專利名稱：節(jié)節(jié)麥高分子谷蛋白d的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii Coss.)高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的核酸序列、表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥種子中的儲藏蛋白質(zhì)是決定小麥加工品質(zhì)的重要因素。通常小麥種子儲藏蛋白質(zhì)由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組成。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同，小麥谷蛋白可以分為分子量較低的低分子谷蛋白亞基和分子量較高的高分子谷蛋白亞基。其中高分子谷蛋白亞基雖然只占小麥儲藏蛋白質(zhì)總量的10％左右，但其組成和含量是決定小麥烘烤品質(zhì)的重要因素(Gianibelli et al.，Cereal Chem.78635-646，2001)。在小麥中，高分子谷蛋白亞基由一對位于第一同源染色體群(1A，1B，1D)長臂上Glu-1位點(diǎn)的基因編碼，這兩個緊密連鎖的基因分別編碼分子量較大的x亞基和分子量較小的y亞基。利用SDS-PAGE技術(shù)，在小麥及其近緣種中已經(jīng)分離命名了一系列不同高分子谷蛋白亞基。在六倍體普通小麥中，由D基因組編碼的高分子谷蛋白亞基被認(rèn)為對小麥烘烤品質(zhì)的影響最大。對于小麥D基因組編碼的不同高分子谷蛋白亞基對小麥烘烤品質(zhì)的影響已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，目前一般公認(rèn)，編碼高分子谷蛋白Dx5+Dy10亞基的基因是優(yōu)質(zhì)基因而編碼Dx2+Dy12的基因是劣質(zhì)基因(Gupta and MacRitchie，J.Cereal Sci.1919-29，1994)。20世紀(jì)80年代以來，分子生物學(xué)手段被大量應(yīng)用于小麥高分子谷蛋白亞基的研究。一些重要的高分子谷蛋白亞基的全序列被測定，例如Dx5，Dx2等。根據(jù)這些序列，開發(fā)出一套用于擴(kuò)增高分子谷蛋白亞基編碼基因的通用引物，利用這套引物可以方便地擴(kuò)增出高分子谷蛋白亞基完整的編碼基因。利用分子生物學(xué)手段分離克隆優(yōu)質(zhì)高分子谷蛋白亞基并導(dǎo)入現(xiàn)有小麥將成為改良小麥烘烤品質(zhì)的重要手段(張發(fā)云等，中國生物工程雜志，2233-40，2002)。
節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii Coss.)是普通小麥的D基因組供體，并且節(jié)節(jié)麥具有比普通小麥D基因組更為廣泛的遺傳變異，因而成為小麥育種的重要遺傳資源。目前已經(jīng)在節(jié)節(jié)麥中發(fā)現(xiàn)許多普通小麥中不包含的新型高分子谷蛋白亞基，其中一些亞基組合例如Dtx1.5+Dty10被證明是比目前公認(rèn)的普通小麥優(yōu)質(zhì)亞基Dx5+Dy10更為優(yōu)質(zhì)的亞基組合(Pena et al.，J.Cereal Sci.2115-23，1995)。因此，分離鑒定這些優(yōu)質(zhì)亞基并通過雜交或轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其導(dǎo)入現(xiàn)有的小麥品種中，對于進(jìn)一步改良小麥的烘烤品質(zhì)具有重要的作用(Barro et al.，Nature Biotech.，14875-879，1996)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可安全食用并能改善面粉烘烤品質(zhì)的蛋白質(zhì)，它是節(jié)節(jié)麥(Ae.tauschii Coss.)高分子谷蛋白Dtx1.5亞基，并且提供編碼這種蛋白質(zhì)的核酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供能表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體和微生物，利用它們能大量生產(chǎn)出該蛋白質(zhì)，將其作為添加劑加入面粉，以改善面粉的烘烤品質(zhì)。
還有，本發(fā)明公布的高分子谷蛋白Dtx1.5亞基氨基酸序列及編碼這種蛋白質(zhì)的核酸序列為將編碼這種蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入植物并培育出良好烘烤品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明通過PCR技術(shù)，從一種節(jié)節(jié)麥(Ae.tauschii Coss.)中擴(kuò)增得到完整的編碼高分子谷蛋白Dtx1.5亞基的基因，并克隆到一種載體上，并進(jìn)行測序。通過對測序結(jié)果分析，表明獲得了一種編碼Dtx1.5的基因序列，它不同于所有已知的高分子谷蛋白亞基編碼基因的序列，是一種新的高分子谷蛋白亞基的編碼基因。
該基因的核酸序列為SEQ ID NO.1。
相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO.2。
利用上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以通過常規(guī)方法輕而易舉地設(shè)計出可以編碼這種蛋白質(zhì)的其他核酸序列。
本發(fā)明利用PCR方法從節(jié)節(jié)麥中擴(kuò)增得到編碼高分子谷蛋白的Dtx1.5亞基基因，其設(shè)計的引物序列如下P15’-ATGGCTAAGCGGTTAGTCCTP25’-CTATCACTGGCTGGACGAC本發(fā)明還提供了可以克隆含節(jié)節(jié)麥高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的DNA分子的表達(dá)載體。該表達(dá)載體可以是基因工程領(lǐng)域常用的載體，比如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、粘粒等，最優(yōu)選為質(zhì)粒。細(xì)菌質(zhì)粒是一種雙鏈，閉環(huán)的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。通常用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒包含一個抗性篩選基因、一個啟動子、一個終止子、一個位于啟動子和終止子之間多克隆位點(diǎn)和一個復(fù)制起點(diǎn)。多克隆位點(diǎn)通常由一系列相鄰的限制性酶切位點(diǎn)構(gòu)成。通過特定的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒和目的片段就可以獲得具有相同粘性末端的開環(huán)質(zhì)粒分子和目的片段，再利用連接酶對兩者進(jìn)行連接就可以獲得含有目的片段的表達(dá)載體。其中最常用的連接酶是T4 DNA連接酶。
本發(fā)明還將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物，其中的微生物是任何可以表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物，例如細(xì)菌、酵母等，其最優(yōu)選為常見的大腸桿菌，例如，大腸桿菌BL21(DE3)及其變種或突變株。導(dǎo)入微生物的方法有電轉(zhuǎn)化、氯化鈣法等。其中氯化鈣法是一種方便且高效的轉(zhuǎn)化方法從而被廣泛應(yīng)用在該領(lǐng)域。氯化鈣法是利用冰預(yù)冷的氯化鈣溶液處理細(xì)菌可以使受體菌處于一種感受態(tài)狀態(tài)，然后通過短暫的熱激過程使得外源質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌中。通常微生物中表達(dá)外源蛋白質(zhì)會受到本身負(fù)反饋而限制表達(dá)蛋白質(zhì)的量，因此在微生物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白質(zhì)時，通常要利用lacZ作為啟動子，并利用IPTG作為誘導(dǎo)劑，來提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
本發(fā)明還將經(jīng)過分離提純的蛋白質(zhì)作為添加劑添加入面粉，用于改善面粉的烘烤品質(zhì)。分離提純蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域有很多，有利用蛋白質(zhì)等點(diǎn)電性質(zhì)分離的pH梯度電泳等，有利用蛋白質(zhì)分子量性質(zhì)的分子篩、超粒性等，有利用親和性的親和層析等等?，F(xiàn)有的常用表達(dá)載體通常已經(jīng)在N端加入了用于親和純化的氨基酸序列，例如His Tag，Z Tag等等，對于特定的表達(dá)載體，利用相對應(yīng)的親和純化柱就可以方便的從菌液中大量提取外源表達(dá)蛋白質(zhì)。
Western Blot是一種利用抗原抗體免疫反應(yīng)鑒定蛋白的方法，也是目前鑒定蛋白最常用的方法。這種技術(shù)把經(jīng)電泳分離的各蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，通常是硝酸纖維膜。并利用針對特定氨基酸序列的特異性抗體作為探針檢測特定的蛋白。通常WesternBlot步驟包括轉(zhuǎn)膜，封閉，結(jié)合一抗，結(jié)合二抗，和最后的顯影定影。其中一抗是能特異與目的蛋白結(jié)合的探針，通常將目的蛋白作為抗原打入實(shí)驗(yàn)動物如小鼠，兔子等，并利用免疫反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動物中產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。


圖1為含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的pGlu15質(zhì)粒圖譜。
圖2為含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的pGlu15的微生物表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖，SQ-214為含有Dtx1.5的節(jié)節(jié)麥材料。
圖3為含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因pGlu15的微生物表達(dá)蛋白的WesternBlot分析圖，SQ-214為含有Dtx1.5的節(jié)節(jié)麥材料。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的克隆和測序按本發(fā)明的技術(shù)方案，選取含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的節(jié)節(jié)麥(Ae.tauschii Coss.，CIMMTY編號為SQ-214)材料，參照《分子克隆》(Sambrook and Russell，科學(xué)出版社，2002)，用CTAB法提取總DNA，然后采用PCR方法利用以下引物擴(kuò)增出完整的編碼高分子谷蛋白Dtx1.5亞基的基因，引物序列為P15’-ATGGCTAAGCGGTTAGTCCT
P25’-CTATCACTGGCTGGACGACPCR反應(yīng)體系為100μL，其中含有1×PCR緩沖液，dNTPs各0.2mM，引物各250ng，1個單位Ex-Taq酶(Takara Inc.產(chǎn)品)PCR擴(kuò)增條件為94℃變性4min，再94℃變性1min，65℃復(fù)性45s，72℃延伸3min30s，循環(huán)40次，最后72℃延伸7min。
PCR擴(kuò)增條帶用瓊脂糖凝膠分離，回收并克隆到pMDT-18(Takara Inc.產(chǎn)品)載體上，利用限制性內(nèi)切酶(HindIII+EcoRI)酶切確認(rèn)所獲得的克隆，進(jìn)一步構(gòu)建亞克隆并進(jìn)行測序。序列分析由Li-CoR測序儀完成，核酸序列為SEQ ID NO.1。
對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2、含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的表達(dá)載體的構(gòu)建按本發(fā)明的技術(shù)方案，選取實(shí)施例1中含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基完整編碼基因質(zhì)粒載體，利用以下引物通過PCR擴(kuò)增出加上酶切接頭的高分子谷蛋白Dtx1.5亞基的完整編碼基因，引物序列為P35’-AATGAATTCATGGCTAAGCGGTTAGTCCTP45’-ATAGTCGACCTATCACTGGCTGGACGACPCR反應(yīng)體系為100μL，其中含有1×PCR緩沖液，dNTPs各0.2mM，引物各250ng，1個單位Ex-Taq酶(Takara Inc.產(chǎn)品)PCR擴(kuò)增條件為94℃變性4min，再94℃變性1min，65℃復(fù)性45s，72℃延伸3min30s，循環(huán)40次，最后72℃延伸7min。
PCR擴(kuò)增條帶用1.5％瓊脂糖凝膠分離并回收。純化后的擴(kuò)增條帶和pET32表達(dá)載體均用EcoRI+SalI雙酶切。酶切體系為50μL，其中含有1×buffer，各10單位內(nèi)切酶和適量的質(zhì)粒DNA。酶切條件為37℃過夜。
將酶切后的擴(kuò)增條帶和pET32(Novagen Inc.產(chǎn)品)表達(dá)載體均用1.5％瓊脂糖凝膠分離，回收，并用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接體系1μL pET32載體，7μL擴(kuò)增條帶，1μL 10×連接緩沖液，和1μL T4 DNA連接酶。
利用氯化鈣法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGlu15。挑取陽性克隆并利用EcoRI+SalI雙酶切鑒定(參照附圖)，經(jīng)鑒定，結(jié)果呈陽性，含有外源插入片段。
實(shí)施例3、含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因表達(dá)載體的微生物獲得以及高分子谷蛋白Dtx1.5亞基的表達(dá)按本發(fā)明的技術(shù)方案，將實(shí)施例2中獲得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基完整編碼基因表達(dá)載體pGlu15通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)(Novagen Inc)，37℃LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至OD值為0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.5mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)5小時(陰性對照不加IPTG，其余條件均相同)。
分別取1ml經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液及陰性對照菌液，8000rpm離心2min，棄上清，用1ml PBS清洗兩次以除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)。然后加入100μL提取緩沖液，室溫裂解2min后沸水浴3min。
分別取10μL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌蛋白質(zhì)提取液及對照未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌蛋白質(zhì)提取液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其分離膠濃度為8％，濃縮膠的濃度為3％。電泳條件為10mA，14小時，電泳完畢以后，將PAGE膠用含有0.5％的考馬斯亮藍(lán)，10％醋酸和45％甲醇的染色液染色5小時，然后用含有10％醋酸和35％甲醇的脫色液脫色過夜。蛋白質(zhì)電泳顯示實(shí)施例2中獲得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因的表達(dá)載體pGlu15可以在大腸桿菌中表達(dá)高分子谷蛋白Dtx1.5亞基(圖2)。
實(shí)施例4、含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因表達(dá)載體pGlu15的微生物表達(dá)蛋白的Western Blot分析將實(shí)施例3中獲得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因表達(dá)載體pGlu15的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)以后，按實(shí)施例3中的方法提取蛋白并按以下方法進(jìn)行Western Blot分析。
首先對蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳(8％)，然后用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡凝膠，然后將凝膠與硝酸纖維模安上轉(zhuǎn)移槽，180mA轉(zhuǎn)移1小時。轉(zhuǎn)膜以后用去離子水漂洗印記膜，并用阻斷緩沖液阻斷非特異性結(jié)合點(diǎn)(1小時)。然后用TTBS漂洗印記膜10分鐘，重復(fù)三次，加一抗結(jié)合1小時，再用TTBS漂洗印記膜10分鐘，重復(fù)三次，加二抗結(jié)合1小時，再用TTBS漂洗印記膜10分鐘，重復(fù)三次。隨后對印記膜進(jìn)行顯色，顯影和定影。
其中所用試劑為硝酸纖維膜PROTRAN Nitrocellulose Transfer Membrane，Pore size 0.2um，購自Schleicher & Schuell公司。
Towbin轉(zhuǎn)移緩沖液25mmol/L Tris，192mmol/L甘氨酸pH8.3，20％乙醇。
TBS20mmol/L Tris-Cl，50mmol/L NaCl，PH7.5。
Tween-20 TBSTBS中含0.05％Tween-20。
阻斷緩沖液TTBS中含5％脫脂干奶粉。
一抗用Bal B/C小鼠免疫制備的鼠多抗血清。首先利用SDS-PAGE純化從節(jié)節(jié)麥中提取的高分子谷蛋白Dtx1.5亞基，第一次免疫后10天進(jìn)行第二次免疫，7天后第三次免疫，7天后第四次免疫，每次抗原蛋白用量約為20μg。7天后眼球取血，制備抗血清。使用時稀釋比例1∶500二抗Goat anti-Mouse IgG，F(xiàn)(ab)Fragment Speific，Peroxidase conjugate購自ImmuClub，使用時稀釋比例1∶800。
顯色液Super Signal West Pico。
膠片Kodak 5’×3’X光片。
顯影液高反差顯影液。
定影液快速定影液。
Western Blot分析顯示利用天然的從節(jié)節(jié)麥中提取的高分子谷蛋白Dtx1.5亞基制備的抗體可以與實(shí)施例3中含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因表達(dá)載體pGlu15的大腸桿菌BL21(DE3)的表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合，因此證明實(shí)施例3中從含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因表達(dá)載體pGlu15的大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的外源蛋白確實(shí)是天然的高分子谷蛋白Dtx1.5亞基(圖3)。
實(shí)施例5、利用表達(dá)載體pGlu15表達(dá)的高分子量谷蛋白Dtx1.5亞基改良面粉的品質(zhì)。
將實(shí)施例3中獲得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基編碼基因表達(dá)載體pGlu15的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)LPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用His-Tag親和柱層析提純高分子谷蛋白Dtx1.5亞基。將提純后的高分子谷蛋白Dtx1.5亞基按一定比例添加入現(xiàn)有面粉中，一般加入量為面粉重量的1％左右，并進(jìn)行品質(zhì)分析。品質(zhì)分析結(jié)果表明，添加有高分子谷蛋白Dtx1.5亞基的面粉比原有面粉的品質(zhì)(如SDSS、面粉團(tuán)流變性質(zhì)等)均有較大的改善。
SEQ ID NO.1ATGGCTAAGCGGTTAGTCCTCTTTGTGGCGGTAGTCGTTGCCCTCGTGGCTCTCACCGTCGCTGAAGGTGAGGCCTCTGAGCAACTACAGTGTGAGCGCGAGCTCCAGGAGCTCCAGGAGCGCGAGCTCAAGGCATGCCAGCAGGTCATGGACCAGCAGCTCCGAGACATTAGCCCCGAGTGCCACCCCGTCGTCGTCAGCCCGGTCGCGGGACAATACGAGCAGCAAATCGTGGTGCCGCCCAAGGGCGGATCTTTCTACCCCGGCGAGACCACGCCACCGCAGCAACTCCAACAACGTATATTTTGGGGAATACCTGCACTACTAAAAAGGTATTACCCAAGTGTAACTTCTCCGCAGCAGGTTTCATACTATCCAGGCCAAGCTTCTCCGCAACGGCCAGGACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAATCAGGACAAGGACAGCAAGGGTACTATCCAACTTCTCCGCAACAGCCAGGACAAAAGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAGCCAGAACAAGAGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGATACTATCCAACTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAGCAAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTCCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGGCACTACCCAGCTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGACAGCCAGGACAAAGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACATCCAGAACAAGGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTATCCAACTTCTCCACAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAACTTCTTCGCAGCAGCCAACACAATCGCAGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGGTAGGACAAGGGCAACAAGCTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACGAGGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCTAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAGCAGCCAGGACAATTGCAACAATCAGCACAAGGGCAAAAAGGGCAGCAACCAGGGCAAGGTCAACAGCCAGGGCAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAACCGGGGCAAGGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAATCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACCAGGATACTACCCAACTTCTCCGTTGCAGCCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACGACCCAACTTCTCCGCAACAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCAGGACAATTGCAACAACCAGCACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACTAGCACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACCAGCACAAGTGCAACAAGAGCAGCAGCCAGCACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCTAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACCAGCACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACAAGGGCAGC
CATGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGGAGTCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCTAACTTCTCCGTTGCAGCTAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTGCAACAACCAGGACAAGGGCGGCAACCAGGACAATGGCAACAATCGGGACAAGGGCAACATGAGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCTGTCAGGACAAGGGCAACGGCCAGGACAATGGCTGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAACAGTCAGGACAAGGGCAACAACTAGGACAATGGCTGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTGCAACAGACAGGACAAGGGCAGCAATCAGGACAAGGGCAACAAGGCTACTACAGCTCATACCATGTTAGCGTGGAGCACCAGGCGGCCAGCCTAAAGGTGGCAAAGGCGCAGCAGCTCGCGGCACAGCTGCCGGCAATGTGCCGGCTGGAGGGCGGCGACGCATTGTCGTCCAGCCAGTGATAGSEQ ID NO.2MAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEAS EQLQCERELQELQERELKACQQVMDQQLRDISPECHPVVVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQRIFWGIPALLKRYYPSVTSPQQVSYYPGQASPQRPGQGQQPGQGQQSGQGQQGYYPTSPQQPGQKQQPGQGQQPEQEQQPGQGQQGYYPTSLQQPGQGQQQGQGQQGYYPTSLQQPGQGQQGHYPASLQQPGQGQPGQRQQPGQGQHPEQGQQPGQGQQGYYPTSPQQPGQGQQPGQGQPGYYPTSPQQSGQGQPGYYPTSSQQPTQSQQPGQGQQGQQVGQGQQAQQPGQGQQPGRGQPGYYPTSPQQSGQGQPGYYLTSPQQSGQGQQPGQLQQSAQGQKGQQPGQGQQPGQGQQGQQPGQGQQGQQPGQGQPGYYPTSPQQSGQGQQPGQWQQPGQGQPGYYPTSPLQPGQGQPGYDPTSPQQPGQGQQPGQLQQPAQGQQGQQLAQGQQGQQPAQVQQEQQPAQGQQGQQLGQGQQGQQPGQGQQGQQPAQGQQGQQPGQGQQGQQPGQGQQPGQGQPWYYPTSPQESGQGQQPGQWQQPGQGQPGYYLTSPLQLGQGQQGYYPTSLQQPGQGRQPGQWQQSGQGQHEYYPTSPQLSGQGQRPGQWLQPGQGQQGYYPTSPQQSGQGQQLGQWLQPGQGQQGYYPTSLQQTGQGQQSGQGQQGYYSSYHVSVEHQAASLKVAKAQQLAAQLPAMCRLEGGDALSSSQ
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于所述的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核酸，其特征在于該核酸具有SEQ ID NO.1的序列。
3.一種包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體，其特征在于該載體是質(zhì)粒、病毒、噬菌體、或粘粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于該載體是質(zhì)粒pET32。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的微生物，其特征在于該微生物是大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物，其特征在于該微生物是大腸桿菌BL21(DE3)及其變種或突變株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其特征在于所述大腸桿菌轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求3或4的表達(dá)載體。
8.一種構(gòu)建包含權(quán)利要求2所述核酸的表達(dá)載體的方法，其特征在于把權(quán)利要求2的核酸克隆到載體。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的方法，其特征在于利用權(quán)利要求5所述的微生物表達(dá)蛋白質(zhì)，然后分離提純蛋白質(zhì)。
10.一種提高面粉烘烤品質(zhì)的方法，其特征在于利用權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)蛋白質(zhì)，分離提純后添加到面粉中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于小麥野生近緣種節(jié)節(jié)麥的高分子谷蛋白D
文檔編號A01H5/00GK1513873SQ0314181
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者盧寶榮, 陸春明, 楊武云 申請人:復(fù)旦大學(xué)