一種免疫磁珠的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種免疫磁珠的制備方法，首先取冷凍干燥過的硅基磁珠分散到極性有機溶劑中超聲處理后，加入溶解于該極性有機溶劑中的分散劑，攪拌后，滴加溶解于該極性有機溶劑的帶有雙端羧基的有機小分子，滴加完畢后反應(yīng)6~18h；反應(yīng)結(jié)束后，磁分離出羧基磁珠，依次用無水乙醇及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液pH值為6～7，超聲處理15～30min，分散在萬分之二NaN3水中，即得到羧基磁珠；羧基磁珠用MES緩沖液清洗至少一次，重懸羧基磁珠于MES緩沖液中，通過活化劑碳二亞胺將磁珠活化后，在MES緩沖液環(huán)境中偶聯(lián)抗體。本發(fā)明工藝流程簡單，操作簡便，適于批量化生產(chǎn)。
【專利說明】一種免疫磁珠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種免疫磁珠的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，免疫檢測和免疫診斷使用的方法是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。在測定時，把受檢標(biāo)本(測定其中的抗原或抗體)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。但是，目前所用的固相載體存在問題有:批間差異不易控制，包被操作繁復(fù)，自動化程度不高，不適宜大批量樣本的操作。
[0003]免疫磁珠是由作為載體的磁性微球和免疫配基結(jié)合而成的納米級材料。磁性微球載體通常是帶有氨基、羧基、羥基或巰基等化學(xué)官能團的磁珠，該官能團與不同的免疫配基如活性蛋白、抗體、抗原、親和素、生物素等結(jié)合形成免疫磁珠。磁性微球載體具有超順磁性特點，可使免疫磁珠置于磁場時，顯示其磁性，從磁場移出時，磁性消除，免疫磁珠重新分散。
[0004]包被抗體的免疫磁珠作為固相載體，其上的抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-抗體-磁珠復(fù)合物，這種復(fù)合物在磁場作用下，迅速向磁場移動，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，達到分離特異性抗原的目的，這種分離方法具有檢測速度快、特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。免疫磁珠的磁分離方法還可借助親和素-生物素系統(tǒng)的生物放大作用進行更深入的應(yīng)用。免疫磁珠的磁分離方法可重復(fù)性好，操作簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，不影響被分離生物材料的生物學(xué)性狀和功能；并且由于磁珠特殊的性能，可以將免疫檢測實現(xiàn)自動化，用于大規(guī)模樣本的檢測，其反應(yīng)動力學(xué)較傳統(tǒng)免疫檢測方法快，并且具有更大的固相結(jié)合表面。
[0005]納米Fe3O4由于制備簡單、穩(wěn)定性高、較強的超順磁性、生物相容性和表面易于修飾等特點，成為目前應(yīng)用最廣泛的磁珠材料之一。但是，由于納米Fe3O4的小尺寸效應(yīng)、磁偶極子引力等作用，磁性納米粒子易于團聚，且化學(xué)穩(wěn)定性不高易受氧化，表面羥基不足，導(dǎo)致其難以直接應(yīng)用到生物領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種免疫磁珠的制備方法，其工藝流程簡單，操作簡便，原料成本低，適宜于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
[0007]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種免疫磁珠的制備方法，其包括以下步驟:
S1、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的硅 基磁珠2~100 g分散到0.2^3L極性有機溶劑中超聲處理30~60min后，加入溶解于該極性有機溶劑中的分散劑10~100ml，分散劑濃度為10~50g/L，攪拌3(T60min后，滴加溶解于該極性有機溶劑的帶有雙端羧基的有機小分子30~500ml，帶有雙端羧基的有機小分子濃度為4~20g/L，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為60~80°C,滴加完畢后反應(yīng)6~18h ;反應(yīng)結(jié)束后,磁分離出羧基磁珠,依次用無水乙醇及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液PH值為6~7，超聲處理15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到羧基磁珠；
S2、免疫磁珠的制備
上述步驟SI中所得的羧基磁珠用MES緩沖液清洗至少一次，重懸(I~20)mg羧基磁珠于200 μ I MES緩沖液中，通過活化劑碳二亞胺將磁珠活化后，在MES緩沖液環(huán)境中偶聯(lián)抗體，羧基磁珠與活化劑碳二亞胺按照(4~10):1的體積比。
[0008]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的硅基磁珠為本 申請人:的專利申請“一種核酸提取磁珠的制備方法及應(yīng)用”(申請?zhí)?201410125272.4、申請日:2014年3月31日)中的硅基磁珠。此硅基磁珠為核殼結(jié)構(gòu)，包括Fe3O4納米顆粒內(nèi)核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面；硅基磁珠經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為400nm~I μ m，飽和磁化強度為43.0~74.5emu/g。
[0009]此硅基磁珠的制備方法，其包括以下步驟:
(1)、Fe3O4納米顆粒的制備
分別配制濃度為0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+鹽溶液，按Fe3+與Fe2+物質(zhì)的量的比為
1.5~2.0混合；上述混 合液攪拌均勻后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000體積為Fe鹽溶液總體積的1/10-?/5，通入氬氣除氧30 min，調(diào)整反應(yīng)體系溫度60~70°C，再向混合液中滴加質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10~11，在溫度為70~80°C條件下反應(yīng)3~6h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，依次用質(zhì)量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液為中性，-10~-20°C冷凍干燥24~48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒；
其中磁性納米Fe3O4粒子顆粒分散到超純水中經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為100~300nm，飽和磁化強度較高為57.4~79.4 emu/g ；
(2)、納米硅基磁珠的制備
將步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒稱取2~500g分散到0.1~3L無水乙醇中超聲波處理30~60min后，加入20~1000ml濃度為10~50g/L的分散劑,攪拌均勻后，向混合液中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10，再滴加0.25~500ml體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為30~50°C，滴加完畢后反應(yīng)3~5h，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用去離子水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6~7，超聲分散15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
[0010]進一步地，上述步驟(1)中采用的分散劑為乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或幾種混合。
[0011]此硅基磁珠，無外加磁場時，呈黑色懸浮液狀態(tài)，放置有永磁鐵時，核酸提取磁珠能夠與水快速分離。
[0012]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的極性有機溶劑為四氫呋喃、N，N_ 二甲基甲酰胺、乙二胺、三乙胺、乙二醇及、丙三醇中的一種。
[0013]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的分散劑為檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000中的一種。
[0014]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟SI中采用的帶有雙端羧基的有機小分子為
I,4- 丁二酸、庚二酸、十二酸、丁二酸酐中的一種。
[0015]上述免疫磁珠的制備方法中，步驟S2的具體方法是:
S2-1、活化磁珠:取羧基磁珠于離心管中，震蕩30~60min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復(fù)洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為IOmg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30~60min，將磁珠活化；
S2-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠數(shù)次，將抗體加入500 μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠；
S2-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的人IgG磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測試驗結(jié)果。
[0016]上述免疫磁珠的制備方法，其制得的羧基磁珠為核殼結(jié)構(gòu)，包括Fe3O4納米顆粒內(nèi)核，包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面的SiO2中間層，SiO2層外鍵合帶有雙端羧基的有機小分子；IOmg羧基磁珠分散在100mL無水乙醇中經(jīng)超聲分散處理Ih后,用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為500ηπm~.2 μ m，飽和磁化強度為41.0~77.4emu/g。
[0017]上述免疫磁珠的制備方法，其制得的羧基磁珠，無外加磁場時，呈黑色懸浮液狀態(tài)，放置有永磁鐵時，羧基磁珠能夠與水快速分離。
[0018]一種免疫磁珠的應(yīng)用方法，免疫磁珠利用酶聯(lián)免疫吸附法進行病原檢測。
[0019]上述免疫磁珠應(yīng)用于人體、動物、食品、化妝品、飼料和臨床樣本檢驗中。
[0020]由于采用如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性:
本發(fā)明免疫磁珠的制備方法，其在硅基磁珠表面化學(xué)偶聯(lián)羧基小分子，工藝流程簡單，操作簡便，適于批量化生產(chǎn)；制得的羧基磁珠，飽和磁化強度較高為41.0~77.4emu/g，剩磁和矯頑力接近于零，能夠在較小的磁場作用下達到快速徹底的固液分離效果，當(dāng)撤去外加磁場后又能很快到分散到溶液中；采用的硅基磁珠通過在Fe304納米顆粒外表面包覆Si02殼層，能很大程度地降低粒子的零電點和屏蔽磁偶極子的互相作用，使粒子具有良好的水溶性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性，且Si02表面存在豐富的羥基，可使復(fù)合粒子容易進一步生物功能化；在極性有機溶劑條件下加入帶有雙端羧基的有機小分子，該分子一端羧基與娃基磁珠的表面鍵合，另一端裸露在外部，形成了羧基磁珠；羧基磁珠能夠與蛋白特異性結(jié)合，經(jīng)驗證磁珠法酶聯(lián)免疫吸附實驗操作簡便，靈敏度高，背景值低。
[0021]本發(fā)明免疫磁珠的制備方法，其制得的免疫磁珠具有高的表面質(zhì)量比，可以結(jié)合更多的抗體參加免疫 反應(yīng)；免疫磁珠表面通過共價鍵結(jié)合抗體，較物理吸附更堅固；免疫磁珠由于粒徑很小，在溫育過程中，均勻分散在反應(yīng)液中，近似于均相反應(yīng)，反應(yīng)迅速、高均一性；免疫磁珠超順磁性在后期洗滌分離過程中更利于全自動儀器應(yīng)用?！揪唧w實施方式】
[0022]參照以下實施例可以對本發(fā)明作進一步詳細說明；但是，以下實施例僅僅是例證，本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0023]實施例一
S1、娃基磁珠的制備
稱取無水三氯化鐵300g溶解于IL超純水中，稱取六水硫酸亞鐵銨392g溶解于IL超純水中，把兩種溶液轉(zhuǎn)入5L反應(yīng)釜中200r/min攪拌30min后，稱取45g聚乙二醇-8000溶解于400ml超純水中轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜；通氬氣除氧30min，調(diào)整反應(yīng)溫度為60°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速為500r/min，向溶液中滴加25%氨水至體系pH值為11，升溫至80°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速為IOOr/min條件下反應(yīng)3h;反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，停止攪拌關(guān)閉氬氣，取出反應(yīng)物，磁分離出黑色沉淀，依次用質(zhì)量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物3次至洗滌液為中性，-10°C冷凍干燥48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒；
稱取超順磁性Fe3O4納米顆粒IOOg分散到3L無水乙醇中，超聲處理30min后，加入IL濃度為50 g/L乙二胺四乙酸鈉的水溶液；200r/min攪拌30min后，向體系中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系pH值為10 ;再滴加體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液30ml，控制滴加速度為0.5ml/min，體系溫度為50°C，滴加完畢后反應(yīng)3h ;取出反應(yīng)物，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用無水乙醇清洗3遍后，超純水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液pH值為7，超聲分散30min，分散在萬分之二 NaN3水中即得到硅基包被磁珠，將其固含量調(diào)整為 100mg/ml。
[0024]S2、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的娃基磁珠2g分散到200ml四氫呋喃中超聲處理30min后,加入IOml濃度為20g/L的聚乙二醇-1000的四氫呋喃溶液，500r/min攪拌30min后，滴加溶解于四氫呋喃中的1，4-丁二酸溶液30ml其濃度為4g/L，控制滴加速度為0.lml/min，體系溫度為60°C,滴加完畢后反應(yīng)6h ;反應(yīng)結(jié)束后,磁分離用無水乙醇及去離子水依次洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6，超聲處理30min，分散在萬分之二 NaN3水中，調(diào)整其濃度為10mg/ml，即得到羧基磁珠；
S3、羧基磁珠偶聯(lián)人IgG
S3-1、活化磁珠:取Iml羧基磁珠于離心管中，在樣品混合儀上震蕩30min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入Iml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復(fù)洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為10mg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30?60min，將磁珠活化；
S3-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠2遍，將400μ g人IgG加入500μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，制成人IgG免疫磁珠；
S3-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的人IgG磁珠，用I3BST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測試驗結(jié)果。
[0025]實施例二
51、娃基磁珠的制備
與實施例一中步驟Si相同；
52、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的硅基磁珠10 g分散到700ml N，N-二甲基甲酰胺溶液中超聲處理60min后，加入20ml濃度為50g/L的檸檬酸三鈉的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，500r/min攪拌30min后，滴加溶解于N，N-二甲基甲酰胺中的順丁烯二酸溶液IOOml其濃度為10g/L，控制滴加速度為0.5ml/min,體系溫度為60°C,滴加完畢后反應(yīng)IOh ;反應(yīng)結(jié)束后,磁分離用無水乙醇及去離子水依次洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6，超聲處理30min，分散在萬分之二 NaN3水中，調(diào)整其濃度為10mg/ml，即得到羧基磁珠；
53、羧基磁珠偶聯(lián)甲胎蛋白
S3-1、活化磁珠:取Iml羧基磁珠于離心管中，在樣品混合儀上震蕩30min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入Iml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復(fù)洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為10mg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30?60min，將磁珠活化；
S3-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠2遍，將400 Ug甲胎蛋白加入500 μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠；用PBS洗滌3次，磁分離，將共價鍵結(jié)合配體的磁珠分散于PBS中，4 C保存?zhèn)溆茫?br> S3-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測試驗結(jié)果。
[0026]實施例三
51、娃基磁珠的制備
與實施例一中步驟Si相同；
52、羧基磁珠的制備
取冷凍干燥過的硅基磁珠100 g分散到3L N, N- 二甲基甲酰胺溶液中超聲處理60min后，加入IOOml濃度為50g/L的檸檬酸三鈉的N，N-二甲基甲酰胺溶液，500r/min攪拌30min后，滴加溶解于N，N-二甲基甲酰胺中的順丁烯二酸溶液500ml其濃度為5g/L，控制滴加速度為0.5ml/min,體系溫度為60°C,滴加完畢后反應(yīng)18h ;反應(yīng)結(jié)束后,磁分離用無水乙醇及去離子水依次洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6，超聲處理30min，分散在萬分之二 NaN3水中，調(diào)整其濃度為10mg/ml，即得到羧基磁珠；
53、羧基磁珠偶聯(lián)甲肝抗原
S3-1、活化磁珠:取Iml羧基磁珠于離心管中，在樣品混合儀上震蕩30min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入Iml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復(fù)洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為10mg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30~60min，
將磁珠活化；
S3-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠2遍，將400 Ug甲肝抗原加入500μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠；
S3-3、免疫磁珠活性檢測
取100 μ L濃度為10mg/ml的免疫磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測試驗結(jié)果。
[0027]免疫磁珠活性檢測結(jié)果:
【權(quán)利要求】
1.一種免疫磁珠的制備方法，其特征是:其包括以下步驟: 51、羧基磁珠的制備 取冷凍干燥過的硅基磁珠2~100 g分散到0.2^3L極性有機溶劑中超聲處理30~60min后，加入溶解于該極性有機溶劑中的分散劑10~100ml，分散劑濃度為10~50g/L，攪拌3(T60min后，滴加溶解于該極性有機溶劑的帶有雙端羧基的有機小分子30~500ml，帶有雙端羧基的有機小分子濃度為4~20g/L，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為60~80°C,滴加完畢后反應(yīng)6~18h ;反應(yīng)結(jié)束后,磁分離出羧基磁珠,依次用無水乙醇及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液PH值為6~7，超聲處理15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到羧基磁珠； 52、免疫磁珠的制備 上述步驟SI中所得的羧基磁珠用MES緩沖液清洗至少一次，重懸(I~20)mg羧基磁珠于200 μ I MES緩沖液中，通過活化劑碳二亞胺將磁珠活化后，在MES緩沖液環(huán)境中偶聯(lián)抗體，羧基磁珠與活化劑碳二亞胺按照(4~10):1的體積比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的硅基磁珠為核殼結(jié)構(gòu)，包括F e3O4納米顆粒內(nèi)核，SiO2外殼層，SiO2外殼層包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面；硅基磁珠經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為400nm~I μ m,飽和磁化強度為43.0~74.5emu/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:硅基磁珠的制備方法，其包括以下步驟: (1)、Fe3O4納米顆粒的制備 分別配制濃度為0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+鹽溶液，按Fe3+與Fe2+物質(zhì)的量的比為1.5~2.0混合；上述混合液攪拌均勻后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000體積為Fe鹽溶液總體積的1/10-?/5，通入氬氣除氧30 min，調(diào)整反應(yīng)體系溫度60~70°C，再向混合液中滴加質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10~11，在溫度為70~80°C條件下反應(yīng)3~6h，冷卻至室溫后，磁分離出黑色沉淀，依次用質(zhì)量濃度為I %氨水、5%NaCl及去離子水反復(fù)洗滌沉淀物數(shù)次至洗滌液為中性，-10~-20°C冷凍干燥24~48h，得到超順磁性Fe3O4納米顆粒； 其中磁性納米Fe3O4粒子顆粒分散到超純水中經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為100~300nm，飽和磁化強度較高為57.4~79.4 emu/g ； (2)、納米硅基磁珠的制備 將步驟SI中所得的超順磁性Fe3O4納米顆粒稱取2~500g分散到0.1~3L無水乙醇中超聲波處理30~60min后，加入20~1000ml濃度為10~50g/L的分散劑,攪拌均勻后，向混合液中加入質(zhì)量濃度為25%氨水至體系PH值為10，再滴加0.25~500ml體積比為1:1的正硅酸四乙酯與乙醇混合溶液，控制滴加速度為0.1~0.5ml/min，體系溫度為30~50°C，滴加完畢后反應(yīng)3~5h，磁分離出表面硅基修飾的Fe3O4納米顆粒，用去離子水反復(fù)洗滌數(shù)次至洗滌液PH值為6~7，超聲分散15~30min，分散在萬分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的極性有機溶劑為四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙二胺、三乙胺、乙二醇及、丙三醇中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的分散劑為檸檬酸三鈉、十六烷基溴化銨、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇-1000、聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟SI中采用的帶有雙端羧基的有機小分子為1，4- 丁二酸、庚二酸、十二酸、丁二酸酐中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:步驟S2的具體方法是: S2-1、活化磁珠:取羧基磁珠于離心管中，震蕩30~60min ;將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉；加入1ml PH 6.0的MES溶液洗滌羧基磁珠，重復(fù)洗滌一次；用100 μ L濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES重懸磁珠，再加入100 μ L濃度為IOmg/ml的碳二亞胺溶液，混勻，將磁珠在室溫條件下震蕩孵育30~60min，將磁珠活化； S2-2、包被磁珠:用Iml濃度為15mmol/L、PH 6.0的MES洗滌活化后的磁珠數(shù)次，將抗體加入500 μ I濃度為15mmol/L、PH 6.0 MES溶液中，混勻，在室溫條件下震蕩孵育24h，得到免疫磁珠； S2-3、免疫磁珠活性檢測 取100 μ L濃度為10mg/ml的人IgG磁珠，用PBST洗滌三次，加入500 μ L按1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育30min，用PBST洗滌四次，加入顯色液100 μ L，待顯色完全后加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測試驗結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫磁珠的制備方法，其特征是:其制得的羧基磁珠為核殼結(jié)構(gòu)，包括Fe3O4納米顆粒內(nèi)核，包覆在多個Fe3O4納米顆粒外表面的SiO2中間層，SiO2層外鍵合帶有雙端羧基的有機小分子；10mg羧基磁珠分散在100mL無水乙醇中經(jīng)超聲分散處理Ih后，用納米激光粒度儀測得其二次粒徑為500ηm~1.2 μ m,飽和磁化強度為41.0~77.4emu/g。
9.一種權(quán)利要求1~8中任一權(quán)利要求所述的方法制得的免疫磁珠的應(yīng)用方法，其特征是:免疫磁珠利用酶聯(lián)免疫吸附法進行病原檢測。
10.一種權(quán)利要求1~8中任一權(quán)利要求所述的方法制得的免疫磁珠應(yīng)用于人體、動物、食品、化妝品、詞料和臨床樣本檢驗中。
【文檔編號】B82Y30/00GK103926398SQ201410181299
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】杜德光, 高祥輝, 姜夏, 馬睿 申請人:洛陽惠爾納米科技有限公司