專利名稱：甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，專用于黃瓜的染色體工程育種。
二、技術(shù)背景在本課題組申請的專利《甜瓜屬野生種用于黃瓜育種的方法》(申請?zhí)?0 1 12271.1---9c)中，我們通過幼胚拯救，首次克服了甜瓜屬野生種和栽培種之間的種間雜交障礙；利用體細胞變異成功地將雙單倍體種間雜種進行了染色體加倍，隨后經(jīng)過育性恢復篩選，培育出世界上第一個甜瓜屬種間雜交雙二倍體新種C.hytivus。該雙二倍體新種攜有野生種C.hystrix的全套染色體組，但作為異源四倍體，雙二倍體新種的育性較低，不利于通過回交來轉(zhuǎn)導利用新種中的有用外源基因進行黃瓜的品種改良。
異源三倍體黃瓜是利用雙二倍體新種C.hytivus改良黃瓜品種的一個重要的中間材料。由于異源三倍體黃瓜的染色體倍性降低了，其與二倍體黃瓜的可交配性得到了增強(Chen et al.，2001)，有利于通過回交向普通栽培黃瓜轉(zhuǎn)導新種攜有的有用的外源性狀。
利用異源三倍體黃瓜還可以獲得一些重要的染色體工程材料，如異源易位系等。這些材料與黃瓜染色體(數(shù)目)相近，性狀轉(zhuǎn)移的效率可得到進一步提高。其它作物的育種實踐表明異源易位系是作物品種改良的理想的染色體材料(Ceoloni et al.，1996)。因此，異源三倍體黃瓜及隨后的優(yōu)良異源易位系也將在甜瓜屬作物的品種改良中發(fā)揮重要的作用。然而，迄今為止，人們還沒有培育出甜瓜屬的異源三倍體黃瓜。
技術(shù)方案 本發(fā)明所提供的甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法，其實施方案如下1、甜瓜屬異源三倍體黃瓜的育種方法，包括將甜瓜屬種間雜交雙二倍體新物種與普通栽培黃瓜進行正反交，雜交后將雜種幼胚置于MS+0.2mg L-16-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得再生植株；以卷須作為染色體的制片材料，對再生植株進行分生細胞的染色體數(shù)目鑒定，獲得甜瓜屬異源三倍體黃瓜(2n＝3x＝26)。
通過頂芽和腋芽等的離體繁殖，保存和擴大異源三倍體黃瓜的種質(zhì)資源。離體快繁培養(yǎng)基包括，不定芽培養(yǎng)基MS+10μM BA或MS+13.3μM BA+1.1μMNAA；生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.2 mg·L-1IBA，0.8gL-1.瓊脂，30g L-1蔗糖，pH＝5.8。
2、上述甜瓜屬異源三倍體黃瓜用于黃瓜育種的方法，包括1)利用異源三倍體黃瓜培育黃瓜異源易位系
選擇上述甜瓜屬異源三倍體黃瓜作母本，雌性系黃瓜GY-14作父本，將雜交的幼胚置于MS+0.2mg L-16-BA的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，獲得再生植株；將C-分帶、同工酶和RAPD分子標記鑒定等技術(shù)相結(jié)合，選擇耐弱光、抗根結(jié)線蟲性狀，獲得長果型異源易位系HHZ1-9-12(2n＝14)和中果型異源易位系HHZ1-9-8(2n＝14)。
2)利用上述獲得的異源易位系培育黃瓜新品種利用上述獲得的長果型異源易位系HHZ1-9-12(2n＝14)和中果型異源易位系HHZ1-9-8(2n＝14)與黃瓜雌性系GY-14進行2～4代輪回回交和選擇，培育出優(yōu)良的黃瓜新品種。
有益效果 本發(fā)明甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和積極效果本發(fā)明是利用世界上唯一的甜瓜屬種間雜交雙二倍體新種與普通栽培黃瓜之間的雜交。由此開始，經(jīng)過胚胎拯救、染色體鑒定、生化、分子技術(shù)標記和綜合性狀選擇等環(huán)節(jié)，首次獲得甜瓜屬異源三倍體黃瓜，是一種重要染色體工程育種的中間材料。隨后研究創(chuàng)制的甜瓜屬的異源易位系，則是可以直接服務(wù)于黃瓜品種改良的材料。本發(fā)明對甜瓜屬、乃至整個蔬菜作物的育種實踐和理論研究無疑都具有重要的借鑒意義；可以預測，本項申請的發(fā)明將極大地推動未來世界的黃瓜的品種改良。
由于拓寬了遺傳基礎(chǔ)，所獲得的甜瓜屬異源三倍體黃瓜和黃瓜新品種無論在露地還是溫室都表現(xiàn)出了普通黃瓜所不具備的對根結(jié)線蟲的抵抗能力。試驗表明，接種后，異源三倍體黃瓜平均的根結(jié)指數(shù)為3.8，抗性中，黃瓜新品種平均約4.1，抗性中；而對照普通黃瓜根結(jié)指數(shù)為5.0，感病。同時，異源三倍體黃瓜和黃瓜新品種也表現(xiàn)出較好的經(jīng)濟性狀。異源三倍體黃瓜每株平均可結(jié)果30個左右，果重約100～150克，長約13厘米，直徑約3厘米，果型指數(shù)約4.3；黃瓜新品種結(jié)果數(shù)與普通黃瓜無異，有長短兩種果型，果型指數(shù)為5～6。異源三倍體黃瓜有時2個果結(jié)在同一節(jié)上，果型整齊。果實綠色，嫩果味似黃瓜，成熟時約有檸檬風味，不含任何苦味。初步的品質(zhì)分析結(jié)果表明，異源三倍體黃瓜果實蛋白質(zhì)的含量為0.78％，礦物質(zhì)為0.35％，分別高于二早子黃瓜的0.59％和0.28％。其余性狀見表1。
四

圖1異源三倍體黃瓜的培育以及利用其進行黃瓜育種的系譜2、雙二倍體新種的植株圖3、雙二倍體的染色體2n＝4x＝38圖4、異源三倍體黃瓜的果實(左)和雙二倍體新物種果實(右)圖5、異源三倍體黃瓜的染色體2n＝3x＝26
將異源三倍體黃瓜與黃瓜雌性系GY-14進行雜交，并將幼胚置于MS添加0.2mg L-16-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得再生植株；取幼嫩的卷須(長約1-3毫米)，進行染色體計數(shù)和C-分帶帶型分析，并結(jié)合同工酶和RAPD分析，篩選出異源易位系；經(jīng)過抗性鑒定和經(jīng)濟性狀評價，篩選出抗根結(jié)線蟲(根結(jié)指數(shù)4.1)、耐弱光(在8000Lx的光強下能正常生長)的優(yōu)良的長果型(果型指數(shù)6.0)的異源易位系HHZ1-9-12。
隨后，利用雌性系GY-14與優(yōu)良異源易位系HHZ1-9-12進行2～4代的輪回回交，篩選出抗根結(jié)線蟲(根結(jié)指數(shù)4.1)、耐弱光(在8000Lx的光強下能正常生長)的長果型(果型指數(shù)6.0)黃瓜新品種。
實施例2 利用上述培育出的異源三倍體黃瓜與黃瓜雌性系GY-14進行雜交，并將MS添加0.2mg L-16-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得再生植株；將利用卷須計數(shù)染色體、C-分帶帶型分析、同工酶和RAPD分析相結(jié)合，篩選出異源易位系；隨后經(jīng)過抗性鑒定和經(jīng)濟性狀評價，篩選出抗根結(jié)線蟲(根結(jié)指數(shù)4.1)、耐弱光(在8000Lx的光強下能正常生長)的中果型(果型指數(shù)5.0)的優(yōu)良異源易位系HHZ1-9-8。
利用雌性系GY-14與異源易位系HHZ1-9-8進行2～4代的輪回育種，篩選出抗根結(jié)線蟲(根結(jié)指數(shù)4.1)、耐弱光(在8000Lx的光強下能正常生長)的中果型(果型指數(shù)5.0)的黃瓜新品種。
表1申請涉及主要材料的特性

權(quán)利要求
1.甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法，包括將甜瓜屬種間雜交雙二倍體新種Cucumis hytivus Chen & Kirkbride和普通栽培黃瓜(C.sativus L.)進行正反種間雜交，隨后將雜種幼胚置于MS+0.2mgL-16-BA培養(yǎng)基上進行組織培養(yǎng)，獲得種間雜種異源三倍體黃瓜植株(2n＝26)，利用花粉刺激雜種果實生長發(fā)育，形成無籽型新品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法，其特征在于以異源三倍體黃瓜植株的頂芽或腋芽為外植體，利用離體快繁擴大異源三倍體的群體規(guī)模，離體快繁的培養(yǎng)基包括不定芽培養(yǎng)基，MS+10μM BA或MS+13.3μM BA+1.1μM NAA；和生根培養(yǎng)基，1/2 MS+0.2mg·L-1 IBA，0.8g L-1.瓊脂，30gL-1蔗糖，pH＝5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法，其特征在于1)利用異源三倍體黃瓜培育黃瓜異源易位系選擇上述甜瓜屬異源三倍體黃瓜作母本，雌性系黃瓜GY-14作父本，將雜交的幼胚置于MS+0.2mg L-16-BA的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，獲得再生植株；將C-分帶、同工酶和RAPD分子標記鑒定等技術(shù)相結(jié)合，選擇耐弱光、抗根結(jié)線蟲性狀，獲得長果型異源易位系HHZ1-9-12(2n＝14)和中果型異源易位系HHZ1-9-8(2n＝14)；2)利用上述獲得的異源易位系培育黃瓜新品種利用上述獲得的長果型異源易位系HHZ1-9-12(2n＝14)和中果型異源易位系HHZ1-9-8(2n＝14)與黃瓜雌性系GY-14進行2～4代輪回回交和選擇，培育出優(yōu)良的黃瓜新品種。
全文摘要
本發(fā)明甜瓜屬異源三倍體黃瓜及其用于黃瓜育種的方法，專用于改良黃瓜新品種。將甜瓜屬種間雜交雙二倍體新種與普通栽培黃瓜通過種間雜交培育出甜瓜屬異源三倍體新型無籽黃瓜。利用異源三倍體黃瓜與黃瓜回交，獲得耐弱光、抗根結(jié)線蟲的異源易位系；將優(yōu)良的異源易位系與雌性系黃瓜進行雜交，培育出耐弱光、抗根結(jié)線蟲的黃瓜新品種。
文檔編號A01H1/02GK1413447SQ0214849
公開日2003年4月30日 申請日期2002年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月11日
發(fā)明者陳勁楓, 羅向東, 錢春桃, 莊飛云, 任剛 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學