3是用不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的結(jié)果照片。
圖4是用2號培養(yǎng)基進(jìn)行增殖獲得的結(jié)果照片。
圖5-10是新培養(yǎng)基用于不定芽增殖的結(jié)果照片。
具體實施例方式
植物離體快繁成功的關(guān)鍵是找到適宜的培養(yǎng)基，確定最佳的培養(yǎng)條件。
植物激素是植物細(xì)胞、組織、器官離體培養(yǎng)中必不可少的物質(zhì)，植物激素中的生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞脫分化、分裂和再分化的關(guān)鍵性激素，細(xì)胞分裂素/生長素比值高時有利于不定芽的分化，抑制根的分化。本申請人通過大量試驗，意外發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA特別適用于誘導(dǎo)百葉草不定芽。以細(xì)胞分裂素6-BA為主，配合使用較低濃度的生長素NAA可十分有效地誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽分化形成不定芽。
培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。MS培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)過程中常用的培養(yǎng)基，特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。由于其濃度較高，因此常用的是1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基。
本發(fā)明使用的1/2MS培養(yǎng)基中各組分濃度如下硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
培養(yǎng)基中加入的有機(jī)成分主要有碳水化合物、維生素、肌醇、氨基酸、天然復(fù)合物等，還包括植物激素，選自生長素類，例如NAA(萘乙酸)等，還含有細(xì)胞分裂素類(cytokinin)，這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動素)、n(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，在本發(fā)明中優(yōu)選的是6-BA。培養(yǎng)基中還包括支持物，例如瓊脂等。適當(dāng)還可加入抗生物質(zhì)抑菌。還可加入抗氧化物。
在離體快繁過程中，保證無菌狀態(tài)也很重要。對于原始的植株組織、工具和培養(yǎng)基都應(yīng)進(jìn)行消毒，例如使用70％-75％體積的酒精溶液，2％-5％體積的次氯酸溶液，0.1％-0.2％體積的升汞溶液，整個操作在無菌超凈臺中進(jìn)行。優(yōu)選使用2％體積的次氯酸升汞溶液(用0.1％---0.2％體積的升汞溶液配制)。
培養(yǎng)基中還可含有其它常規(guī)的成分，例如瓊脂糖、抗菌物質(zhì)等。這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定的。
溫度是植物離體快繁中的重要因素，所以植物離體快繁在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物離體培養(yǎng)都是在23-27℃之間進(jìn)行，一般采用25±2℃。低于15℃時培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于35℃時對植物生長不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。對于水生植物百葉草，其最適合的溫度是在20-30℃之間，最適溫度為25-27℃。在誘導(dǎo)和增殖階段優(yōu)選為25℃，在生根階段，優(yōu)選為27℃。
光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。對于水生植物百葉草，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)其水生生活環(huán)境適當(dāng)調(diào)節(jié)其光照強(qiáng)度和時間。本申請中誘導(dǎo)和增殖階段的光照強(qiáng)度為2000-4000lx，優(yōu)選為3000±250lx。在生根階段，可適當(dāng)增加光照強(qiáng)度，優(yōu)選為4000±250lx。
在不同的組織培養(yǎng)階段，光照時間視情況有所不同。一般來說，在誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生階段，百葉草對光照時間要求不嚴(yán)格，一般8-12小時/天之間即可較易誘導(dǎo)形成不定芽。而在不定芽增殖階段，光照時間適當(dāng)延長更有利。在生根階段，優(yōu)選光照強(qiáng)度為每天14個小時。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于首次建立了百葉草的離體快繁方法。并且，使用本發(fā)明的方法極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。在短時間內(nèi)可生產(chǎn)大量種苗，供應(yīng)市場，獲得經(jīng)濟(jì)效益。
下文的實施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但需要注意它們不是為了特別限定。
實施例本實驗中采用的試驗材料為上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院生物系組培實驗室提供的百葉草無菌試管苗。
實施例1不定芽誘導(dǎo)取無菌試管苗的頂芽與帶一節(jié)的莖段做為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。由于材料本身就是無菌的再生植株，因此無需滅菌。把頂芽和帶一節(jié)的莖段分別接種于供試的不同培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種時，將頂芽周圍展開的葉片切除，切取3-4mm長度，切口接觸培養(yǎng)基表面即可，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。切取帶芽莖段長約5mm，按自然生長極性扦插于培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。
不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以1/2MS(Murashige和Skoog，1962；成分為硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l)為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA(6-芐基腺嘌呤，購自上?；瘜W(xué)試劑商店，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l)和不同濃度的NAA(萘乙酸，購自上?；瘜W(xué)試劑商店，0.05mg/l，0.1mg/l)，按完全隨機(jī)組合方式，組成六種不同培養(yǎng)基，見表1。
表1 誘導(dǎo)百葉草不定芽形成的培養(yǎng)基培養(yǎng)基編號基本培養(yǎng)基 6-BA(mg/l) NAA(mg/l)1 1/2MS 0.5 0.052 1/2MS 0.5 0.103 1/2MS 1.0 0.054 1/2MS 1.0 0.10
51/2MS2.00.0561/2MS2.00.10每種培養(yǎng)基均添加蔗糖20g/l，瓊脂6g/l，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5.8，于0.11Mpa壓力和121℃溫度下滅菌25-30min。
實驗結(jié)果下文表2描述了不同培養(yǎng)基對百葉草誘導(dǎo)的影響。
表2 6-BA和NAA不同濃度組合對百葉草不定芽誘導(dǎo)的影響培養(yǎng)基編號 6-BA(mg/l) NAA(mg/l) 外植體類型 不定芽誘導(dǎo)率 不定芽誘導(dǎo)速度(％) 及誘導(dǎo)數(shù)1 0.50.05 頂芽 100 ++腋芽 100 ++2 0.50.10 頂芽 100 +++腋芽 100 +++3 1.00.05 頂芽 100 +++腋芽 100 ++4 1.00.10 頂芽 100 ++腋芽 100 ++5 2.00.05 頂芽 100 +腋芽 100 +6 2.00.10 頂芽 0-腋芽 0-*注1.“+”代表不定芽增殖量少；“++”代表不定芽誘導(dǎo)速度快，誘導(dǎo)數(shù)多；“+++”代表不定芽誘導(dǎo)速度很快，誘導(dǎo)數(shù)很多；“-”代表沒有不定芽形成。
*注2.培養(yǎng)30天的記錄結(jié)果。
試驗結(jié)果表明，6-BA和NAA不同濃度組合對外植體不定芽誘導(dǎo)有很大影響。由表3可知，在不同濃度6-BA和NAA組合的六種培養(yǎng)基中，2號培養(yǎng)基即1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)效果最好。外植體培養(yǎng)7～10后，切口處形成少量愈傷組織并有綠色芽點(diǎn)產(chǎn)生，培養(yǎng)物呈淡黃綠色。繼續(xù)培養(yǎng)20天后，愈傷組織變大，顏色由淡黃綠色變成深綠色，有大量不定芽產(chǎn)生，形成直徑大于1cm的帶有眾多芽點(diǎn)的培養(yǎng)物(見圖1)。3號培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的速度和數(shù)量略差于2號培養(yǎng)基。在1號、4號和5號培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15天后才出現(xiàn)芽點(diǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)15天后，觀察其不定芽數(shù)量明顯少于2號培養(yǎng)基(見圖2)，且培養(yǎng)物直徑不超過1cm。6號培養(yǎng)基雖能使外植體脫分化形成愈傷組織，但誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽效果不良，培養(yǎng)30天后，仍未見不定芽產(chǎn)生(見圖3)。
上述試驗結(jié)果表明，外源激素6-BA的濃度是誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽分化形成不定芽的主要影響因素。較低濃度外源激素6-BA更有利于誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽形成大量不定芽。反之，較高濃度的外源激素6-BA可能抑制不定芽的分化形成。從供試的六種培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的效果來看，1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l最有利于誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽形成大量不定芽，而1/2MS+6-BA2.0mg/l+NAA0.1mg/l由于6-BA濃度過高最不利于誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽形成大量不定芽。頂芽和腋芽兩種外植體類型對百葉草不定芽誘導(dǎo)的影響相差不大，頂芽稍優(yōu)于腋芽。
實施例2不定芽的增殖和生長在原1-6號培養(yǎng)基中的不定芽增殖和生長情況第一次繼代將在原培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，已分化形成很多不定芽的培養(yǎng)物，直接繼代培養(yǎng)于原培養(yǎng)基上。
第二次繼代由于帶有很多不定芽的培養(yǎng)物體積增大，將其進(jìn)行切割，繼代培養(yǎng)于原培養(yǎng)基上，每瓶接一塊培養(yǎng)物，每種培養(yǎng)基接8瓶。
表3顯示了不同培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響。
表3 6-BA和NAA不同濃度組合對百葉草不定芽增殖的影響培養(yǎng)基編號6-BA(mg/l) NAA(mg/l) 不定芽增殖量10.5 0.05 ++20.5 0.10 +++31.0 0.05 ++41.0 0.10 ++52.0 0.05 +62.0 0.10 -*注1.“+”代表不定芽增殖量少；“++”代表不定芽增殖量多；“+++”代表不定芽增殖量很多；“-”代表沒有不定芽形成。
*注2.培養(yǎng)50天的記錄結(jié)果由表3可知，六種不同濃度6-BA和NAA組合的培養(yǎng)基中，2號培養(yǎng)基中的不定芽增殖迅速，增殖數(shù)量最多，不定芽長勢健壯(見圖4)。3號培養(yǎng)基中不定芽增殖的效果比2號培養(yǎng)基稍差。而1、4、5號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物增殖效果遠(yuǎn)不如2號培養(yǎng)基，但其中1號培養(yǎng)基又優(yōu)于4、5號培養(yǎng)基(見圖5、6、7)。6號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物在培養(yǎng)50天后，仍未見有不定芽分化(見圖8)。由此可見，在百葉草不定芽的增殖過程中，6-BA起到關(guān)鍵性的作用，較低濃度的6-BA再配合適當(dāng)濃度的NAA有利于不定芽的迅速增殖，NAA對不定芽的生長起調(diào)節(jié)作用。
實施例3在新設(shè)計的增殖培養(yǎng)基上的不定芽增殖和生長情況由于以上六種培養(yǎng)基所增殖的不定芽數(shù)量雖多但都比較矮小，生長密集，不定芽生長速度慢；又因為在不定芽的增殖過程中，由于長期反復(fù)繼代增殖，外源激素不斷在培養(yǎng)物中積累，使外源激素和內(nèi)源激素總濃度不斷增高，造成各種畸形芽(莖)、透明芽(Vitrification)，從而影響了不定芽的質(zhì)量[5]。因此我們在不定芽增殖和生長較好的2號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)激素用量，降低了培養(yǎng)基中激素的濃度，設(shè)計了7號和8號兩種培養(yǎng)基，以便使不定芽迅速增殖并能快速生長。
第三次繼代根據(jù)培養(yǎng)物在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的增殖生長狀況，調(diào)整激素濃度，設(shè)計了兩種新的培養(yǎng)基配方用于不定芽增殖試驗，培養(yǎng)基配方見表4。
表4 誘導(dǎo)百葉草不定芽形成的培養(yǎng)基培養(yǎng)基編號 基本培養(yǎng)基6-BA(mg/l)NAA(mg/l) 6-BA/NAA7 1/2MS 0.1 0.0110∶18 1/2MS 0.3 0.0310∶1將原培養(yǎng)基2中培養(yǎng)60天的培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到7-8號培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基中不定芽增殖和生長狀況。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度24-25℃；光照強(qiáng)度3000lx；光照時間12h/d結(jié)果與分析繼續(xù)培養(yǎng)30天后，7、8號培養(yǎng)基中不定芽的增殖和生長狀況見表5表5 不同激素組合對百葉草不定芽增殖和生長的影響培養(yǎng)基 6-BA(mg/l) NAA(mg/l) 外植體 不定芽增殖量 不定芽不定芽長度≥2cm的編號 類型 長勢 平均株數(shù)/瓶7 0.1 0.01 頂芽 +++ 莖較粗，健壯 5.88 0.3 0.03 頂芽 ++++ 莖較細(xì)，纖弱，3.2輕微玻璃化*注1.“+”代表不定芽增殖量少；“++”代表不定芽增殖量多；“+++”代表不定芽增殖量很多。
*注2.培養(yǎng)90天的記錄結(jié)果培養(yǎng)結(jié)果表明，7號和8號培養(yǎng)基中不定芽的增殖數(shù)量、不定芽的生長速度和長勢都有顯著差異。7號添加了6-BA0.1mg/l和NAA0.01mg/l的培養(yǎng)基中不定芽生長速度快，不定芽明顯長高，苗株莖葉壯實，只是不定芽增殖量少于8號培養(yǎng)基，但從其增殖量來看，完全可以滿足離體快繁之需要(見圖9)。而添加了6-BA0.3mg/l和NAA0.03mg/l的8號培養(yǎng)基中不定芽增殖太多，矮小細(xì)弱，生長速度慢(見圖10)。上述實驗結(jié)果進(jìn)一步表明，6-BA和NAA的相互作用在百葉草不定芽的增殖和生長過程中起主導(dǎo)作用。6-BA很小的濃度變化都會影響不定芽增殖和生長，較低濃度的6-BA(0.1-0.5mg/l)就可實現(xiàn)不定芽的大量增殖，NAA對于不定芽生長起顯著調(diào)節(jié)作用。從以上兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果看，本試驗篩選出最有利于不定芽增殖和生長的培養(yǎng)基組成是1/2MS+6-BA0.1+NAA0.01。
此外，申請人還改變了1/2MS培養(yǎng)基中的各成分的濃度(±25％)進(jìn)行了誘導(dǎo)、增殖和生長培養(yǎng)，在該濃度范圍內(nèi)改變對于百葉草的誘導(dǎo)和增殖沒有明顯影響。
結(jié)果和討論百葉草頂芽和腋芽兩種外植體類型都可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽，從誘導(dǎo)形成不定芽的效果來看，頂芽稍優(yōu)于腋芽。
由誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽分化形成不定芽的試驗結(jié)果得出結(jié)論，外源激素6-BA的濃度是影響不定芽誘導(dǎo)的主要影響因素。較低濃度的6-BA更有利于誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽形成大量不定芽。反之，較高濃度6-BA可能抑制不定芽的分化形成。從供試的六種培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的效果來看，1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l最有利于誘導(dǎo)百葉草頂芽和腋芽形成大量不定芽。
6-BA和NAA的相互作用在百葉草不定芽的增殖和生長過程中起主導(dǎo)作用。較低濃度的6-BA(0.1-0.5mg/l)就可實現(xiàn)不定芽的大量增殖，NAA對于不定芽生長有利。本試驗篩選出最有利于不定芽增殖和生長的培養(yǎng)基組成是1/2MS+6-BA0.1+NAA0.01。
權(quán)利要求
1.一種百葉草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有1/2MS；0.25-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.02-1.5mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
2.如權(quán)利要求1所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有1/2MS；0.5mg/l芐基氨基嘌呤和0.1mg/l萘乙酸。
3.一種百葉草不定芽增殖培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有1/2 MS；0.025-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.001-0.10mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
4.如權(quán)利要求3所述的不定芽增殖培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有1/2 MS；0.05mg/l芐基氨基嘌呤和0.10mg/l萘乙酸。
5.一種百葉草離體快繁方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)將百葉草的芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20-30攝氏度下，光照強(qiáng)度為2000-4000lx，光照8-12小時/天下培養(yǎng)10-50天；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1/2MS；0.25-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.02-1.5mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％；(b)將步驟(a)產(chǎn)生的植株轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，在20-30攝氏度下，光照強(qiáng)度2000-4000lx，光照10-15小時/天條件下培養(yǎng)10-50天；所述增殖培養(yǎng)基含有1/2 MS；0.025-2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.001-0.10mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％；(c)將步驟(b)得到的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在25-30攝氏度下，光照強(qiáng)度3000-5000lx，光照12-16小時/天條件下培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基含有1/2 MS；0.05mg/l萘乙酸，所述1/2MS含有硝酸銨825mg/l，硝酸鉀950mg/l，磷酸二氫鉀85mg/l，七水硫酸鎂185mg/l，氯化鈣440mg/l，七水硫酸亞鐵27.8mg/l，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/l，四水硫酸錳22.3mg/l，四水硫酸鋅8.6mg/l，硼酸6.2mg/l，碘化鉀0.83mg/l，二水鉬酸鈉0.25mg/l，五水硫酸銅0.025mg/l，六水氯化鈷0.025mg/l，甘氨酸2mg/l，鹽酸硫胺素0.5mg/l，鹽酸吡哆素0.5mg/l，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，其中1/2MS培養(yǎng)基中各組分含量可±25％。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括在接種前消毒漂洗所述百葉草的芽；所述消毒劑選自70％-75％體積的酒精溶液，2％-5％體積的次氯酸溶液，0.1％-0.2％體積的升汞溶液。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述芽選自頂芽、腋芽、或帶有腋芽的節(jié)段。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的培養(yǎng)條件為25-27攝氏度，光照強(qiáng)度為3000±250lx，光照時間為10小時/天。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中的培養(yǎng)條件為24-25攝氏度，光照強(qiáng)度為3000±250lx，12小時/天。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中的培養(yǎng)條件是27攝氏度，光照強(qiáng)度為4000±250lx，14小時/天。
全文摘要
公開了一種百葉草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，含有1/2MS；0.25－2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.02－1.5mg/l萘乙酸。還公開了一種百葉草不定芽增殖培養(yǎng)基，含有1/2MS；0.025－2.0mg/l芐基氨基嘌呤和0.001－0.10mg/l萘乙酸。還公開了一種利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行百葉草離體快繁的方法，包括步驟(a)將百葉草的芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在20－30攝氏度下，光照強(qiáng)度為2000－4000lx，光照8－12小時/天下培養(yǎng)10－50天；(b)將步驟(a)產(chǎn)生的植株轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，在20－30攝氏度下，光照強(qiáng)度2000－4000lx，光照10－15小時/天條件下培養(yǎng)10－50天；(c)將步驟(b)得到的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，在25－30攝氏度下，光照強(qiáng)度3000－5000lx，光照12－16小時/天條件下培養(yǎng)。
文檔編號A01H4/00GK1670191SQ20041001705
公開日2005年9月21日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者婁玉霞 申請人:上海師范大學(xué)