專利名稱：診斷未受孕用的試劑盒及使用該試劑盒診斷未受孕的方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒以及使用該試劑盒診斷動(dòng)物未受孕的方法，更具體地說，涉及一種通過檢測(cè)動(dòng)物的血液、乳汁等中的黃體酮濃度，早期、簡(jiǎn)便地診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒及方法。
2.對(duì)相關(guān)技術(shù)的描述正常奶牛的發(fā)情周期是19-22天，且奶牛血液或乳汁中的黃體酮的濃度在發(fā)情日幾乎為0。從發(fā)情日起，黃體酮的濃度逐日提高，并且如果母牛沒有受孕，通常在發(fā)情日后的第19日降低至1ng/ml以下。另一方面，如果奶牛受孕了，則黃體酮的濃度不會(huì)降低。因此，可以通過檢測(cè)奶牛發(fā)情日后第19天至第22天之間未加工的乳汁或血液中的黃體酮濃度來確定奶牛是否受孕。
在二十世紀(jì)九十年代以前，通過專業(yè)人員在奶牛人工受精或交配后的50或60天給奶牛做直腸檢查確定奶牛是否受孕。但是，此種方法通常要求由經(jīng)驗(yàn)豐富的獸醫(yī)進(jìn)行，并且因?yàn)樾枰^長(zhǎng)的時(shí)間來確認(rèn)奶牛未受孕而造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，如果為診斷是否受孕而進(jìn)行的直腸檢查刺激卵巢或胚胎，還有可能發(fā)生卵巢疾病或流產(chǎn)并且奶?？赡苁艿骄o張的刺激。此外，根據(jù)上述方法，可以在人工受精后的50-60天確定未受孕。如果在這一時(shí)期奶牛被檢查出沒有受孕，則需要重新進(jìn)行捕捉未受孕動(dòng)物的發(fā)情征候和人工受精的過程，這將導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失。
因此，從二十世紀(jì)九十年代以來，以簡(jiǎn)單便利的方式診斷奶牛受孕或繁殖問題的方法被成功地開發(fā)出來，例如，一個(gè)例子是使用超聲波診斷裝置診斷受孕/未受孕的方法。但是，由于未受孕診斷的許多情況需要由非專業(yè)人員在野外進(jìn)行，因此需要將超聲波診斷裝置制造得特別結(jié)實(shí)和安全。因此，此種方法裝置的缺陷是對(duì)于在野外使用太大且笨重。此后，一種通過檢測(cè)血液中的黃體酮的濃度而診斷母牛是否受孕的ELISA試劑盒被開發(fā)出來，但是由于要求使用一種昂貴且精密的分析裝置，且診斷方法復(fù)雜，在野外使用此種試劑盒也是困難的。
為克服這些缺陷并通過簡(jiǎn)單的方法診斷未受孕，Laitinen等人開發(fā)出了一種使用化驗(yàn)帶(assay strip)的方法《斯堪的納維亞化學(xué)學(xué)報(bào)》(Acta Chemica Scandinavia，199650141-145)。在設(shè)計(jì)該化驗(yàn)帶時(shí)，將黃體酮的單克隆抗體固定在硝化纖維膜上，取自母牛的試樣(例如乳汁和血液)通過毛細(xì)吸引力穿過膜。此后，結(jié)合了膠態(tài)金粒子的黃體酮-卵清蛋白共軛體(以下稱“黃體酮金共軛體”)遷移通過膜。
此時(shí)，如果試樣中的黃體酮濃度水平較高，則黃體酮首先與黃體酮的單克隆抗體結(jié)合，黃體酮金共軛體無法與黃體酮的單克隆抗體結(jié)合而不能引起化驗(yàn)帶的顏色變化。相反，當(dāng)試樣中的黃體酮濃度水平較低時(shí)，只有少量的黃體酮的單克隆抗體與試樣中的黃體酮結(jié)合，稍后遷移的黃體酮金共軛體與黃體酮的單克隆抗體結(jié)合并引起化驗(yàn)帶的顏色變化。因此，可以通過觀察化驗(yàn)帶的顏色變化或使用色層分離掃描儀確定母牛是否受孕。
但是，上述方法的缺點(diǎn)是由于試樣和黃體酮金共軛體均需分別遷移通過化驗(yàn)帶以分析受孕/未受孕，因此操作程序可能變得復(fù)雜。而且，當(dāng)母牛受孕時(shí)，即當(dāng)試樣中的黃體酮濃度水平高時(shí)，甚至在診斷完成以后，化驗(yàn)帶的顏色也沒有變化并且無法防止由于化驗(yàn)帶本身的缺陷而導(dǎo)致的錯(cuò)誤。此外，使用肉眼觀察，由于沒有根據(jù)顏色變化診斷受孕/未受孕的客觀標(biāo)準(zhǔn)，就存在每個(gè)觀察者都需要進(jìn)行主觀診斷的問題。
本發(fā)明概述為克服這些缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于診斷未受孕的改進(jìn)型試劑盒，以及一種通過在受精后大約20天檢測(cè)血液或乳汁中的黃體酮的濃度而診斷母牛，例如奶牛未受孕的簡(jiǎn)單方便的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于診斷未受孕的試劑盒，以及使用該試劑盒診斷未受孕并能夠防止由于化驗(yàn)帶的缺陷而導(dǎo)致錯(cuò)誤診斷的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用于診斷未受孕的試劑盒，以及使用該試劑盒診斷未受孕并具有未受孕診斷的高度可靠性的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了一種用于診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒，其包括一種包括多個(gè)試樣遷移孔的多孔膜紙帶形式的化驗(yàn)帶，其中黃體酮-牛血清白蛋白(BSA)共軛體被固定在作為測(cè)試線的一端，并優(yōu)選抗IgG被固定在作為對(duì)照線的另一端；以及用于與試樣，例如血液或乳汁反應(yīng)的抗黃體酮IgG-金共軛體。
本發(fā)明還提供了一種用于診斷動(dòng)物未受孕的方法，其包括下列步驟將試樣與抗黃體酮IgG-金共軛體混合；將多孔膜紙帶形成了測(cè)試線的末端部分浸入混合溶液，其中黃體酮-BSA共軛體被固定在紙帶的一個(gè)末端作為測(cè)試線，抗IgG被固定在另一個(gè)末端作為對(duì)照線；通過比較測(cè)試線和對(duì)照線的顏色診斷未受孕。
對(duì)附圖和照片的簡(jiǎn)單描述參照下文的詳細(xì)描述并結(jié)合附圖，能夠更全面地評(píng)價(jià)和理解本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，其中


圖1是按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，形成用于診斷未受孕的試劑盒的化驗(yàn)帶的平面圖；和圖2是解釋按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于診斷未受孕的試劑盒的顏色生成原理的附圖。
對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述為更好地理解本發(fā)明，下文將詳細(xì)說明下面的公開內(nèi)容、附圖和所附權(quán)利要求。
診斷未受孕的本發(fā)明試劑盒的設(shè)計(jì)依據(jù)是下面的事實(shí)在母牛發(fā)情日人工受精約20天后，如果母牛受孕，則血清、血漿或乳汁中的黃體酮濃度不降低，相反，黃體酮濃度會(huì)顯著降低。
因此，用于診斷未受孕的本發(fā)明的試劑盒包括與試樣如被檢測(cè)對(duì)象，如母牛或乳牛的血清、血漿或乳汁混合的抗黃體酮IgG-金共軛體，以及通過肉眼確定試樣中的黃體酮濃度的化驗(yàn)帶。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)母牛未受孕時(shí)，可以通過立即人工受精縮短受測(cè)對(duì)象的未受孕期。
圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案構(gòu)成用于診斷未受孕的試劑盒的化驗(yàn)帶的平面圖。如
圖1所示，帶狀化驗(yàn)帶包括多孔膜紙帶1，其中試樣通過毛細(xì)吸引力從一端遷移至另一端，以及與多孔膜紙帶1結(jié)合并吸收液體試樣通過多孔膜紙帶1的吸收紙帶6。
如果預(yù)定數(shù)量的試樣能夠遷移通過化驗(yàn)帶，并且固定物質(zhì)與試樣中的目標(biāo)物質(zhì)(分析物)能夠發(fā)生反應(yīng)，并因此能夠通過肉眼觀察到反應(yīng)結(jié)果，則對(duì)化驗(yàn)帶的尺寸沒有限制并且該尺寸可以變化，但優(yōu)選4mm×50mm。而且，優(yōu)選多孔膜紙帶1具有多個(gè)優(yōu)選直徑為5-12μm的微孔，以方便地吸收和遷移含有抗黃體酮IgG-金共軛體的液體試樣，如血清、血漿或乳汁。
如果微孔的直徑小于5μm，則由于試樣的吸收和遷移速率過低而使化驗(yàn)帶不實(shí)用。相反，如果微孔的直徑大于12μm，則由于試樣的遷移數(shù)率過大而可能使對(duì)受孕的診斷不準(zhǔn)確。因此，可以根據(jù)所需要的試樣遷移數(shù)率和所需要的診斷時(shí)間適當(dāng)?shù)乜刂莆⒖椎某叽?。?duì)微孔膜紙帶1的材料沒有特別的限制。優(yōu)選微孔膜紙帶1由硝化纖維制成，吸收紙帶6由纖維素紙制成。
在多孔膜紙帶1的一部分上面，黃體酮-BSA共軛體2被作為測(cè)試線固定，測(cè)試線與多孔膜紙帶1的遠(yuǎn)端隔開預(yù)定的距離，優(yōu)選10mm。在與黃體酮-BSA共軛體區(qū)域2的測(cè)試線隔開預(yù)定距離的另一部分上面，抗IgG3被作為對(duì)照線固定。優(yōu)選作為對(duì)照線固定的抗IgG為從選自由鼠、山羊和綿羊所組成的組的一種動(dòng)物中獲得的抗IgG。更優(yōu)選抗IgG為通過將取自與抗黃體酮IgG-金共軛體中的IgG來源相同的動(dòng)物種的IgG免疫而產(chǎn)生。
組成診斷受孕的本發(fā)明試劑盒的抗黃體酮IgG-金共軛體被選定與對(duì)照線中的抗IgG反應(yīng)。優(yōu)選使用抗黃體酮小鼠IgG-金共軛體，并且如果需要，通常可以使用允許的穩(wěn)定劑。例如但不作為限制，可以使用BSA、蔗糖等作為穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑的量可以根據(jù)穩(wěn)定劑的類型而不同，但優(yōu)選占診斷試劑總量的1-5重量％。可以通過冷凍干燥制造含有穩(wěn)定劑的抗黃體酮IgG-金共軛體。在使用時(shí)，將冷凍干燥的共軛體溶解在含有非離子表面活性劑，例如1％的Tween20(HayashiPurechemical Industries Ltd.，Osaka)的含磷的生理鹽水緩沖液中，然后與受測(cè)對(duì)象，如母?；蚰膛５难?、血漿或乳汁混合并作為診斷未受孕的試劑使用。
在操作時(shí)，將一滴(0.04ml)試樣，例如取自在19或21天以前受精的受測(cè)對(duì)象，如母牛或奶牛的血清、血漿或乳汁滴入一滴(約0.025ml)通過將共軛體溶解在預(yù)定數(shù)量的緩沖溶液中制得的抗黃體酮IgG-金共軛體溶液中。將試樣和共軛體混合；然后將化驗(yàn)帶的遠(yuǎn)端(樣品注入部分)浸入混合溶液中。
當(dāng)將化驗(yàn)帶浸入混合溶液中后，溶液通過毛細(xì)吸引力沿化驗(yàn)帶向上方遷移，然后通過黃體酮-BSA共軛體層2的測(cè)試線。此時(shí)，混合溶液中的抗黃體酮IgG-金共軛體通過抗原-抗體反應(yīng)與測(cè)試線2中的黃體酮-BSA共軛體結(jié)合，引起顏色變化。
圖2是說明根據(jù)本發(fā)明用于診斷未受孕的試劑盒的顏色生成原理的圖。如圖2所示，黃體酮-BSA共軛體層2在化驗(yàn)帶的多孔膜紙帶1的上側(cè)形成。當(dāng)含有抗黃體酮IgG-金共軛體10的診斷試劑通過共軛體層2時(shí)，抗黃體酮IgG-金共軛體10與黃體酮-BSA共軛體2層反應(yīng)并結(jié)合。
如果受測(cè)的母牛受孕，則黃體酮20的濃度增加至高于5ng/ml，抗黃體酮IgG-金共軛體10的大部分與包含在試樣中的黃體酮20結(jié)合，因此，只有少量抗黃體酮IgG-金共軛體與多孔膜紙帶1上形成的黃體酮-BSA共軛體層2結(jié)合。因此，測(cè)試線2所生成的顏色比對(duì)照線淡。相反，如果母牛沒有受孕，則黃體酮20的濃度降至1ng/ml，大部分抗黃體酮IgG-金共軛體10與在多孔膜紙帶1上形成的黃體酮-BSA共軛體層2結(jié)合。因此，測(cè)試線2的顏色生成比對(duì)照線深。如上文所述，測(cè)試線2與對(duì)照線3顏色生成的對(duì)比使得可以更容易地診斷出未受孕/受孕。
當(dāng)血液中的黃體酮20與抗黃體酮IgG-金共軛體10混合，然后通過毛細(xì)吸引力到達(dá)固定有黃體酮-BSA的位置2時(shí)，試樣中的黃體酮20和固定在薄膜1上的黃體酮-BSA將與抗黃體酮IgG-金共軛體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，因此，測(cè)試線2的鮮紅程度與試樣中的黃體酮含量成反比地變化。也就是說，可以通過使用肉眼確定黃體酮-BSA共軛體層2的顏色生成程度診斷出受測(cè)對(duì)象未受孕。
穿過黃體酮-BSA共軛體層2的抗黃體酮IgG-金共軛體在固定有綿羊抗鼠IgG的對(duì)照線3上被檢測(cè)出，該抗黃體酮IgG-金-共軛體引起對(duì)照線3的顏色變化。與綿羊抗小鼠IgG結(jié)合的抗黃體酮IgG-金共軛體的量與試樣中黃體酮的量成正比。
因此，使用者(母牛的所有者)可以通過比較黃體酮-BSA共軛體層2的測(cè)試線與固定有抗小鼠抗體3的對(duì)照線的顏色診斷出動(dòng)物未受孕。當(dāng)測(cè)試線2的顏色比對(duì)照線淡時(shí)，可以斷定動(dòng)物受孕。
下表1表明在人工受精后的第19日、第20日和第21日使用未受孕診斷的本發(fā)明試劑盒對(duì)在韓國(guó)長(zhǎng)大的母牛進(jìn)行的受孕診斷。
表1 如表1所示，用于診斷未受孕的本發(fā)明試劑盒在受孕診斷試驗(yàn)中具有93.2％的準(zhǔn)確率，在未受孕診斷試驗(yàn)中具有96.7％的準(zhǔn)確率。因此，本發(fā)明用于診斷未受孕的試劑盒能夠獲得高準(zhǔn)確率的受孕/未受孕診斷，并在未受孕診斷中特別準(zhǔn)確。也就是說，由于使用者能夠在人工受精后準(zhǔn)確地挑選出未受孕的動(dòng)物，從而縮短未受孕期，因此用于診斷未受孕的本發(fā)明試劑盒具有很好的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。
根據(jù)本發(fā)明用于診斷未受孕的試劑盒能夠通過血液或乳汁中的黃體酮濃度診斷出母牛，例如在韓國(guó)長(zhǎng)大的母牛、奶?；蛟谌毡鹃L(zhǎng)大的母牛受孕/未受孕，特別是未受孕。由于用于診斷未受孕的本發(fā)明的試劑盒帶有一個(gè)可以和測(cè)試線對(duì)比的對(duì)照線，因此可以確定化驗(yàn)帶的缺陷并能夠客觀、十分準(zhǔn)確地診斷出未受孕。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒，其包括一種帶有多個(gè)試樣遷移孔的多孔膜紙帶形式的化驗(yàn)帶，其中黃體酮-BSA共軛體被作為測(cè)試線固定在一端，抗IgG被作為對(duì)照線固定在另一端；及與試樣反應(yīng)的抗黃體酮IgG-金共軛體。
2.權(quán)利要求1所要求的診斷未受孕的試劑盒，其中對(duì)照線的IgG得自選自由鼠、山羊和綿羊所組成的組中的一種動(dòng)物。
3.權(quán)利要求1所要求的診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒，其中的抗黃體酮IgG-金共軛體被溶解在含有非離子表面活性劑的的含磷生理鹽水緩沖液中使用。
4.權(quán)利要求1所要求的診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒，其中的多個(gè)孔具有5-12μm的直徑。
5.一種診斷動(dòng)物未受孕的方法，其包括下列步驟將試樣與抗黃體酮IgG-金共軛體混合；將多孔膜紙帶形成了測(cè)試線的末端部分浸入混合溶液，其中黃體酮-BSA共軛體被固定在紙帶的一個(gè)末端作為測(cè)試線，抗IgG被固定在另一個(gè)末端作為對(duì)照線；及通過比較測(cè)試線與對(duì)照線的顏色診斷未受孕。
6.權(quán)利要求5所要求的診斷動(dòng)物未受孕的方法，其中試樣中的黃體酮和黃體酮-BSA共軛體中的黃體酮與測(cè)試線中的抗黃體酮小鼠IgG-金共軛體競(jìng)爭(zhēng)性地反應(yīng)。
7.一種診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒，其包括一種帶有多個(gè)試樣遷移孔的多孔膜紙帶形式的化驗(yàn)帶，其中黃體酮-BSA共軛體被作為測(cè)試線固定在一端；及與試樣反應(yīng)的抗黃體酮IgG-金共軛體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒以及使用該試劑盒診斷動(dòng)物未受孕的方法,更特別涉及一種包括下列組成部分的診斷動(dòng)物未受孕的試劑盒:一種帶有多個(gè)試樣遷移孔的多孔膜紙帶形式的化驗(yàn)帶,其中黃體酮－BSA共軛體被作為測(cè)試線固定在一端,抗IgG被作為對(duì)照線固定在另一端;以及與試樣如血液或乳汁反應(yīng)的抗黃體酮IgG－金共軛體。本發(fā)明診斷未受孕的試劑盒能夠在奶牛人工受精后大約20天在不使用任何特殊工具的情況下化驗(yàn)出奶牛未受孕。而且,由于未受孕診斷系通過比較測(cè)試線與對(duì)照線的顏色實(shí)現(xiàn),因此使用本試劑盒能夠獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。
文檔編號(hào)A01K67/00GK1379246SQ01140279
公開日2002年11月13日 申請(qǐng)日期2001年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月4日
發(fā)明者成煥厚, 趙民, 元裕德, 金仁煜 申請(qǐng)人:株式會(huì)社綠十字, 大韓民國(guó)(管理部署農(nóng)村振興廳)