專利名稱：食品級(jí)異源分泌表達(dá)Ⅱa類細(xì)菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程菌及其應(yīng)用，特別涉及食品級(jí)異源分泌表達(dá)IIa類細(xì)菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食品在加工和保藏過程中，極易受到微生物污染而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，采用防腐劑抑制微生物，延緩腐敗是當(dāng)今食品保鮮的重要技術(shù)之一。據(jù)FDA估算，世界上每年約有20% 以上的食品因微生物腐敗而浪費(fèi)，損失高達(dá)170億美元。我國常用的防腐劑有30多種，年生產(chǎn)消耗約12萬噸，價(jià)值約50多億元，是一個(gè)相當(dāng)大的產(chǎn)業(yè)，對(duì)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展有較大影響。 按國家批準(zhǔn)的使用范圍和以1%。的比例添加，相當(dāng)于預(yù)防了 5000萬噸食品腐敗變質(zhì)。然而， 食品中使用的大多是化學(xué)防腐劑，影響人體健康，它的應(yīng)用越來越受到眾多國家的限制。天然生物防腐劑具有安全、無毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此，開發(fā)高效廣譜食品生物防腐劑已成為現(xiàn)代食品工業(yè)的重要任務(wù)。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有無毒、無殘留，高效、耐酸、耐高溫、無抗藥性等特點(diǎn)，目前已成為天然防腐劑研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。II a類細(xì)菌素，是細(xì)菌素中數(shù)量最多且研究最為深入的一群，主要包括腸球菌素(enterocin)、片球菌素(pediocin)等小分子細(xì)菌素。這類細(xì)菌素不僅抑制某些腐敗乳酸菌、索絲菌(Brochotrix spp.)、梭狀桿菌(Clostridium spp·)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)等，而且對(duì)食源性病原菌單增李斯特氏菌 (Listeria monocylogenes)有強(qiáng)烈的抑制作用，具有很好的控制食品腐敗菌及病原菌的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，與其它細(xì)菌素相比，II a類細(xì)菌素的抑菌活性較強(qiáng)且具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，是目前公認(rèn)的最有希望應(yīng)用于多種工業(yè)用途的細(xì)菌素。近年來，構(gòu)建乳酸菌食品級(jí)異源表達(dá)系統(tǒng)，探究一些有巨大應(yīng)用前景的IIa類細(xì)菌素基因在乳酸菌中的克隆和表達(dá)已成為乳酸菌細(xì)菌素分子遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。然而傳統(tǒng)的乳酸菌表達(dá)載體大多以紅霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記，雖然這為遺傳操作時(shí)保持一定的選擇壓力并有效選擇轉(zhuǎn)化子，但是將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動(dòng)物體內(nèi)，由于存在抗性因子轉(zhuǎn)移的隱患，可能帶來生物安全性的嚴(yán)重后果，所以從食品安全角度考慮，含抗生素抗性基因標(biāo)記的微生物不能應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。而為了防止使用抗生素抗性標(biāo)記所引起的危害，最有效的辦法是使用對(duì)人體安全的食品級(jí)篩選標(biāo)記替代抗生素抗性標(biāo)記以構(gòu)建食品級(jí)受體及載體系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備產(chǎn)細(xì)菌素的基因工程菌方法。本發(fā)明所提供的制備產(chǎn)細(xì)菌素的基因工程菌方法，包括如下步驟將細(xì)菌素的編碼基因?qū)胨拗骶玫街亟M菌；從所述重組菌中獲得表達(dá)所述細(xì)菌素的基因工程菌；所述細(xì)菌素的氨基酸序列如序列表中序列3所示。所述細(xì)菌素的編碼基因?yàn)槿缦翧)或B)所示A)所述細(xì)菌素的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子；B)所述細(xì)菌素的編碼基因?yàn)槿缦?)或5)或6)中任一所述的DNA分子4)序列表中的序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；6)與4)或5)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。所述宿主菌為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。所述細(xì)菌素的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌的。所述重組表達(dá)載體為將所述細(xì)菌素的編碼基因插入表達(dá)載體PLEB590的BamHI和 XhoI酶切位點(diǎn)之間得到的重組表達(dá)載體。由所述方法制備得到的基因工程菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因工程菌在制備細(xì)菌素中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備頭細(xì)菌素的方法。本發(fā)明所提供的制備頭細(xì)菌素的方法，包括如下步驟發(fā)酵所述基因工程菌，即得到細(xì)菌素。所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為GM17液體培養(yǎng)基；所述發(fā)酵的溫度為30°C -37°C或37°C或30°C或34°C ；所述發(fā)酵的時(shí)間為18小時(shí)-32小時(shí)或18小時(shí)-24小時(shí)；所述發(fā)酵的接種量的體積百分比為1%。所述方法在所述發(fā)酵之后，還包括從發(fā)酵液上清中分離純化得到所述細(xì)菌素的步驟；所述分離純化的方法包括以下步驟(a)將發(fā)酵液上清用80%飽和度硫酸銨沉淀鹽析，收集沉淀，得到細(xì)菌素粗提物；(b)將步驟(a)得到的細(xì)菌素粗提物進(jìn)行凝膠過濾層析，用0. 02mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集具有抑菌活性的洗脫液，即得到為初純細(xì)菌素樣品；所述凝膠過濾層析中采用的凝膠柱的型號(hào)為Si^phadex G-IO ；(c)將步驟(b)收集的洗脫液進(jìn)行陽離子交換柱層析，用含0M-1M NaCl的 0. 02mol/L醋酸緩沖液進(jìn)行線性洗脫，收集具有抑菌活性的洗脫液，即得到細(xì)菌素；所述陽離子交換柱層析中采用的陽離子交換柱的型號(hào)為SP Sepharose Fast Flow ；所述線性梯度洗脫中NaCl的濃度在40min-60min或40min或50min或60min分鐘內(nèi)由OM線性升至1M。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)II a類細(xì)菌素的基因工程乳酸乳球菌，可實(shí)現(xiàn)II a類細(xì)菌素的超量表達(dá)、連續(xù)生產(chǎn)和快速檢測(cè)。利用該基因工程乳酸乳球菌，可從每IOOOmL該基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取純化到5. 66mg,比活力為5. 12X 105AU/mg的細(xì)菌素 enterocin P。同時(shí)，對(duì)該重組菌以選擇壓力物質(zhì)nisin進(jìn)行篩選，nisin是公認(rèn)安全的天然食品防腐劑，且nisi基因來源于乳酸菌自身，這使得將nisi基因作為乳酸菌食品級(jí)篩選標(biāo)記更有優(yōu)勢(shì)。


圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒pLEB590-sEntPl和pLEB590_sEntP2的構(gòu)建過程圖。圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定電泳圖。圖3為重組乳酸乳球菌的生長曲線圖。圖4為純化后細(xì)菌素的Tricine SDS-PAGE及抑菌活性檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、生產(chǎn)細(xì)菌素的基因工程乳酸乳球菌的構(gòu)建及其應(yīng)用一、生產(chǎn)細(xì)菌素的基因工程乳酸乳球菌的構(gòu)建1、Enterocin P編碼基因的克隆1)引物設(shè)計(jì)與合成依據(jù)質(zhì)粒pLEB590的多克隆位點(diǎn)(MCS)及GenBank中已知編碼細(xì)菌素enterocinP 的核昔酸序列(Original accession number :AF005726. 1) (enterocin P 的氛基酸序列如序列表中序列3所示)，在Primer 5. 0上設(shè)計(jì)引物并插入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)(BamHI和 XhoI)，見表 1。表IPCR擴(kuò)增enterocin P編碼基因引物及產(chǎn)物
權(quán)利要求
1.一種制備產(chǎn)細(xì)菌素的基因工程菌方法，包括如下步驟將細(xì)菌素的編碼基因?qū)胨拗骶玫街亟M菌；從所述重組菌中獲得表達(dá)所述細(xì)菌素的基因工程菌；所述細(xì)菌素的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌素的編碼基因?yàn)槿缦翧)或B)所示A)所述細(xì)菌素的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)或2)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子；B)所述細(xì)菌素的編碼基因?yàn)槿缦?)或5)或6)中任一所述的DNA分子4)序列表中的序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；6)與4)或5)的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述宿主菌為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌素的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將所述細(xì)菌素的編碼基因插入表達(dá)載體PLEB590的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。
6.由權(quán)利要求1-5中任一所述的方法制備得到的基因工程菌。
7.權(quán)利要求6所述的基因工程菌在制備細(xì)菌素中的應(yīng)用。
8.一種制備細(xì)菌素的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求6所述的基因工程菌，即得到細(xì)菌素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為30°C -37°C或37°C或30°C或34°C ；所述發(fā)酵的時(shí)間為18小時(shí)-32小時(shí)或18小時(shí)-24小時(shí)；所述發(fā)酵的接種量的體積百分比為1%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法在所述發(fā)酵之后，還包括從發(fā)酵液上清中分離純化得到所述細(xì)菌素的步驟； 所述分離純化的方法包括以下步驟(a)將發(fā)酵液上清用80%飽和度硫酸銨沉淀鹽析，收集沉淀，得到細(xì)菌素粗提物；(b)將步驟(a)得到的細(xì)菌素粗提物進(jìn)行凝膠過濾層析，用0.02mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集具有抑菌活性的洗脫液，即得到為初純細(xì)菌素樣品；所述凝膠過濾層析中采用的凝膠柱的型號(hào)為S印hadex G-IO ；(c)將步驟(b)收集的洗脫液進(jìn)行陽離子交換柱層析，用含0M-1MNaCl的0. 02mol/L 醋酸緩沖液進(jìn)行線性洗脫，收集具有抑菌活性的洗脫液，即得到細(xì)菌素；所述陽離子交換柱層析中采用的陽離子交換柱的型號(hào)為SP Sepharose Fast Flow ；所述線性梯度洗脫中NaCl 的濃度在40min-60min或40min或50min或60min內(nèi)由OM線性升至1M。
全文摘要
本發(fā)明公開了食品級(jí)異源分泌表達(dá)IIa類細(xì)菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種基因工程菌，本發(fā)明所提供的基因工程菌，為將含有DNA分子I的DNA片段導(dǎo)入宿主菌得到的基因工程菌；所述DNA分子I如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)IIa類細(xì)菌素的基因工程乳酸乳球菌，可實(shí)現(xiàn)II a類細(xì)菌素的超量表達(dá)、連續(xù)生產(chǎn)和快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102260689SQ20111014378
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者劉國榮, 尚楠, 張寶, 張香美, 李平蘭, 陳尚武, 馬世敏 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)