專利名稱：一種抗sars病毒真菌的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食用真菌的培養(yǎng)方法，具體地說涉及一種具有抗SARS病毒作用的真菌——多孔菌(Polyporales)的培養(yǎng)方法。
背景技術：
關于抗SARS病毒作用的真菌——多孔菌(Polyporales)的培養(yǎng)方法，經(jīng)檢索到的相關專利有中國專利申請?zhí)枮?5103492裂褶菌的培養(yǎng)工藝及其利用，90102115微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖溶液，92102469食用菌與中草藥混合發(fā)酵釀造新工藝，93102723含茯苓菌絲及其提取物的制劑及其制備方法，93104737食用菌與中草藥混合發(fā)酵釀造的產(chǎn)品及其方法，94111624.7液體發(fā)酵生產(chǎn)雞樅菌菌絲體的方法，99112556.8灰樹花發(fā)酵液多糖提取方法，02136517.2灰樹花發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法等專利，這些專利內(nèi)容大多以常規(guī)方法進行菌體的培養(yǎng)、發(fā)酵以及進行其培養(yǎng)物的提取，其提取制備的活性物質主要用于抗腫瘤、抗高血壓、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等目的，但其提取物對于病毒抑制作用以及在動物及人體中抗病毒的療效鮮有報道。近來，SARS病毒肆虐，對人有極強的傳染性，給人民的生命財產(chǎn)造成嚴重損失，由于SARS病毒是一種冠狀病毒變種，之前從未在人類或動物身上發(fā)現(xiàn)，是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，因此對它的性質、特點，哪個階段病毒傳染性最強，何種體液病毒含量最高，何種物質能夠預防和抑制，何種藥物能夠治療和控制等課題都成為現(xiàn)在研究的重點；其中在預防和抑制SARS病毒的藥物開發(fā)中，利用改良和變換培養(yǎng)條件，對食用真菌——多孔菌(Polyporales)進行特化培養(yǎng)，使多孔菌產(chǎn)生抗SARS病毒活性物質的培養(yǎng)方法，經(jīng)過文獻和專利檢索，國內(nèi)外還未見相關報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題是，針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種具有抗SARS病毒作用的真菌——多孔菌(Polyporales)的培養(yǎng)方法。該方法具有工藝簡便、生長量大、成本低廉的特點，并且利用本發(fā)明培養(yǎng)的多孔菌所提取的粗提物對SARS病毒具有完全的抑制作用，并且對正常細胞具有保護作用。
本發(fā)明的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其步驟順序如下(1)菌種選擇選用多孔菌(Polyporales)中灰樹花(Grifola frondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹靈芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)之一，但不僅只限于此菌種；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于pH值調(diào)整為3～12的固體斜面培養(yǎng)基上，15～30℃條件下培養(yǎng)菌體2～5天；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無菌條件下，用接種針取1～10塊每塊大小為1cm2的斜面培養(yǎng)菌種塊，加入每瓶裝有100～300ml液體培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶內(nèi)，pH值調(diào)整為3～12，15～30℃條件下，在旋轉搖床上培養(yǎng)，轉速80～220r/min，培養(yǎng)5～10天，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接一級種子于裝有10～20L液體培養(yǎng)基的30L種子罐內(nèi)，pH值調(diào)整為3～12，15～30℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為120～220r/min，通氣量為1∶(0.2～1.5)v/v min，罐壓控制在0.2～0.5Kg/cm2，培養(yǎng)時間為3～10天，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接二級種子于裝有200～300L液體培養(yǎng)基的500L的發(fā)酵罐內(nèi)，pH值調(diào)整為3～12，15～30℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為160～220r/min，通氣量為1∶(1.0～1.5)v/v min，罐的壓力控制在0.3～0.6Kg/cm2，培養(yǎng)時間為5～10天，即得包括菌絲體與澄清液的多孔菌菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液；(6)收集菌體在5000轉/分條件下離心5～8分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2～3次；再將菌體置于20～100mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7～9，測定真菌菌株液體發(fā)酵生物量菌球數(shù)量(個/100ml)，菌絲體鮮重(g/100ml)，菌絲體干重(g/100ml)；上述所用固體斜面培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入谷物類淀粉或玉米面或黃豆粉或馬鈴薯淀粉或麩皮5～30克、酵母膏或酵母粉1～10克、蛋白胨1～20克、磷酸二氫鉀0.1～2克、硫酸鎂0.1～5克、葡萄糖或蔗糖10～40克；pH值調(diào)整為3～12。
上述步驟(1)中所述的菌種選擇灰樹花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株、ATCC48141菌株、ATCC60301菌株、薄樹靈芝(Ganoderma capense)ATCC76613菌株之一。
上述步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是20～25℃。
上述步驟(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)時間是6～8天。
上述步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的pH值調(diào)整為4～10。
上述步驟(3)中所述的旋轉搖床培養(yǎng)其轉速為130～200r/min。
上述步驟(4)中所述的攪拌速度為150～200r/min。
上述步驟(4)中所述的通氣量為1∶(0.5～1.2)v/v min。
上述步驟(4)、(5)中所述的罐壓控制在0.3～0.5Kg/cm2。
上述固體斜面培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入玉米淀粉或玉米面或黃豆粉5～20克、酵母膏或酵母粉1～6克、蛋白胨1～10克、磷酸二氫鉀0.1～2克、硫酸鎂0.1～5克、葡萄糖或蔗糖10～25克；pH值調(diào)整為4～10。使用時，蒸汽壓力控制在0.15Mpa條件下，高壓滅菌20分鐘。
采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法所具有的突出效果是1)通過二級制種，利用改良和變換培養(yǎng)條件，用合理的培養(yǎng)基配方，對食用真菌——多孔菌(Polyporales)進行特化培養(yǎng)，提高了種子的細胞密度，從而提高了單位體積的接種量，使菌體生長和強壯的發(fā)育得到了有利的保證，并且還避免了過長的培養(yǎng)時間，避免長時間培養(yǎng)可能帶來的污染。
2)利用本發(fā)明的方法具有工藝簡便、生長量大、得率高、成本低廉的特點，并且，開創(chuàng)了高效而經(jīng)濟的食用真菌——多孔菌(Polyporales)的特化培養(yǎng)新技術，具備工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和可放大性，具有很好的經(jīng)濟效益和應用前景。
3)采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法提取的多孔菌粗提物，經(jīng)軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所體外抗SARS病毒藥物初篩試驗，結果顯示對SARS病毒具有完全的抑制作用，并且對正常細胞具有保護作用。
所作體外抗SARS病毒藥物初篩試驗的具體方法如下I、實驗材料1、細胞VetoE6細胞(非洲綠猴腎細胞)2、病毒SARS病毒，BJ-01株3、培養(yǎng)液含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液II、實驗條件生物安全三級實驗室III、實驗步驟1、CPE法測定病毒對VeroE6細胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)2、CPE法結合MTT法確定藥物對細胞的無毒濃度3、藥物的最大無毒濃度對SARS病毒的藥效測定IV、實驗結果1、病毒的TCID50為10-7。
2、藥物取5個濃度即1000、500、250、125和62.5ug/ml進行細胞毒性測定，每濃度做4個復孔，同時設細胞對照。結果顯示最大無毒濃度為125ug/ml。
3、取125ug/ml藥液，做4個復孔，觀察對SARS病毒的抑制作用。試驗設病毒對照和細胞對照。結果顯示該濃度藥物對SARS病毒有完全抑制作用。
下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說明。
具體實施方式
實施例1(1)菌種選擇選用多孔菌(Polyporales)中灰樹花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株無菌接種于pH值調(diào)整為4的固體斜面培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)菌體5天；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種針取8塊每塊大小為1cm2的斜面培養(yǎng)菌種塊，加入每瓶裝有300ml液體培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶內(nèi)，pH值調(diào)整為7，27℃條件下，在旋轉搖床上培養(yǎng)，轉速180r/min，培養(yǎng)8天，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接一級種子于裝有20L液體培養(yǎng)基的30L種子罐內(nèi)，pH值調(diào)整為9，27℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為220r/min，通氣量為1∶0.5v/v min，罐壓控制在0.3Kg/cm2，培養(yǎng)時間為7天，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接二級種子于裝有300L液體培養(yǎng)基的500L的發(fā)酵罐內(nèi)，pH值調(diào)整為10，30℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為220r/min，通氣量為1∶1.0v/v min，罐的壓力控制在0.5Kg/cm2，培養(yǎng)時間為7天，即得包括菌絲體的多孔菌菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液；(6)收集菌體在5000轉/分條件下離心8分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；再將菌體置于50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7.5，測定真菌菌株液體發(fā)酵生物量菌球數(shù)量為2385個/100ml，菌絲體鮮重為12.20g/100ml，菌絲體干重為0.6755g/100ml。菌體形狀為圓形或橢圓形，菌體顏色為乳黃色。
上述固體斜面培養(yǎng)基的配方是1000毫升蒸餾水中加入玉米淀粉15克、酵母膏4克、蛋白胨8克、磷酸二氫鉀1.2克、硫酸鎂3.5克、葡萄糖15克；pH值調(diào)整為4。使用時，蒸汽壓力控制在0.15Mpa條件下，高壓滅菌20分鐘。
上述液體培養(yǎng)基的配方是1000毫升蒸餾水中加入黃豆粉20克、酵母粉6克、蛋白胨4克、磷酸二氫鉀1.6克、硫酸鎂1.5克、蔗糖12克；pH值調(diào)整為7。使用時，蒸汽壓力控制在0.15Mpa條件下，高壓滅菌20分鐘。
實施例2(1)菌種選擇選用多孔菌(Polyporales)中薄樹靈芝(Ganoderma capense)ATCC76613菌株；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株無菌接種于pH值調(diào)整為6的固體斜面培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)菌體3天；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種針取5塊每塊大小為1cm2的斜面培養(yǎng)菌種塊，加入每瓶裝有300ml液體培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶內(nèi)，pH值調(diào)整為7.5，27℃條件下，在旋轉搖床上培養(yǎng)，轉速130r/min，培養(yǎng)6天，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接一級種子于裝有20L液體培養(yǎng)基的30L種子罐內(nèi)，pH值調(diào)整為7，25℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為200r/min，通氣量為1∶0.9v/v min，罐壓控制在0.4Kg/cm2，培養(yǎng)時間為10天，即得包括菌絲體與澄清液的多孔菌菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液；(5)收集菌體在5000轉/分條件下離心6分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌體置于30mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至8.5，測定真菌菌株液體發(fā)酵生物量菌球數(shù)量為3360個/100ml，菌絲體鮮重為11.19g/100ml，菌絲體干重為0.6246g/100ml。菌體形狀為圓形或橢圓形，菌體顏色為咖啡色。
上述所用固體斜面培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入馬鈴薯淀粉25克、酵母膏10克、蛋白胨10克、磷酸二氫鉀2克、硫酸鎂0.7克、蔗糖10克；pH值調(diào)整為6。
上述所用液體培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入玉米面12克、酵母粉8克、蛋白胨7克、磷酸二氫鉀0.8克、硫酸鎂4.6克、葡萄糖24克；pH值調(diào)整為7.5。
使用時，蒸汽壓力控制在0.15Mpa條件下，高壓滅菌20分鐘。
實施例3(1)菌種選擇選用多孔菌(Polyporales)中灰樹花(Grifola frondosa)ATCC48141菌株；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株無菌接種于pH值調(diào)整為7的固體斜面培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)菌體2天；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種針取10塊每塊大小為1cm2的斜面培養(yǎng)菌種塊，加入每瓶裝有200ml液體培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶內(nèi)，pH值調(diào)整為7.5，30℃條件下，在旋轉搖床上培養(yǎng)，轉速200r/min，培養(yǎng)9天，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接一級種子于裝有20L液體培養(yǎng)基的30L種子罐內(nèi)，pH值調(diào)整為8，25℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為160r/min，通氣量為1∶1.2v/v min，罐壓控制在0.5Kg/cm2，培養(yǎng)時間為8天，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接二級種子于裝有300L液體培養(yǎng)基的500L的發(fā)酵罐內(nèi)，pH值調(diào)整為7.5，30℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為180r/min，通氣量為1∶1.5v/v min，罐的壓力控制在0.5Kg/cm2，培養(yǎng)時間為7天，即得包括菌絲體與澄清液的多孔菌菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液；(6)收集菌體在5000轉/分條件下離心8分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；再將菌體置于70mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7.5，測定真菌菌株液體發(fā)酵生物量菌球數(shù)量為2340個/100ml，菌絲體鮮重為13.65g/100ml，菌絲體干重為0.5086g/100ml。菌體形狀為圓形或橢圓形，菌體顏色為乳黃色。
上述所用固體斜面培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入馬鈴薯淀粉15克、黃豆粉5克、酵母膏3克、蛋白胨15克、磷酸二氫鉀1.7克、硫酸鎂3.7克、蔗糖14克；pH值調(diào)整為7。
上述所用液體培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入玉米面6克、馬鈴薯淀粉8克、酵母膏6克、蛋白胨9克、磷酸二氫鉀1.8克、硫酸鎂1.6克、葡萄糖14克；pH值調(diào)整為7.5。
使用時，蒸汽壓力控制在0.15Mpa條件下，高壓滅菌20分鐘。
權利要求
1.一種抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其步驟順序如下(1)菌種選擇選用多孔菌(Polyporales)中灰樹花(Grifola frondosa)、靈芝(Ganoderma lucidum)、桑黃(Phellinus ignirius)、薄樹靈芝(Ganodermacapense)、香栓菌(Trametes suaveloens)之一，但不僅只限于此菌種；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于pH值調(diào)整為3～12的固體斜面培養(yǎng)基上，15～30℃條件下培養(yǎng)菌體2～5天；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種針取1～10塊每塊大小為1cm2的斜面培養(yǎng)菌種塊，加入每瓶裝有100～300ml液體培養(yǎng)基的500mL三角搖瓶內(nèi)，pH值調(diào)整為3～12，15～30℃條件下，在旋轉搖床上培養(yǎng)，轉速80～220r/min，培養(yǎng)5～10天，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接一級種子于裝有10～20L液體培養(yǎng)基的30L種子罐內(nèi)，pH值調(diào)整為3～12，15～30℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為120～220r/min，通氣量為1∶(0.2～1.5)v/v min，罐壓控制在0.2～0.5Kg/cm2，培養(yǎng)時間為3～10天，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為液體培養(yǎng)基1/10～1/20的接種量，接二級種子于裝有200～300L液體培養(yǎng)基的500L的發(fā)酵罐內(nèi)，pH值調(diào)整為3～12，15～30℃條件下培養(yǎng)，攪拌速度為160～220r/min，通氣量為1∶(1.0～1.5)v/v min，罐的壓力控制在0.3～0.6Kg/cm2，培養(yǎng)時間為5～10天，即得包括菌絲體與澄清液的多孔菌菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液；(6)收集菌體在5000轉/分條件下離心5～8分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2～3次；再將菌體置于20～100mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7～9，測定真菌菌株液體發(fā)酵生物量菌球數(shù)量(個/100ml)，菌絲體鮮重(g/100ml)，菌絲體干重(g/100ml)；上述所用固體斜面培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入谷物類淀粉或玉米面或黃豆粉或馬鈴薯淀粉或麩皮5～30克、酵母膏或酵母粉1～10克、蛋白胨1～20克、磷酸二氫鉀0.1～2克、硫酸鎂0.1～5克、葡萄糖或蔗糖10～40克；pH值調(diào)整為3～12。
2.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的菌種選擇灰樹花(Grifola frondosa)ATCC48688菌株、ATCC48141菌株、ATCC60301菌株、薄樹靈芝(Ganoderma capense)ATCC76613菌株之一。
3.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是20～25℃。
4.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)時間是6～8天。
5.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的pH值調(diào)整為4～10。
6.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中所述的旋轉搖床培養(yǎng)其轉速為130～200r/min。
7.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中所述的攪拌速度為150～200r/min。
8.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)中所述的通氣量為1∶(0.5～1.2)v/v min。
9.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)、(5)中所述的罐壓控制在0.3～0.5Kg/cm2。
10.如權利要求1所述的抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的固體斜面培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基配方是1000毫升蒸餾水中加入谷物類淀粉或玉米面或黃豆粉5～20克、酵母膏或酵母粉1～6克、蛋白胨1～10克、磷酸二氫鉀0.1～2克、硫酸鎂0.1～5克、葡萄糖或蔗糖10～25克；pH值調(diào)整為4～10。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗SARS病毒真菌的培養(yǎng)方法，該方法包括(1)菌種選擇，(2)斜面培養(yǎng)，(3)一級種子培養(yǎng)，(4)擴大培養(yǎng)，(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)，(6)收集菌體等步驟；該方法具有工藝簡便、生長量大、得率高、成本低廉的特點，并且利用本發(fā)明培養(yǎng)的多孔菌所提取的粗提物對SARS病毒具有完全的抑制作用，具有很好的社會效益和應用前景。
文檔編號A01G1/04GK1487077SQ03138980
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月5日 優(yōu)先權日2003年8月5日
發(fā)明者宋愛榮, 隋方功, 趙晨, 田雪梅 申請人:萊陽農(nóng)學院