專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在水稻品質(zhì)中，食味品質(zhì)是一個(gè)非常重要的方面。Capamang等人(Capampang，C.B.等，Sci.Fd.Agri，1973，241589-1594；Juliano，B.O.，Cereal Sci.Today，1971，16334-338，340，360；Khush，G.S.等，Chemical Aspects of Rice Grain Quality，197921-32)曾提出評(píng)價(jià)稻米食味品質(zhì)的幾項(xiàng)指標(biāo)直鏈淀粉含量、糊化溫度和膠稠度等。在評(píng)價(jià)稻米食味品質(zhì)的多項(xiàng)指標(biāo)中，直鏈淀粉含量的高低是一項(xiàng)最重要的指標(biāo)。稻米直鏈淀粉含量越高，米煮飯脹性大，飯干松而色淡，冷后質(zhì)硬，食味越差；低直鏈淀粉含量的米煮飯脹性小，飯較濕粘、軟而有光澤，食味相對(duì)較好。
蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)，它對(duì)人體有著極其重要的作用。由于發(fā)展不平衡，不同地區(qū)的人們膳食結(jié)構(gòu)差異很大。在難以從動(dòng)物性食物補(bǔ)充蛋白質(zhì)、而又以稻米為主食的貧困地區(qū)，人們食物中的蛋白質(zhì)來(lái)源就只能取自于稻米；在經(jīng)濟(jì)發(fā)展較快的大城市，雖然已不存在蛋白質(zhì)攝取不足的問(wèn)題，但大城市日益增多的糖尿病患者們需要高蛋白、低碳水化合物主食；對(duì)于有些不能食用動(dòng)物蛋白的特殊疾病患者，也需要市場(chǎng)能夠提供優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。
水稻營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的主要指標(biāo)是稻米蛋白質(zhì)含量。椐報(bào)道普通稻米蛋白質(zhì)含量雖然較低，一般僅為8％左右(Juliano等，Cereal Science Today，1968299-313；Juliano等，Journalofthe Science of Food and Agri-culture，1973，24(1)295-306；Boulter等，Nucleic Acidsand Proteins in Plants I，Berlin，Springer-Verlag，1982；甄海等，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18(14)16-20)，但與小麥、大麥、玉米等主要谷類(lèi)作物相比，稻米蛋白質(zhì)中的氨基酸組成比較平衡，蛋白價(jià)較高，易于被人體消化吸收，屬于優(yōu)良蛋白質(zhì)(宋文昌等，特種稻栽培與利用，科學(xué)出版社，199719-20；閔紹揩等，水稻育種學(xué)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996，322-354；熊振民等，水稻文摘，1992，12(3)1-6)。因此，從生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)角度考慮，有必要進(jìn)行高蛋白水稻的育種。
水稻高蛋白育種在國(guó)內(nèi)和國(guó)際上一直受到很大重視。在20世紀(jì)70-80年代，日本學(xué)者曾采用輻射誘變及化學(xué)試劑處理試圖提高稻米蛋白質(zhì)含量。20世紀(jì)90年代有人采用高蛋白物種的總DNA直接導(dǎo)入等技術(shù)培育高蛋白水稻。隨著水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的完善，在1999年日本京都大學(xué)的學(xué)者成功地將一個(gè)大豆貯藏蛋白基因?qū)胨?，在?duì)轉(zhuǎn)基因后代檢測(cè)中顯示稻米蛋白質(zhì)含量比對(duì)照提高20％(Momma K等，BiosciBiotechnol Biochem，1999，63(2)314-318)。
雖然這些前人的研究在提高稻米蛋白質(zhì)含量上應(yīng)該還是具有一定的效果的，但是據(jù)報(bào)道，種子蛋白質(zhì)是由多基因編碼的性狀，如只采用導(dǎo)入單一基因的方式，可能很難實(shí)現(xiàn)大幅度、全面均衡地提高稻米蛋白質(zhì)含量的目的。
因此，本領(lǐng)域中仍然需要有新的蛋白質(zhì)含量提高的水稻的生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的方法。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的方法，該方法包括a)用含有水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，b)使步驟a)獲得的水稻生長(zhǎng)并收獲后代水稻；c)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代水稻種子。
本發(fā)明者通過(guò)研究驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將含有水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到水稻中，不僅能夠降低稻米直鏈淀粉的含量，同時(shí)的確還可以提高稻米的蛋白質(zhì)含量，從而實(shí)現(xiàn)了通過(guò)采用導(dǎo)入單一基因的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)大幅度、全面均衡地提高稻米蛋白質(zhì)含量的目的，為改良水稻稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)提供了新的思路。


圖1顯示了雙元載體p13W4 T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)圖，其中232Wx-pro、232Int.1水稻232 Waxy基因的啟動(dòng)子和內(nèi)含子1；Wx frag水稻232 Waxy基因的反義DNA片段(756bp)；LB、RBT-DNA的左右邊界；Nos-terNos基因終止子；35S-pro、35S-terCaMV 35S基因啟動(dòng)子和終止子；GUSβ-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；HPT潮霉素抗性基因；XhXhoI；EEcoRI，SaSacI；BBamHI；XXbaI；SSalI；PPstI；HHindIII。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的方法，該方法包括a)用含有水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻；
b)使步驟a)獲得的水稻生長(zhǎng)并收獲后代水稻；d)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代水稻種子。
在上述方案中，所用水稻不局限于任何特定的品種(系)。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所用的水稻為超2-10粳稻品系。
本發(fā)明所用的水稻蠟質(zhì)基因(waxy基因)在水稻第3號(hào)染色體上，它控制著胚乳中直鏈淀粉的合成(Khush等，1984，Genetics，107141-167)。該基因只在水稻的花粉、胚乳與胚囊中高效表達(dá)，因此它是時(shí)空專(zhuān)一性表達(dá)的基因。關(guān)于用含水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體(如p13W4)轉(zhuǎn)化水稻的具體方案，可參見(jiàn)專(zhuān)利申請(qǐng)出版物CN1298021A，該文全部納入本文作為參考。
本發(fā)明所用的表達(dá)載體并不局限于任何特定的表達(dá)載體。構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體的技術(shù)也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并可在諸如Sambrook等人(1989年，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)的參考文獻(xiàn)中找到。
轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域中熟知的。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，可按照例如Hiei等人(1994)Plant J，6271-6282中描述的方法，利用根癌農(nóng)桿菌法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
在將含水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入水稻后，可用常規(guī)方法使水稻生長(zhǎng)并栽培獲得其后代，然后鑒定出水稻種子蛋白質(zhì)含量提高的水稻單株。關(guān)于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，如微量凱氏定氮法(朱展才，稻麥質(zhì)量分析，中國(guó)食品出版社，1988)。
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明。
實(shí)施例本實(shí)施例是將能夠降低稻米直鏈淀粉含量的反義蠟質(zhì)基因?qū)胨?，從轉(zhuǎn)基因后代中選出部分單株進(jìn)行稻米直鏈淀粉含量和蛋白質(zhì)含量測(cè)定。
1.試驗(yàn)材料由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所陸家安副研究員提供的超2-10粳稻；農(nóng)桿菌菌株EHA105及雙元載體p13W4，由中科院上海植物生理與生態(tài)研究所王宗陽(yáng)研究員提供。該載體是在pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)上插入Waxy-GUS融合基因。該質(zhì)粒上有唯一的BamHI限制性酶切位點(diǎn)，它位于Waxy基因啟動(dòng)區(qū)與GUS基因編碼區(qū)之間。在該位點(diǎn)上還插入了一段756bp反向的waxy基因BamHI片段(來(lái)自秈稻品種232)(如圖1所示)。
2.試驗(yàn)方法根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、水稻轉(zhuǎn)化及抗性愈傷組織的篩選及植株再生主要參照劉巧泉的方法(劉巧泉等，植物生理學(xué)報(bào)，1998，24(3)259-271)進(jìn)行。
1)水稻幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)取開(kāi)花授粉后12～15天的未成熟種子(帶殼)用70％乙醇浸泡2分鐘后用無(wú)菌水漂洗，再用2.5％NaClO3消毒90分鐘，用無(wú)菌水沖洗4～5次，用解剖刀挑取幼胚于N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，26℃，暗培養(yǎng)，4-6天后可用于農(nóng)桿菌感染。
2)根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及水稻轉(zhuǎn)化自YEB平板上挑取一根癌農(nóng)桿菌單菌落于5ml YEB(Km 50μg/ml)液體培養(yǎng)基于28℃振搖(100rpm)培養(yǎng)過(guò)夜。第2天從中吸取0.5ml，轉(zhuǎn)接入50ml AB(Km 25μlg/ml)液體培養(yǎng)基于28℃振搖(190～200rpm)培養(yǎng)過(guò)夜。第3天將菌液于4000rpm離心15分鐘，倒去上清液，重懸于3/5體積的AAM(AS100μM)液體培養(yǎng)基中，使最終菌液OD600值為0.45左右，用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。
準(zhǔn)備好N6D2C轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，在平板上墊一層無(wú)菌濾紙。將幼胚愈傷挑入Φ6cm培養(yǎng)皿中，用AAM重懸的菌液浸泡，其間不時(shí)搖動(dòng)。20分鐘后將愈傷挑出，用無(wú)菌紙吸干，轉(zhuǎn)移到上述N6D2C共培養(yǎng)基上于26℃共培養(yǎng)3天。
共培養(yǎng)時(shí)，除特殊處理外，在共培養(yǎng)基AAM中添加100μM的乙酰丁香酮(AS)作為農(nóng)桿菌Vir基因的活化誘導(dǎo)物。
3)抗性愈傷組織的篩選及植株再生幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基S1進(jìn)行篩選(幼胚去胚根)，2周后轉(zhuǎn)入繼代篩選培養(yǎng)基S2，4周后選擇生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基MSRCH上分化(光照12小時(shí)/天)；再生的小苗在生根培養(yǎng)基1/2MS0H上生根壯苗，隨后移入溫室盆栽，直至形成T1代水稻種子。
利用PCR和Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因水稻(Sambrook J等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版，北京科學(xué)出版社，1992)，再通過(guò)T1和T2代稻米GUS顯色(Jefferson RA.，Plant Mol Biol Rep，1987，5387-405)結(jié)果選出部分反義-Waxy純合的T2代種子，然后通過(guò)對(duì)純合單株種子(糙米)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和直鏈淀粉含量的分析，篩選出蛋白質(zhì)含量提高的單株。
稻米蛋白質(zhì)含量采用微量凱氏定氮法(朱展才，稻麥質(zhì)量分析，中國(guó)食品出版社，1988)進(jìn)行分析。稻米直鏈淀粉含量分析參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部頒發(fā)標(biāo)準(zhǔn)“NY147-88米質(zhì)測(cè)定法”的改進(jìn)簡(jiǎn)化法進(jìn)行(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1988，北京，1-10)。
經(jīng)檢測(cè)對(duì)照稻米直鏈淀粉平均含量為13.4％，蛋白質(zhì)平均含量為9.5％。在16個(gè)被檢測(cè)的轉(zhuǎn)反義蠟質(zhì)基因超2-10粳稻后代中，有7個(gè)單株稻米在直鏈淀粉含量降低的同時(shí)，稻米蛋白質(zhì)含量提高程度明顯。其中有一單株稻米直鏈淀粉含量降低明顯，為11.4％，而它的蛋白質(zhì)含量也相對(duì)最高，為13.5％，比對(duì)照提高42.11％。
日本京都大學(xué)的學(xué)者在1999年曾將一個(gè)大豆貯藏蛋白基因?qū)胨荆D(zhuǎn)基因后代檢測(cè)顯示稻米蛋白質(zhì)含量比對(duì)照提高20％(Momma K等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)314-318)。在本發(fā)明試驗(yàn)中通過(guò)導(dǎo)入轉(zhuǎn)反義蠟質(zhì)基因，純合的T2代稻米蛋白質(zhì)含量提高的幅度明顯超過(guò)Momma K等人的研究，從而實(shí)現(xiàn)了通過(guò)降低稻米內(nèi)某種成分，如直鏈淀粉含量，來(lái)提高稻米蛋白質(zhì)含量的目的。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的方法，其特征在于，該方法包括a)用含有水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻；b)使步驟a)獲得的水稻生長(zhǎng)并收獲后代水稻；c)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代水稻種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻為粳稻超2-10品系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化水稻。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量提高的水稻種子的新方法該方法包括a)用含有水稻蠟質(zhì)基因反義序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻；b)使步驟a)獲得的水稻生長(zhǎng)并收獲后代水稻；c)鑒定出蛋白質(zhì)含量提高的后代水稻種子。本發(fā)明的方法為改良水稻稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)提供了新思路。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1552874SQ0312900
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者李建粵, 范士靖, 呂英海, 毛萬(wàn)霞, 徐麗 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)