專利名稱：耐鹽堿短芒大麥品種的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬生物技術(shù)背景技術(shù)我國(guó)自50年代以來(lái)，由于人口激增，對(duì)資源的需求越來(lái)越大，在盲目經(jīng)營(yíng)管理下，農(nóng)牧業(yè)獨(dú)立經(jīng)營(yíng)，農(nóng)田單一種植，廣種薄收，非宜耕地的草原大量開(kāi)墾，草原過(guò)度放牧利用，致使生態(tài)平衡失調(diào)，生態(tài)系統(tǒng)嚴(yán)重受損，生態(tài)環(huán)境惡化。受損農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)表現(xiàn)為土壤鹽堿化、沙化、貧瘠化，地力嚴(yán)重衰退，產(chǎn)量下降高達(dá)20％，有些土地甚至不能耕種，河流兩岸出現(xiàn)灘涂地；受損草原生態(tài)系統(tǒng)表現(xiàn)為草地嚴(yán)重超載過(guò)牧，出現(xiàn)大面積退化、沙化和鹽堿化，“三化”面積達(dá)70％以上(牧草產(chǎn)量由50年代每公頃2000公斤下降到目前的每公頃200-400公斤)，特別是堿斑面積日趨擴(kuò)大，由50年代的10％，增加到現(xiàn)在的30-70％，每年還以2.8％的速率遞增。積于地表的鹽堿在春天常形成“白風(fēng)暴”，污染環(huán)境，侵襲農(nóng)田，導(dǎo)致生態(tài)的惡性循環(huán)，嚴(yán)重危害著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展，威脅著人民的生活。每年冬春都因飼草短缺造成家畜大量死亡。草原地區(qū)約有50％以上的貧困戶是由于土地鹽堿荒漠化造成的。因此，急需大量適宜當(dāng)?shù)啬望}堿的優(yōu)良牧草，對(duì)鹽堿化草地進(jìn)行治理，使生態(tài)環(huán)境得到改善、經(jīng)濟(jì)得到持續(xù)發(fā)展，增加農(nóng)牧民的收入，使農(nóng)牧民盡快脫貧致富。
在二十世紀(jì)五十年代，人工誘變育種技術(shù)的研究首先在歐美等國(guó)家開(kāi)展起來(lái)，主要采用的方法有60Co輻射、γ射線及中子處理等，從而有效地獲得了許多有價(jià)值的突變體。目前采用的離體誘導(dǎo)育種技術(shù)主要包括物理輻射和化學(xué)誘變，現(xiàn)已培育出有價(jià)值的突變體300多個(gè)，前蘇聯(lián)已推廣近30個(gè)，包括大麥、小麥和向日葵等。印度用60Co照射小麥培育成BHP28、BHP31、BHP15等耐鹽突變體材料，很適應(yīng)于鹽堿地種植和作為耐鹽堿試驗(yàn)的親本材料。最近二十年來(lái)，人們將組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與誘變技術(shù)相結(jié)合，在篩選耐鹽突變體的研究方面取得了可喜的進(jìn)展。Nabors等以煙草品種Sam Sun的懸浮細(xì)胞為材料，用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理后，獲得最高耐0.8％NaCl的細(xì)胞系，并從耐0.64％NaCl的細(xì)胞系中得到再生植株。Hosegawa用煙草品種Wiscebsin38莖段愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，直接接種于含不同濃度NaCl的液體培養(yǎng)基中，獲得能在1.2％NaCl中生長(zhǎng)的細(xì)胞系。另外，人們還用同樣的技術(shù)獲得了水稻、苜蓿、小麥、大麥、煙草、甘蔗、番茄、燕麥和大豆等植物的耐鹽堿突變體。近十幾年來(lái)，植物基因工程育種技術(shù)得到很大發(fā)展，打破了物種間生殖隔離的障礙，把外源目的基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，既豐富和擴(kuò)大了基因資源，又達(dá)到了定向育種的目的。自1983年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世以來(lái)，許多有益的目的基因被用于農(nóng)作物的育種和新品種改良，獲得了大批如抗蟲棉、抗蟲玉米和抗病毒馬鈴薯的新品種。這些成果的取得，標(biāo)志著生物工程育種技術(shù)已經(jīng)成熟，開(kāi)始進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)代。
目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，已經(jīng)培育出了近百種植物數(shù)千個(gè)新品系或新品種。但是，有關(guān)短芒大麥育種方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。多年來(lái)，我們一直致力于牧草和作物育種、栽培及草地綜合治理的研究，現(xiàn)已建立了一整套短芒大麥組織培養(yǎng)再生體系；建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生植株體系；建立了一整套短芒大麥突變體誘變體系；獲得了一批有價(jià)值的短芒大麥突變體材料。在前郭縣草原站進(jìn)行田間試驗(yàn)，得到27份耐鹽堿材料，在大連、河北昌黎、海南島、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院抗逆室等地種植，進(jìn)行抗逆性試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析各材料的生物學(xué)性狀，結(jié)合脯氨酸含量測(cè)定、電導(dǎo)率測(cè)試、同工酶分析、耐鹽穩(wěn)定性檢測(cè)等，綜合鑒定結(jié)果表明，短芒大麥在pH11.0、含鹽量1.2％的鹽堿地上均能良好生長(zhǎng)，并正在進(jìn)行大面積種植和推廣應(yīng)用中。短芒大麥新品種已被中國(guó)科學(xué)院植物研究所正式納入聯(lián)合申請(qǐng)國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃，并被中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源所長(zhǎng)期保存。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)選育耐鹽堿短芒大麥新品種的研究，屬國(guó)內(nèi)外研究的先進(jìn)水平。
我國(guó)在耐鹽堿牧草品種的選育方面已取得一些成績(jī)，如羊草和堿茅等，但羊草抗旱性強(qiáng)，耐鹽堿能力差，堿茅耐旱性差，耐鹽堿能力強(qiáng)，生產(chǎn)能力低，每個(gè)品種都存在一定的不足。

發(fā)明內(nèi)容
耐鹽堿短芒大麥品種的選育主要解決了現(xiàn)有牧草品種的耐鹽堿性能和抗旱能力的問(wèn)題，使兩方面抗逆性能同時(shí)在一個(gè)牧草品種中體現(xiàn)出來(lái)，即抗旱、耐鹽堿，同時(shí)具有耐寒、耐瘠等優(yōu)點(diǎn)。
1.根據(jù)植物細(xì)胞全能性的理論，以現(xiàn)代生物工程技術(shù)手段(包括植物組織培養(yǎng)、物理和化學(xué)誘變)對(duì)離體培養(yǎng)的短芒大麥幼穗、幼胚、成熟胚等的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系進(jìn)行突變體誘導(dǎo)和分化。
2.在鹽堿的環(huán)境條件下，依據(jù)短芒大麥的育種目標(biāo)，對(duì)離體培養(yǎng)所獲得的再生植株的愈傷組織，進(jìn)行農(nóng)藝性狀篩選和分子生物學(xué)鑒定，選育可用于短芒大麥育種或牧草生產(chǎn)的新材料或新品系。
3.常規(guī)育種，結(jié)合常規(guī)育種方法，選育出耐鹽堿性更強(qiáng)的短芒大麥新品種。
短芒大麥為多年生疏叢型禾草，具短根莖，須根稠密，疏叢狀，直立或基部膝曲狀，株高70～90cm。葉片線形綠色或常綠色，長(zhǎng)7～18cm，寬3～7mm，上面粗糙，背面光滑，葉鞘短于節(jié)間。穗狀花序，四棱形，綠色或成熟時(shí)帶紫色，穗長(zhǎng)7.0～8.6cm，每節(jié)生有小穗3枚，有柄，穎呈針形，外稃無(wú)芒，中間小穗無(wú)柄，外稃頂端漸尖成短芒，內(nèi)稃與外稃等長(zhǎng)，穎果長(zhǎng)約3mm，頂端有毛。播種當(dāng)年發(fā)育慢，大部處于營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，僅個(gè)別抽穗開(kāi)花，但不能結(jié)籽成熟，第二年抽穗開(kāi)花，種子成熟。生育期110～130d，結(jié)實(shí)率46.67％。種子成熟一致，結(jié)實(shí)性好，但易落粒，應(yīng)注意收獲期。
分蘗力和生殖力均較強(qiáng)，達(dá)40～70個(gè)，穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)，品質(zhì)較好，粗蛋白含量達(dá)10.68％，干草產(chǎn)量10564.3kg/hm2，產(chǎn)籽量600～800kg/hm2，在生活第1年比對(duì)照增產(chǎn)43.3％，第2年增產(chǎn)77.0％，第3年增產(chǎn)102.2％，第3年短芒大麥的增產(chǎn)幅度顯著高于第1年，主要原因是短芒大麥新品種耐鹽堿能力強(qiáng)和越冬率高，越冬后對(duì)照區(qū)斷壟缺苗嚴(yán)重，而短芒大麥新品種很少有斷壟缺苗現(xiàn)象。適應(yīng)性較強(qiáng)，抗旱、耐寒、耐瘠和耐鹽堿，適宜在濕潤(rùn)的平原生長(zhǎng)，在下濕地、灘地生長(zhǎng)良好，在湖畔堿濕地和鹽堿地當(dāng)含鹽量不超過(guò)1.2％、pH值11.0時(shí)也能生長(zhǎng)，在北方可安全過(guò)冬，耐踐踏，適宜放牧。在吉林，遼寧，黑龍江，內(nèi)蒙，河北，山東，陜西，寧夏，甘肅，新疆，四川等地均可種植。
短芒大麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，開(kāi)花期含水分13.24％，粗蛋白質(zhì)15.30％，粗脂肪3.43％，粗纖維26.20％，無(wú)氮浸出物37.44％，粗灰分6.42％。葉柔軟，適口性好，消化率高，各種家畜喜食，是適于放牧的優(yōu)良牧草，亦可調(diào)制干草，調(diào)制干草以在抽穗期刈割為宜。
秋季深翻土地，播種前再耕耙一次。春、夏、秋皆可播種，如有灌溉條件或春墑?shì)^好，可行春播，否則可在夏季或秋季雨后播種。播種量每畝1.5～2.0公斤，播種深度3～4cm。一般條播，行距15～30cm，播后鎮(zhèn)壓。當(dāng)小苗長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí)，進(jìn)行中耕除草2～3次。刈割宜在抽穗期進(jìn)行，留茬宜稍高，一般7～9厘米，以利再生和越冬。有灌溉條件的地區(qū)，分別在分蘗期、拔節(jié)期和刈割后各灌溉1次，增產(chǎn)效果明顯。穗易折斷，落粒性強(qiáng)，采種田宜在60～70％種子成熟時(shí)采收。在生長(zhǎng)的第二年，每畝追施氮肥10～15公斤。
短芒大麥(Hordeum brevisublatum)是解放軍軍需大學(xué)植物基因工程研究中心運(yùn)用生物工程育種技術(shù)，對(duì)離體培養(yǎng)的野大麥幼穗、幼胚和成熟胚等的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系進(jìn)行突變體誘導(dǎo)和分化，并結(jié)合常規(guī)育種方法培育而成的多年生耐鹽堿優(yōu)良牧草品種，在含鹽量0.8-1.2％、pH值9.5-11.0的鹽堿土上均生長(zhǎng)良好，其耐鹽堿能力超過(guò)羊草，抗旱性強(qiáng)，比堿茅耐旱，同時(shí)具有耐寒、耐瘠等優(yōu)點(diǎn)。分蘗力和生殖力均較強(qiáng)，穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、品質(zhì)較好，粗蛋白含量達(dá)15.30％，干草產(chǎn)量10564.3kg/hm2，產(chǎn)籽量600-800kg/hm2，是治理鹽堿化草地最理想的草種。


圖1為本發(fā)明的選育技術(shù)路線圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例(一)植物組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)及分化1、愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)(1)幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)選取未出旗葉的幼穗，用70％的酒精棉球擦3次，然后在無(wú)菌條件下，用鑷子取出幼穗。選擇長(zhǎng)3.0～6.0cm左右的幼穗，將其剪成5mm左右的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一瓶中放入8～10塊，置于25±1℃，黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織。
幼穗的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
(2)幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)取受粉后12～15天左右的麥穗，用鑷子取出幼胚放于70％的酒精中漂洗40秒鐘，然后移入0.1％的氯化汞溶液中浸洗15分鐘，再用無(wú)菌水沖洗5次。用鑷子或解剖刀損傷幼胚后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25±1℃，黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織。
幼胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
(3)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)取當(dāng)年成熟的種子，用解剖刀切下胚，室溫下浸泡三到五小時(shí)，在70％的酒精中滅菌1分鐘，再在0.1％的氯化汞溶液中漂洗20分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗5次，用解剖刀將胚損傷后，置于25±1℃，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織。
待愈傷組織形成后，每個(gè)月繼代培養(yǎng)1次。繼代時(shí)，選取色澤新鮮，白色或淡黃色的、質(zhì)地緊密的且表面具有顆粒狀結(jié)構(gòu)的胚性愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±1℃，光照強(qiáng)度100Lux，每天人工光照10小時(shí)。
成熟胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D4.0mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
2、懸浮細(xì)胞系的建立選取淡黃色、顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織來(lái)建立懸浮細(xì)胞系。取3～5g新鮮的胚性愈傷組織、放入裝有20ml培養(yǎng)液的、容量為100ml的三角瓶中，置入旋轉(zhuǎn)式搖床上，在轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為25±1℃的散射光條件下，振蕩培養(yǎng)。
根據(jù)懸浮培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)，來(lái)調(diào)整繼代周期和稀釋比例。最初，每隔5天換1次新鮮培養(yǎng)液。換液時(shí)，先將三角瓶靜置1分鐘，小心吸出上層培養(yǎng)液，然后加入等量的新鮮培養(yǎng)液。換液時(shí)，還應(yīng)注意去掉褐化死亡的愈傷組織塊。
待懸浮培養(yǎng)液變得比較渾濁，較大的愈傷組織塊分散成2mm以下的細(xì)胞團(tuán)塊后，以1份懸浮培養(yǎng)物1份新鮮培養(yǎng)液的比例稀釋，進(jìn)行繼代培養(yǎng)1次。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)速度的加快，適當(dāng)增加稀釋比例。
為了提高懸浮培養(yǎng)物的分散度和均質(zhì)性，用孔徑500μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾懸浮培養(yǎng)物，去掉較大的細(xì)胞團(tuán)塊，同時(shí)縮短繼代周期，每3天繼代培養(yǎng)1次，進(jìn)行強(qiáng)化培養(yǎng)。
當(dāng)建立均質(zhì)、分散的胚性懸浮系后，以1∶4稀釋比例繼代培養(yǎng)，每7天繼代1次，保持懸浮系。
懸浮細(xì)胞系的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基MS無(wú)機(jī)鹽+CH1000mg/L+L-pro500mg/L+肌醇250mg/L+有機(jī)附加液+2.4-D2.0mg/L+Sucrose30mg/L有機(jī)附加液VB15mg/L+VB65mg/L+Gly2mh/L+煙酸5mg/L配成100x的貯備液。
3、懸浮細(xì)胞系的誘變處理及耐鹽愈傷組織的篩選選取三瓶生長(zhǎng)狀態(tài)較好的懸浮細(xì)胞系，分別加入1.5％的甲基磺酸乙酯溶液，使其最終濃度為0.3％，然后放在旋轉(zhuǎn)搖床上分別培養(yǎng)(E1)0.5小時(shí)，(E2)1.5小時(shí)，(E3)2.5小時(shí)，處理完畢后，靜止2分鐘。倒掉上清液，然后用無(wú)菌水沖洗2次，再用懸浮培養(yǎng)液換洗2次最后將誘變處理后的懸浮細(xì)胞系置于原來(lái)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天。然后吸取該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行耐鹽愈傷組織的篩選。
4、懸浮細(xì)胞系和耐鹽愈傷組織的分化(1)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的植株再生先將細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)于MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5周后，將其形成的白色愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，在25℃光照條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化。
懸浮細(xì)胞系的分化培養(yǎng)基MS+ZT0.5mg/L+KT1.0mg/L+Sucrose20mg/L+Agar0.7％。
(2)耐鹽愈傷組織的分化篩選出耐鹽愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)3次后，其中部分耐1.2％NaCl的愈傷組織轉(zhuǎn)入不同的分化培養(yǎng)基中，在25℃光照條件下誘導(dǎo)分化。將獲得再生植株漸次移入砂中、花盆中，然后再移栽于鹽堿地中，直接進(jìn)行耐性檢測(cè)，當(dāng)年成熟的種子，部分繼續(xù)播種，部分進(jìn)行苗期的耐鹽性鑒定。
耐鹽愈傷組織的篩選、繼代培養(yǎng)基MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％再加入不同濃度的NaCl(0.4％、0.8％、1.2％)，分別用P1，P2，P3表示3個(gè)繼代培養(yǎng)基。
耐鹽愈傷組織的分化培養(yǎng)基aMS+NAA1.0mg/L+BA0.5mg/L+GA33.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％。
bMS+IAA0.5mg/L+GA32.0mg/L+KT1.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％。
以上所有培養(yǎng)基PH5.8-6.0，在121℃，15磅壓力下，滅菌18-20分鐘。
營(yíng)養(yǎng)液是MS的液體形式。
注縮略語(yǔ)MSMurashige和Skoog培養(yǎng)基(1962)CH水解酪蛋白Sucrose蔗糖Agar瓊脂L-proL-脯氨酸Gly甘氨酸2.4-D2.4-二氯苯氧乙酸ZT玉米素KT激動(dòng)素
NAAα-萘乙酸BA6-芐基嘌呤GA3赤霉素IAA吲哚乙酸5、種子的Co-60γ射線輻射處理取當(dāng)年成熟的種子，分成4等分，分別用4個(gè)不同的誘變劑量對(duì)照(CK)，1萬(wàn)勒克斯(第1組)、3萬(wàn)勒克斯(第2組)、5萬(wàn)勒克斯(第3組)的Co-60γ射線誘變處理，處理后的種子清洗后，分別播種于總含量為0.796％pH8.9的鹽堿地，進(jìn)行耐鹽變異體的篩選。播種時(shí)，垅長(zhǎng)3m，寬20cm，每條垅的播種量75g，于六月中旬播種，八月上旬對(duì)其出苗率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
(二)常規(guī)育種及篩選1、選擇優(yōu)良單株，混合脫粒，下年混合種植通過(guò)觀測(cè)再生植株在鹽堿地上的生長(zhǎng)發(fā)育狀況、產(chǎn)草量和耐鹽堿能力，從中選擇生長(zhǎng)良好、產(chǎn)草量高和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良單株，混合脫粒，下年進(jìn)行混合種植。
2、第二次選擇優(yōu)良單株，混合脫粒，下年混合種植將上一年混合脫粒的種子，進(jìn)行混合種植，從中選擇生長(zhǎng)良好、產(chǎn)草量高和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良單株，混合脫粒，下年進(jìn)行混合種植。
3、繼續(xù)選擇優(yōu)良單株，混合脫粒，下年混合種植將上一年混合脫粒的種子，進(jìn)行混合種植，從中選擇生長(zhǎng)良好、產(chǎn)草量高和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良單株，混合脫粒，下年進(jìn)行混合種植。
4、如此連選5代，直到混合群體符合標(biāo)準(zhǔn)將上一年混合脫粒的種子，進(jìn)行混合種植，如此連選5代生長(zhǎng)良好、產(chǎn)草量高和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良單株，混合脫粒，直到混合群體符合標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.耐鹽堿短芒大麥品種的育種方法，其特征是a)根據(jù)植物細(xì)胞全能性的理論，以現(xiàn)代生物工程技術(shù)手段(包括植物組織培養(yǎng)、物理和化學(xué)誘變)對(duì)離體培養(yǎng)的短芒大麥幼穗、幼胚、成熟胚等的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系進(jìn)行突變體誘導(dǎo)和分化；b)在鹽堿的環(huán)境條件下，依據(jù)短芒大麥的育種目標(biāo)，對(duì)離體培養(yǎng)所獲得的再生植株的愈傷組織，進(jìn)行農(nóng)藝性狀篩選和分子生物學(xué)鑒定，選育可用于短芒大麥育種或牧草生產(chǎn)的新材料或新品系；c)常規(guī)育種，結(jié)合常規(guī)育種方法，選育出耐鹽堿性更強(qiáng)的短芒大麥新品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征是植物組織培養(yǎng)對(duì)離體培養(yǎng)的短芒大麥幼穗、幼胚、成熟胚的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系進(jìn)行突變體誘導(dǎo)和分化，其步驟為(一)植物組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)及分化1、愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)(1)幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)選取未出旗葉的幼穗，用70％的酒精棉球擦3次，然后在無(wú)菌條件下，用鑷子取出幼穗；選擇長(zhǎng)3.0～6.0cm左右的幼穗，將其剪成5mm左右的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一瓶中放入8～10塊，置于25±1℃，黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織；幼穗的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％；(2)幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)取受粉后12～15天左右的麥穗，用鑷子取出幼胚放于70％的酒精中漂洗40秒鐘，然后移入0.1％的氯化汞溶液中浸洗15分鐘，再用無(wú)菌水沖洗5次；用鑷子或解剖刀損傷幼胚后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25±1℃，黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織；幼胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％；(3)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)取當(dāng)年成熟的種子，用解剖刀切下胚，室溫下浸泡三到五小時(shí)，在70％的酒精中滅菌1分鐘，再在0.1％的氯化汞溶液中漂洗20分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗5次，用解剖刀將胚損傷后，置于25±1℃，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織；待愈傷組織形成后，每個(gè)月繼代培養(yǎng)1次；繼代時(shí)，選取色澤新鮮，白色或淡黃色的、質(zhì)地緊密的且表面具有顆粒狀結(jié)構(gòu)的胚性愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±1℃，光照強(qiáng)度100Lux，每天人工光照10小時(shí)；成熟胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.4-D4.0mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％；
2.懸浮細(xì)胞系的建立選取淡黃色、顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織來(lái)建立懸浮細(xì)胞系；取3～5g新鮮的胚性愈傷組織、放入裝有20ml培養(yǎng)液的、容量為100ml的三角瓶中，置入旋轉(zhuǎn)式搖床上，在轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為25±1℃的散射光條件下，振蕩培養(yǎng)；根據(jù)懸浮培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)，來(lái)調(diào)整繼代周期和稀釋比例；最初，每隔5天換1次新鮮培養(yǎng)液；換液時(shí)，先將三角瓶靜置1分鐘，小心吸出上層培養(yǎng)液，然后加入等量的新鮮培養(yǎng)液；換液時(shí)，還應(yīng)注意去掉褐化死亡的愈傷組織塊；待懸浮培養(yǎng)液變得比較渾濁，較大的愈傷組織塊分散成2mm以下的細(xì)胞團(tuán)塊后，以1份懸浮培養(yǎng)物1份新鮮培養(yǎng)液的比例稀釋，進(jìn)行繼代培養(yǎng)1次；隨著細(xì)胞生長(zhǎng)速度的加快，適當(dāng)增加稀釋比例；為了提高懸浮培養(yǎng)物的分散度和均質(zhì)性，用孔徑500μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾懸浮培養(yǎng)物，去掉較大的細(xì)胞團(tuán)塊，同時(shí)縮短繼代周期，每3天繼代培養(yǎng)1次，進(jìn)行強(qiáng)化培養(yǎng)；當(dāng)建立均質(zhì)、分散的胚性懸浮系后，以1∶4稀釋比例繼代培養(yǎng)，每7天繼代1次，保持懸浮系；懸浮細(xì)胞系的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基MS無(wú)機(jī)鹽+CH1000mg/L+L-pro500mg/L+肌醇250mg/L+有機(jī)附加液+2.4-D2.0mg/L+Sucrose30mg/L；有機(jī)附加液VB15mg/L+VB65mg/L+Gly2mh/L+煙酸5mg/L配成100x的貯備液；
3.懸浮細(xì)胞系的誘變處理及耐鹽愈傷組織的篩選選取三瓶生長(zhǎng)狀態(tài)較好的懸浮細(xì)胞系，分別加入1.5％的甲基磺酸乙酯溶液，使其最終濃度為0.3％，然后放在旋轉(zhuǎn)搖床上分別培養(yǎng)(E1)0.5小時(shí)，(E2)1.5小時(shí)，(E3)2.5小時(shí)，處理完畢后，靜止2分鐘；倒掉上清液，然后用無(wú)菌水沖洗2次，再用懸浮培養(yǎng)液換洗2次最后將誘變處理后的懸浮細(xì)胞系置于原來(lái)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天；然后吸取該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行耐鹽愈傷組織的篩選；
4.懸浮細(xì)胞系和耐鹽愈傷組織的分化(1)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的植株再生先將細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)于MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5周后，將其形成的白色愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，在25℃光照條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化；懸浮細(xì)胞系的分化培養(yǎng)基MS+ZT0.5mg/L+KT1.0mg/L+Sucrose20mg/L+Agar0.7％(2)耐鹽愈傷組織的分化篩選出耐鹽愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)3次后，其中部分耐1.2％NaCl的愈傷組織轉(zhuǎn)入不同的分化培養(yǎng)基中，在25℃光照條件下誘導(dǎo)分化；將獲得再生植株漸次移入砂中、花盆中，然后再移栽于鹽堿地中，直接進(jìn)行耐性檢測(cè)，當(dāng)年成熟的種子，部分繼續(xù)播種，部分進(jìn)行苗期的耐鹽性鑒定；耐鹽愈傷組織的篩選、繼代培養(yǎng)基MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％再加入不同濃度的NaCl(0.4％、0.8％、1.2％)，分別用P1，P2，P3表示3個(gè)繼代培養(yǎng)基；耐鹽愈傷組織的分化培養(yǎng)基aMS+NAA1.0mg/L+BA0.5mg/L+GA33.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％；bMS+IAA0.5mg/L+GA32.0mg/L+KT1.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％；以上所有培養(yǎng)基PH5.8-6.0，在121℃，15磅壓力下，滅菌18-20分鐘；營(yíng)養(yǎng)液是MS的液體形式。
全文摘要
本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，本發(fā)明是運(yùn)用生物工程育種技術(shù)，對(duì)離體培養(yǎng)的野大麥幼穗、幼胚和成熟胚等的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系進(jìn)行突變體誘導(dǎo)和分化，并結(jié)合常規(guī)育種方法培育而成的多年生耐鹽堿優(yōu)良牧草品種，在含鹽量0.8－1.2％、pH值9.5－11.0的鹽堿土上均生長(zhǎng)良好，其耐鹽堿能力超過(guò)羊草，抗旱性強(qiáng)，比堿茅耐旱，同時(shí)具有耐寒、耐瘠等優(yōu)點(diǎn)。分蘗力和生殖力均較強(qiáng)，穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、品質(zhì)較好，粗蛋白含量達(dá)15.30％，干草產(chǎn)量10564.3kg/hm
文檔編號(hào)A01H3/00GK1502226SQ02149020
公開(kāi)日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者李彥舫, 沈景林, 張亞蘭, 李喜文, 陸一鳴, 朱進(jìn), 程曉蕊, 楊柏明, 張成武, 楊松濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)