專利名稱：非特異免疫激活劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及厭氧微生物應(yīng)用技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種生物制劑——非特異免疫激活劑的制備方法，其屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在當(dāng)前的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，普遍存在過度追求產(chǎn)量、忽視質(zhì)量的現(xiàn)象。結(jié)果導(dǎo)致養(yǎng)殖密度過大，水質(zhì)污染加重，從而造成病害時(shí)常發(fā)生，特別是近幾年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中病毒病大規(guī)模暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此控制疾病的發(fā)生對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。在水產(chǎn)病害防治領(lǐng)域中，傳統(tǒng)上是采用抗生素來防治和控制病害的發(fā)生。這樣的傳統(tǒng)做法存在諸多弊端，如濫用抗生素而造成抗生素污染，進(jìn)而使病害生物產(chǎn)生抗藥性，或者由于濫用藥物，而造成藥物殘留超標(biāo)等負(fù)面效應(yīng)。單純靠抗生素藥物對(duì)防治病毒病是根本沒有效果的。再由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的自身免疫的非特異性特點(diǎn)，特別是蝦貝類皆為無脊椎動(dòng)物，因此不具有特異性免疫系統(tǒng)，不能針對(duì)特定的病原產(chǎn)生抗體。因而在水產(chǎn)病害防治中，幾乎不能應(yīng)用疫苗來防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病毒病。用現(xiàn)有的技術(shù)方法防治病毒病存在缺陷。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有關(guān)免疫激活劑的研究與應(yīng)用，在國際上目前都還處在初始階段，許多技術(shù)不成熟，且缺乏有效的技術(shù)指標(biāo)來評(píng)價(jià)其應(yīng)用的效果。如日本全國農(nóng)業(yè)協(xié)同組合連合會(huì)公開的“甲殼動(dòng)物的飼料和飼料添加劑”(ZL95104855.4)，其主要利用細(xì)菌肽聚糖、維生素E和維生素C之間的配伍，將三者按一定比例添入飼料中，發(fā)現(xiàn)可以提高甲殼動(dòng)物的對(duì)病原微生物的抗感染能力，主要表現(xiàn)在血細(xì)胞的吞噬活力，及提高在弧菌感染條件下的存活率。實(shí)際維生素本身也具有上述作用功能。用上述配方進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在病毒感染條件下，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組死亡率不存在顯著的差別(P＞0.05)，表明其作用效果不理想。再者，ZL95104855.4文獻(xiàn)僅籠統(tǒng)地介紹了細(xì)菌肽聚糖的制得信息，對(duì)于細(xì)菌肽聚糖的提取信息僅籠統(tǒng)地披露“將由培養(yǎng)肉湯中分離出來的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行聲處理，并用表面活性劑溶液純化?！睋?jù)文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌等原核生物的細(xì)胞壁內(nèi)含有一類由聚糖鏈、肽亞單位和間肽橋(interpeptide bridge)組成的大分子聚合物即肽聚糖。細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)完整的肽聚糖是由氨基糖骨架和肽鏈組成。它的一級(jí)結(jié)構(gòu)為N-乙酰葡糖胺(G)和N-乙酰胞壁酸(M)殘基以β-1，4鍵交替連接形成聚糖股，每股含10-65個(gè)二糖單位。胞壁酸是氨基葡萄糖的乳酰醚(lactyether)，其乳?；糠趾陀?個(gè)氨基酸分子組成的肽鏈相連(楊秀山1982)。肽聚糖中連接在N-乙酰胞壁酸上的肽鏈之間，一般是由一條鏈的第4個(gè)氨基酸的羧基和另一條相鄰的鏈的第3個(gè)氨基酸的自由氨基以肽鍵交聯(lián)(間肽橋)，間肽橋多由1-6個(gè)氨基酸分子的殘基組成。不同的肽聚糖中出現(xiàn)的氨基酸數(shù)是有限的，亞肽單位及間肽橋上氨基酸的組成及排列上的不同，決定了肽聚糖種類的多樣性(和致中1992)。不同的原核生物，其細(xì)胞壁內(nèi)的肽聚糖的組成有特異性，肽聚糖被水解后，它的活性常會(huì)增加。未見更詳細(xì)的關(guān)于肽聚糖提取方法的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種非特異免疫激活劑(以下簡(jiǎn)稱NSI)及其制備方法，其可以通過口服或人工注射的方法，達(dá)到能夠有效的廣泛的提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的非特異免疫力，增強(qiáng)生物抗病力，促進(jìn)健康生長(zhǎng)之效果。本非特異免疫激活劑均能有效的提高魚類、蝦類及貝類的非特異性免疫，增強(qiáng)對(duì)各類病原的抵抗力，具體講是提高抗病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、真菌類疾病及寄生蟲感染，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的養(yǎng)殖成活率，減少抗生素用量，提高水產(chǎn)品質(zhì)量。保護(hù)生態(tài)環(huán)境及人民健康。制成的非特異免疫激活劑產(chǎn)品為純生物制品，使用安全，對(duì)生物及環(huán)境沒有任何污染，能混合后添加到養(yǎng)殖用飼料中或噴灑于餌料表面，也能用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的育苗水體內(nèi)，能與其它飼料添加劑或藥物配伍。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案完成，研制了一種非特異免疫激活劑的制備方法，包括經(jīng)厭氧發(fā)酵培養(yǎng)，再從發(fā)酵液中分離收集菌體，獲取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑的過程。所述發(fā)酵培養(yǎng)的菌種是雙歧桿菌DSM20210，或雙歧桿菌ATCC25866，或雙歧桿菌ATCC25867，或雙歧桿菌ATCC25525；所述獲取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑的過程是(1).收集菌體取發(fā)酵完成的菌液，經(jīng)4000-8000g(離心力F單位英文縮寫)、4℃的離心處理20-30分鐘，棄去上清液，保留收集的該菌體沉淀，再用0.8％生理鹽水洗滌至該菌體為白色；(2).裂解細(xì)胞按1∶4(g/ml)的比例，將白色的該菌體與細(xì)胞裂解劑混合，并置入95℃水浴中，恒溫處理且連續(xù)攪拌1小時(shí)，再立即冷卻至室溫，并用雙蒸水徹底洗滌；(3).四次洗滌離心除去裂解劑用濃度梯度的甲醇水溶液對(duì)經(jīng)(2).步處理的菌體，分別進(jìn)行三次洗滌、離心處理，其中離心是以5000-6000g，分步按濃度梯度洗滌處理；之后用丙酮洗滌，且經(jīng)4000-5000g的離心處理，再將收集的該菌體沉淀進(jìn)行0～4℃的低溫干燥處理；(4).水解預(yù)處理將(3).中得到的干燥產(chǎn)物，按每500g該產(chǎn)物加1 L的pH6.2磷酸鹽緩沖液和0.3gEDTA液的比例，配制混合液，保持恒溫80℃達(dá)4小時(shí)，再冷卻至37℃；(5).酶解處理向(4).中冷卻的混合液中加入適量1-5g/L的溶菌酶，保持恒溫37℃下作用24小時(shí)；之后補(bǔ)加1-3g/L的溶菌酶，37℃下處理12小時(shí)；(6).再次酶解處理用適量2-5g/L的蛋白酶加入到溶菌的該混合液中，在50℃溫度下處理24小時(shí)，即得到含有效活性濃度為0.4-0.8％的寡糖肽類和含有丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶甘氨酸的摩爾數(shù)比＝3∶1∶1∶1的組合物，該組合物是具有淡甜香氣味的黃褐色液體——非特異免疫激活劑主料制劑；或?qū)⒃擖S褐色液體干燥處理，即得到性狀具有特殊甜香氣味的，深褐色的粘稠物——含有效濃度為4-8％的寡糖肽類活性成分的和含有丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶甘氨酸的摩爾數(shù)比＝3∶1∶1∶1的組合物——非特異免疫激活劑粗品制劑。
所述的(2).步中的細(xì)胞裂解劑，其是非離子型表面活性劑。
所述的非離子型表面活性劑，其或是0.5％TritonX100，或是2％SDS。
所述的(3).步中濃度梯度的甲醇水溶液，其梯度濃度為30％、70％、100％，或?yàn)?0％、60％、100％。
所述的(6).中的蛋白酶，其或是木瓜蛋白酶，或是鏈霉蛋白酶。
所述非特異免疫激活劑主料制劑的使用方法是將所述的非特異免疫激活劑主料制劑直接按以下重量比與輔料混合，之后，根據(jù)生產(chǎn)需求，添加適量濃度的上述混合物于飼料原料中，經(jīng)飼料加工機(jī)，加工成水產(chǎn)動(dòng)物口服的養(yǎng)殖飼料組分 重量比非特異免疫激活劑主料制劑 100——1000份；促吸收劑 0.5——2000份；免疫協(xié)同劑 0.5——500份；誘食劑 1——3000份。
所述的促吸收劑為脫氧膽酸鈉(NaDC)或/和為腦磷脂(CE)；所述的免疫協(xié)同劑為或?yàn)閬單徕c，或/和為維生素A，或/和為維生素C；所述的誘食劑，其為苷氨酸三甲丙脂，或?yàn)樘鸩藟A。
本發(fā)明所述非特異免疫激活制劑的另一種制備方法也是獲取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑成分，其過程是(1).收集菌體取發(fā)酵完成的菌液，經(jīng)5000-8000g、4℃的離心處理20-30分鐘，棄去上清液，保留收集的該菌體沉淀，再用0.8％生理鹽水洗滌并以6000～8000g離心處理，得到白色的濕菌體；(2).恒溫水浴將收集的該濕菌體100g于65℃水浴，恒溫處理40分鐘，之后冷卻至室溫；(3).裂解細(xì)胞按1∶4(g/ml)的比例，將冷卻至室溫的該濕菌體與細(xì)胞裂解劑混合，并置入95℃水浴1小時(shí)，連續(xù)攪拌，之后立即冷卻至室溫，并用雙蒸水徹底洗滌；(4).四次洗滌、離心除去裂解劑用濃度梯度的甲醇水溶液對(duì)經(jīng)(3).步處理的該濕菌體，分別進(jìn)行洗滌、5000-6000g離心的分步梯度濃度處理；之后用丙酮洗滌，經(jīng)4000-5000g的離心處理，再將收集的該菌體沉淀進(jìn)行0～4℃的低溫干燥處理；(5).酶解除核酸將(4).中得到的干燥該菌體沉淀加入300ml的含脫氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)的pH7.2的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris·HCl)緩沖液；在37℃恒溫下，孵育24小時(shí)；再經(jīng)5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集該菌體沉淀；(6).酶解除雜蛋白用含量2mg/ml的胰蛋白酶和含量0.5mg/ml的α-糜蛋白酶的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris·HCl)緩沖液300ml，加入到(5).中處理的該菌體沉淀中，并在37℃恒溫下，消化24小時(shí)；再以5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集的該菌體沉淀；(7).二次酶解除去雜蛋白用150ml的含5mg/ml的胃蛋白酶的0.01M鹽酸溶液，處理(6).中收集的該菌體沉淀，后經(jīng)5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集的該菌體沉淀；再用300ml的含量5mg/ml的蛋白酶E的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH7.4的Tris·HCl)緩沖液，在37℃恒溫下消化處理24小時(shí)；最后以5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集該菌體沉淀；(8).三步脫脂將上述蛋白酶消化過的收集該菌體，再經(jīng)以下三步處理①.加300ml甲醇，以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；②.加300ml甲醇∶氯仿的混合液(1∶1 V/V)，以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；③.加300ml氯仿洗滌，再以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；(9).透析處理將上述(8).中③步的提取物在0～4℃下干燥處理，再用200ml的含量1mg/ml的蛋白酶E的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH7.4的Tris·HCl)緩沖液處理干燥的提取物；在37℃恒溫下處理24小時(shí)；再將恒溫處理的該提取物裝入透析袋內(nèi)，用蒸餾水連續(xù)透析50小時(shí)；(10).脫鹽透析處理將上述透析袋內(nèi)的產(chǎn)物加入50ml、0.05M的鹽酸，且在85℃下處理5分鐘，之后立即冷卻至室溫；再以10000-12000g、4℃離心處理30分鐘，收集該菌體沉淀；再用水透析5天，之后將該菌體沉淀凍干保存；(11).糖蛋白水解將(10).中獲得的凍干產(chǎn)物，按產(chǎn)物重量/緩沖液體積為1∶5的比例，加入pH6.2的磷酸鹽緩沖液，再加入適量1-3g/L的溶菌酶和0.1g/L EDTA液，在37℃恒溫下處理24小時(shí)；之后用1-5g/L的鏈霉蛋白酶，或用精制木瓜酶，50℃水解處理24小時(shí)；(12).水透析干燥處理將上述水解處理液于蒸餾水中透析50小時(shí)，在0℃下低溫干燥，即得注射用非特異免疫激活劑干粉制劑，該干粉的性狀含活性成份寡糖肽類大于95％，糖含量40-49％，干粉制劑品外觀呈白色粉末，水溶液渾濁。
所述非特異免疫激活劑的另一種制備方法中，所述的(3).步中細(xì)胞裂解劑是0.5％濃度的TritonX100，或是2％SDS；所述的(4).步中濃度梯度的甲醇水溶液，其濃度梯度為30％、70％、100％，或?yàn)?0％、60％、100％。
所述非特異免疫激活劑另一種注射用干粉制劑的使用方法是將所述的注射用干粉制劑是用生理鹽水稀釋1000倍(W/V)，在121℃下滅菌15分鐘，于-20℃下冰箱存放；按每公斤魚體重的注射量為50——150μl/Kg。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于A)通過應(yīng)用本非特異免疫激活劑主料制劑或粗料制劑作為魚、蝦、貝類的飼料添加劑，用于激活養(yǎng)殖生物的非特異免疫力，從而達(dá)到促進(jìn)對(duì)魚、蝦、貝類的抗病原生物(細(xì)菌、病毒、寄生蟲)的感染力，促進(jìn)了魚、蝦、貝類的生長(zhǎng)發(fā)育，提高了飼料轉(zhuǎn)化率，加強(qiáng)了貝類、蝦等育苗期變態(tài)成活率。具體效果如下(1)本發(fā)明的免疫激活劑制劑促對(duì)蝦抗病毒病養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表1-表3表1南美白對(duì)蝦攝食添加免疫激活劑制劑的餌料30后，抗病毒感染情況(對(duì)蝦體長(zhǎng)6-9cm)
(2)本發(fā)明的免疫激活劑制劑促中國對(duì)蝦生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2 養(yǎng)殖中國對(duì)蝦30天后，對(duì)蝦體長(zhǎng)增長(zhǎng)率(對(duì)蝦體長(zhǎng)4-6cm)
(3)免疫激活劑促日本對(duì)蝦非特異免疫因子活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3養(yǎng)殖日本對(duì)蝦30天后，對(duì)蝦體液中酚氧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸活力及凝集活力(對(duì)蝦體長(zhǎng)9-11cm)
B)本發(fā)明制備的非特異免疫激活劑(NSI)另一種注射用干粉制劑作為魚類、甲魚等水生脊椎動(dòng)物注射用激活劑。其(NSI)有增強(qiáng)魚類頭腎細(xì)胞吞噬活力、溶菌酶活力等作用。尤其是該注射用激活劑注射用于甲魚，其效果有明顯地增強(qiáng)甲魚的巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增加甲魚生長(zhǎng)速度。還有該注射用激活劑注射用于羅非魚，其效果有明顯地增強(qiáng)羅非魚對(duì)愛德華氏菌的抵抗力。該注射用激活劑還可增強(qiáng)虹鱒魚、真鯛等魚類的抗弧菌感染力。見


圖1不同劑量的非特異免疫激活劑注射羅非鯡魚后，用愛德華氏菌進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)后，8天內(nèi)各組的成活率。
(四)附圖及其實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施例不能限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，但可以支持本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍。
圖1為非特異免疫激活劑注射養(yǎng)殖魚再感染愛德華氏菌后的成活率曲線圖。
本發(fā)明所使用的菌種是由本申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)室收藏，是一種雙歧桿菌DSM20210，也適用于雙歧桿菌ATCC25866及適用于雙歧桿菌ATCC25867，ATCC25525。
本發(fā)明的厭氧細(xì)菌發(fā)酵條件如下培養(yǎng)基葡萄糖10g，乳糖10g，胰蛋白胨10g，酵母膏6g，牛肉膏6g，MgSO4·2H2O 0.2g，Na2HPO4·12H2O 10g，KH2PO46g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH調(diào)pH至7.0；滅菌116℃，20min；發(fā)酵時(shí)間20小時(shí)，發(fā)酵完成時(shí)pH＝4.2-4.6，細(xì)菌濃度約在5×108～9×109cfu/ml。
本發(fā)明所述提取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑的過程是(1).收集菌體取發(fā)酵完成的菌液，經(jīng)4000-8000g、4℃的離心處理20-30分鐘，棄去上清液，保留收集的該菌體沉淀，再用0.8％生理鹽水洗滌至該菌體為白色；(2).裂解細(xì)胞按1∶4(g/ml)的比例，將白色的該菌體與細(xì)胞裂解劑——非離子型表面活性劑中的TritonX100混合，并置入95℃水浴中，恒溫處理且連續(xù)攪拌1小時(shí)，再立即冷卻至室溫，并用雙蒸水徹底洗滌；(3).四次洗滌離心去除裂解劑用濃度梯度為30％、70％、100％的甲醇水溶液對(duì)經(jīng)(2).步處理的該菌體，進(jìn)行三次洗滌、離心處理，其中離心是以5000-6000g，分步按濃度梯度洗滌處理；之后用丙酮洗滌，且經(jīng)4000-5000g的離心處理，再將收集的該菌體沉淀進(jìn)行0～4℃的低溫干燥處理；(4).水解預(yù)處理將(3).中得到的干燥產(chǎn)物，取每500g該產(chǎn)物加1L的pH6.2磷酸鹽緩沖液和0.3gEDTA液的比例，配制混合液，且保持80℃恒溫達(dá)4小時(shí)，再冷卻至37℃；
(5).酶解處理在(4).中冷卻的該混合液中加入適量1-5g/L的溶菌酶，且恒溫37℃下處理24小時(shí)；之后加1-3g/L的溶菌酶，37℃下處理24小時(shí)；(6).再次酶解處理用適量2-5g/L的蛋白酶(或是木瓜蛋白酶，或是鏈霉蛋白酶)加入到溶菌的該混合液中，在50℃溫度下處理24小時(shí)，即得到含有0.4-0.8％的活性寡糖肽類和含有丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶甘氨酸的摩爾數(shù)比＝3∶1∶1∶1的組合物，該組合物是具有淡甜香氣味的黃褐色液體——非特異免疫激活劑主料制劑；或?qū)⒃擖S褐色液體干燥處理，即得到具有特殊甜香氣味的，深褐色性狀的粘稠物——含有4-8％的寡糖肽類活性成分的和含有丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶甘氨酸的摩爾數(shù)比＝3∶1∶1∶1的組合物——非特異免疫激活劑粗品制劑。
在本發(fā)明的非特異免疫激活劑中，其具有生物活性的物質(zhì)主要是來自細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，該肽聚糖分子量的大小與其生物活性密切相關(guān)。采用本發(fā)明中所述的生化提取技術(shù)，可以分離純化出細(xì)菌完整的肽聚糖。完整肽聚糖主要由N-乙酰葡糖氨(NAG)、N-乙酰胞壁酸(NAM)及特定的肽鏈組成，分析上述三者含量，即可計(jì)算出肽聚糖的含量。本發(fā)明所采用的檢測(cè)肽聚糖的方法是首先，分離提純細(xì)菌細(xì)胞壁中完整的肽聚糖；之后測(cè)定N-乙酰胞壁酸(NAM)的百分含量及N-乙酰葡糖氨(NAG)的百分含量；再次用液相色譜技術(shù)測(cè)定肽鏈中氨基酸組成及百分含量。
其中，N-乙酰胞壁酸(NAM)含量的測(cè)定方法如下取100mg樣品經(jīng)6N HCI、105℃水解24小時(shí)，過濾，用等當(dāng)量NaOH中和。取水解后的樣品溶液、10ug/ml標(biāo)準(zhǔn)乳酸溶液、空白(蒸餾水)各1ml，分別加入0.5ml 20％CuSO4溶液，混勻。用蒸餾水準(zhǔn)確定容至5.0ml，各加入0.2g CaO粉末，用細(xì)攪棒仔細(xì)攪勻，放置30min，2500rpm，15min，小心吸出上清液各1ml，分別加入1滴20％CuSO4溶液，混勻，滴加6ml濃H2SO4溶液，充分混勻后，沸水浴5min，自來水冷卻后，加入0.2ml對(duì)-羥基聯(lián)苯試劑，混勻，30℃恒溫水浴30min，使之形成顏色，然后在沸水浴中沸煮90s，迅速冷卻，在波長(zhǎng)560nm處比色，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得NAM的含量。
其中，N-乙酰葡糖氨(NAG)含量的測(cè)定方法如下配制N-乙酰氨基己糖標(biāo)準(zhǔn)溶液80ug/ml，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.05，0.1，0.15，0.20，0.25ml，補(bǔ)水至0.25ml。樣品經(jīng)6N HCI、105℃水解24小時(shí)，過濾，用等當(dāng)量NaOH中和，每0.6ml加入飽和NaHCO30.2ml，新配制的5％(V/V)乙酸酐0.2ml，室溫10min，以將氨基葡萄糖乙?；?，沸水浴3min，以除去多余酸酐，冷卻。向0.25ml樣品及各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入0.1ml K2B4O7溶液(0.8M，pH用NaOH溶液調(diào)至9.1)，沸水浴3min，加入3ml DMAB(二甲氨基苯甲醛，0.01g/ml)溶液，迅速混勻，37℃水浴20min，冷卻后測(cè)其吸光度A544nm，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NAG的含量。
本發(fā)明的非特異免疫激活劑主料制劑作為口服制劑在飼料中的配方
表4，每噸飼料水產(chǎn)飼料中添加口服免疫激活劑制劑配方(單位Kg) 本發(fā)明的非特異免疫激活劑(NSI)作為用于魚類、甲魚等水生脊椎動(dòng)物注射用的一種干粉制劑，其制備方法也是提取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活劑成分，其過程是(1).收集菌體取發(fā)酵完成的菌液，經(jīng)5000-8000g、4℃的離心處理20-30分鐘，棄去上清液，保留收集的該菌體沉淀，再用0.8％生理鹽水洗滌并以6000～8000g離心處理，得到白色的濕菌體；(2).恒溫水浴將收集的該濕菌體100g于65℃水浴，恒溫處理40分鐘，之后冷卻至室溫；(3).裂解細(xì)胞按1∶4(g/ml)的比例，將冷卻至室溫的該濕菌體與細(xì)胞裂解劑(0.5％濃度的TritonX100或2％的SDS)混合，并置入95℃水浴1小時(shí)，連續(xù)攪拌，之后立即冷卻至室溫，并用雙蒸水徹底洗滌；(4).四次洗滌、離心用濃度梯度為30％、70％、100％的甲醇水溶液對(duì)經(jīng)(3).步處理的該濕菌體，分別進(jìn)行洗滌、5000-6000g離心的分步梯度濃度處理；之后用丙酮洗滌，經(jīng)4000-5000g的離心處理，再將收集的該菌體沉淀進(jìn)行0～4℃的低溫干燥處理；(5).酶解除核酸將(4).中得到的干燥該菌體沉淀加入300ml的含脫氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)的pH7.2的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris·HCl)緩沖液；在37℃恒溫下，孵育24小時(shí)；再經(jīng)5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集該菌體沉淀；(6).酶解除雜蛋白用含量2mg/ml的胰蛋白酶和含量0.5mg/ml的α-糜蛋白酶的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris·HCl)緩沖液300ml，加入到(5).中處理的該菌體沉淀中，并在37℃恒溫下，消化24小時(shí)；再以5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集的該菌體沉淀；(7).二次酶解除雜蛋白用150ml的含量5mg/ml的胃蛋白酶的0.01M鹽酸溶液，處理(6).中收集的該菌體沉淀，后經(jīng)5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集的該菌體沉淀；再用300ml的含量5mg/ml的蛋白酶E的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH7.4的Tris·HCl)緩沖液，在37℃恒溫下消化處理24小時(shí)；最后以5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集該菌體沉淀；(8).三步脫脂將上述蛋白酶消化過的收集該菌體，再經(jīng)以下三步處理①.加300ml甲醇，以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；②.加300ml甲醇∶氯仿的混合液(1∶1V/V)，以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；③.加300ml氯仿洗滌，再以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；(9).透析處理將上述(8).中③步的提取物在0～4℃下干燥處理，再用200ml的含量1mg/ml的蛋白酶E的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH7.4的Tris·HCl)緩沖液處理干燥的提取物；在37℃恒溫下處理24小時(shí)；再將恒溫處理的該提取物裝入透析袋內(nèi)，用蒸餾水連續(xù)透析50小時(shí)；(10).脫鹽透析處理將上述透析袋內(nèi)的產(chǎn)物加入50ml、0.05M的鹽酸，且在85℃下處理5分鐘，之后立即冷卻至室溫；再以10000-12000g、4℃離心處理30分鐘，收集該菌體沉淀；再用水透析5天，之后將該菌體沉淀凍干保存；(11).糖蛋白水解將(10).中獲得的凍干產(chǎn)物，按產(chǎn)物重量/緩沖液體積為1∶5的比例，加入pH6.2的磷酸鹽緩沖液，再加入適量1g/L的溶菌酶和0.1g/L EDTA液，在37℃恒溫下處理24小時(shí)；之后用1g/L的鏈霉蛋白酶，50℃水解處理24小時(shí)；(12).水透析干燥處理將上述水解處理液于蒸餾水中透析50小時(shí)，在0℃下低溫干燥，即得注射用非特異免疫激活劑干粉制劑，該干粉的性狀含活性成份寡糖肽類大于95％，糖含量40-49％，產(chǎn)品呈白色粉末，水溶液渾濁。
本發(fā)明的注射用非特異免疫激活劑干粉制劑的活性成份寡糖肽類含量測(cè)定方法同上述所采用的檢測(cè)肽聚糖的方法首先，測(cè)定樣品中N-乙酰胞壁酸(NAM)及N-乙酰葡糖氨(NAG)的百分含量；再次用液相色譜技術(shù)測(cè)定肽鏈中氨基酸組成及百分含量。
所述非特異免疫激活劑另一種注射用于粉制劑的使用方法所述的注射用干粉制劑是用生理鹽水稀釋1000倍(W/V)，在121℃下滅菌15分鐘，于-20℃下冰箱存放；按每公斤魚體重的注射量為50——150μl/Kg。具體使用該干粉制劑的應(yīng)用實(shí)例如下，見表5表5按每公斤魚體重注射不同劑量NSI對(duì)不同魚類頭腎細(xì)胞吞噬率影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種非特異免疫激活劑的制備方法，包括經(jīng)厭氧發(fā)酵培養(yǎng)，再從發(fā)酵液中分離收集菌體，獲取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑的過程，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的菌種是雙歧桿菌DSM 20210，或雙歧桿菌ATCC25866，或雙歧桿菌ATCC25867，或雙歧桿菌ATCC25525；所述獲取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑的過程是(1).收集菌體取發(fā)酵完成的菌液，經(jīng)4000-8000g、4℃的離心處理20-30分鐘，棄去上清液，保留收集的該菌體沉淀，再用0.8％生理鹽水洗滌至該菌體為白色；(2).裂解細(xì)胞按1∶4(g/ml)的比例，將白色的該菌體與細(xì)胞裂解劑混合，并置入95℃水浴中，恒溫處理且連續(xù)攪拌1小時(shí)，再立即冷卻至室溫，并用雙蒸水徹底洗滌；(3).四次洗滌離心除去裂解劑用濃度梯度的甲醇水溶液對(duì)經(jīng)(2).步處理的菌體，分別進(jìn)行三次洗滌、離心處理，其中離心是以5000-6000g，分步按濃度梯度洗滌處理；之后用丙酮洗滌，且經(jīng)4000-5000g的離心處理，再將收集的該菌體沉淀進(jìn)行0～4℃的低溫干燥處理；(4).水解預(yù)處理將(3).中得到的干燥產(chǎn)物，按每500g該產(chǎn)物加1L的pH6.2磷酸鹽緩沖液和0.3gEDTA液的比例，配制混合液，保持恒溫80℃達(dá)4小時(shí)，再冷卻至37℃；(5).酶解處理向(4).中冷卻的混合液中加入適量1-5g/L的溶菌酶，保持恒溫37℃下作用24小時(shí)；之后補(bǔ)加1-3g/L的溶菌酶，37℃下處理12小時(shí)；(6).再次酶解處理用適量2-5g/L的蛋白酶加入到溶菌的該混合液中，在50℃溫度下處理24小時(shí)，即得到含有效活性濃度為0.4-0.8％的寡糖肽類和含有丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶甘氨酸的摩爾數(shù)比＝3∶1∶1∶1的組合物，該組合物是具有淡甜香氣味的黃褐色液體——非特異免疫激活劑主料制劑；或?qū)⒃擖S褐色液體干燥處理，即得到性狀具有特殊甜香氣味的，深褐色的粘稠物——含有效濃度為4-8％的寡糖肽類活性成分的和含有丙氨酸∶谷氨酸∶賴氨酸∶甘氨酸的摩爾數(shù)比＝3∶1∶1∶1的組合物——非特異免疫激活劑粗品制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述非特異免疫激活劑的制備方法，其特征在于所述的(2).步中的細(xì)胞裂解劑，其是非離子型表面活性劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述非特異免疫激活劑的制備方法，其特征在于所述的非離子型表面活性劑，其或是0.5％TritonX100，或是2％SDS。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述非特異免疫激活劑的制備方法，其特征在于所述的(3).步中濃度梯度的甲醇水溶液，其梯度濃度為30％、70％、100％，或?yàn)?0％、60％、100％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述非特異免疫激活劑的制備方法，其特征在于所述的(6).中的蛋白酶，其或是木瓜蛋白酶，或是鏈霉蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述非特異免疫激活劑主料制劑的使用方法是將所述的非特異免疫激活劑主料制劑直接按以下重量比與輔料混合，之后，根據(jù)生產(chǎn)需求，添加適量濃度的上述混合物于飼料原料中，經(jīng)飼料加工機(jī)，加工成水產(chǎn)動(dòng)物口服的養(yǎng)殖飼料組分重量比非特異免疫激活劑主料制劑 100——1000份；促吸收劑 0.5——2000份；免疫協(xié)同劑0.5——500份；誘食劑 1——3000份。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述非特異免疫激活劑主料制劑的使用方法，其特征在于所述的促吸收劑為脫氧膽酸鈉(NaDC)或/和為腦磷脂(CE)；所述的免疫協(xié)同劑為或?yàn)閬單徕c，或/和為維生素A，或/和為維生素C；所述的誘食劑，其為苷氨酸三甲丙脂或甜菜堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述非特異免疫激活制劑的另一種制備方法，其特征在于所述的獲取菌體細(xì)胞壁中的活性非特異免疫激活制劑成分，其過程是(1).收集菌體取發(fā)酵完成的菌液，經(jīng)5000-8000g、4℃的離心處理20-30分鐘，棄去上清液，保留收集的該菌體沉淀，再用0.8％生理鹽水洗滌并以6000～8000g離心處理，得到白色的濕菌體；(2).恒溫水浴將收集的該濕菌體100g于65℃水浴，恒溫處理40分鐘，之后冷卻至室溫；(3).裂解細(xì)胞按1∶4(g/ml)的比例，將冷卻至室溫的該濕菌體與細(xì)胞裂解劑混合，并置入95℃水浴1小時(shí)，連續(xù)攪拌，之后立即冷卻至室溫，并用雙蒸水徹底洗滌；(4).四次洗滌、離心除去裂解劑用濃度梯度的甲醇水溶液對(duì)經(jīng)(3).步處理的該濕菌體，分別進(jìn)行洗滌、5000-6000g離心的分步梯度濃度處理；之后用丙酮洗滌，經(jīng)4000-5000g的離心處理，再將收集的該菌體沉淀進(jìn)行0～4℃的低溫干燥處理；(5).酶解除核酸將(4).中得到的干燥該菌體沉淀加入300ml的含脫氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)的pH7.2的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris·HCl)緩沖液；在37℃恒溫下，孵育24小時(shí)；再經(jīng)5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集該菌體沉淀；(6).酶解除雜蛋白用含量2mg/ml的胰蛋白酶和含量0.5mg/ml的α-糜蛋白酶的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris·HCl)緩沖液300ml，加入到(5).中處理的該菌體沉淀中，并在37℃恒溫下，消化24小時(shí)；再以5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集的該菌體沉淀；(7).二次酶解除去雜蛋白用150ml的含5mg/ml的胃蛋白酶的0.01M鹽酸溶液，處理(6).中收集的該菌體沉淀，后經(jīng)5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集的該菌體沉淀；再用300ml的含量5mg/ml的蛋白酶E的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH7.4的Tris·HCl)緩沖液，在37℃恒溫下消化處理24小時(shí)；最后以5000-6000g、4℃離心處理40分鐘，收集該菌體沉淀；(8).三步脫脂將上述蛋白酶消化過的收集該菌體，再經(jīng)以下三步處理①.加300ml甲醇，以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；②.加300ml甲醇氯仿的混合液(1∶1V/V)，以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；③.加300ml氯仿洗滌，再以5000g、4℃離心處理40分鐘，棄去上清液；(9).透析處理將上述(8).中③步的提取物在0～4℃下干燥處理，再用200ml的含量1mg/ml的蛋白酶E的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH7.4的Tris·HCl)緩沖液處理干燥的提取物；在37℃恒溫下處理24小時(shí)；再將恒溫處理的該提取物裝入透析袋內(nèi)，用蒸餾水連續(xù)透析50小時(shí)；(10).脫鹽透析處理將上述透析袋內(nèi)的產(chǎn)物加入50ml、0.05M的鹽酸，且在85℃下處理5分鐘，之后立即冷卻至室溫；再以10000-12000g、4℃離心處理30分鐘，收集該菌體沉淀；再用水透析5天，之后將該菌體沉淀凍干保存；(11).糖蛋白水解將(10).中獲得的凍干產(chǎn)物，按產(chǎn)物重量/緩沖液體積為1∶5的比例，加入pH6.2的磷酸鹽緩沖液，再加入適量1-3g/L的溶菌酶和0.1g/L EDTA液，在37℃恒溫下處理24小時(shí)；之后用1-5g/L的鏈霉蛋白酶，或用精制木瓜酶，50℃水解處理24小時(shí)；(12).水透析干燥處理將上述水解處理液于蒸餾水中透析50小時(shí)，在0℃下低溫干燥，即得注射用非特異免疫激活劑干粉制劑，該干粉的性狀含活性成份寡糖肽類大于95％，糖含量40-49％，干粉制劑品外觀呈白色粉末，水溶液渾濁。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述非特異免疫激活劑的另一種制備方法，其特征在于所述的(3).步中細(xì)胞裂解劑是0.5％濃度的TritonX100，或是2％SDS；所述的(4).步中濃度梯度的甲醇水溶液，其濃度梯度為30％、70％、100％，或?yàn)?0％、60％、100％。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述非特異免疫激活劑另一種注射用干粉制劑的使用方法，其特征在于所述的注射用干粉制劑是用生理鹽水稀釋1000倍(W/V)，在121℃下滅菌15分鐘，于-20℃下冰箱存放；按每公斤魚體重的注射量為50——150μl/Kg。
全文摘要
一種非特異免疫激活劑的制備方法，包括經(jīng)厭氧發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離菌體，獲取菌體細(xì)胞壁中的非特異免疫激活制劑的過程。該發(fā)酵菌種是雙歧桿菌DSM 20210，或雙歧桿菌ATCC25866，或雙歧桿菌ATCC25867，或雙歧桿菌ATCC25525。獲取該制劑的過程(1).收集菌體；(2).裂解細(xì)胞；(3).四次洗滌離心除去裂解劑；(4).水解預(yù)處理；(5).酶解處理；(6).再次酶解處理；從而制成非特異免疫激活劑主料制劑或粗料制劑作為魚、蝦、貝類的飼料添加劑，用于激活養(yǎng)殖生物的非特異免疫力，達(dá)到促進(jìn)對(duì)魚、蝦、貝類的抗病原生物的能力，促進(jìn)魚、蝦、貝類的生長(zhǎng)發(fā)育，提高了飼料轉(zhuǎn)化率及水生養(yǎng)殖動(dòng)物育苗期成活率。該激活劑干粉制劑作為水生脊椎動(dòng)物注射用激活劑，可增強(qiáng)魚類頭腎細(xì)胞吞噬活力，增加抗病力。
文檔編號(hào)A23K1/16GK1513481SQ0313290
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者王秀華, 黃倢, 宋曉玲, 楊冰, 劉莉 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所