專利名稱：用于冷凍犬精液的組合物,應(yīng)用該組合物冷凍犬精液的方法和使用該冷凍犬精液進(jìn)行人 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于冷凍犬精液的組合物，應(yīng)用該組合物冷凍犬精液的方法和使用該冷凍犬精液進(jìn)行人工授精的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于冷凍犬精液的組合物，其中在精液冷凍后于預(yù)定時(shí)間內(nèi)將精液解凍，精液中存活精子的數(shù)量及其形狀和生存能力保持不變，以及應(yīng)用該組合物冷凍犬精液的方法，和人工授精的方法，其包括將冷凍的犬精液在適當(dāng)?shù)牡攸c(diǎn)和時(shí)間解凍，并將其插入雌犬陰道。
對于家畜和寵物飼養(yǎng)，應(yīng)用液體精液的人工授精通過將從同一雄性動(dòng)物收集的精液與稀釋液混合，以增加可供注射的液體的體積，可以使幾個(gè)雌性動(dòng)物授精。因此，通過進(jìn)行人工授精，可以收集優(yōu)異的或純的精液，并使幾個(gè)雌性動(dòng)物同時(shí)被受精，由此可以產(chǎn)生優(yōu)良的品種并保存純的品種。
為了成功地獲得具有上述幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)的人工授精，開發(fā)出適當(dāng)?shù)南♂屢阂殉蔀橐粋€(gè)重要問題。由于數(shù)十年前已開始稀釋液的研究，目前已開發(fā)出用于豬、馬、牛的稀釋液，并已投入應(yīng)用。而用于犬精液的稀釋液研究尚未成熟。
雌性動(dòng)物的受精需要使用一種長時(shí)間保存動(dòng)物精液而不損失優(yōu)異精液的新鮮性的方法，該方法會(huì)對家畜和寵物行業(yè)的發(fā)展起到重要的貢獻(xiàn)作用。
冷凍方法最適合于長時(shí)間保存精子。然而，還沒有具體開發(fā)出犬精液的冷凍方法。盡管不十分清楚，未開發(fā)出犬精液冷凍方法的原因可能是未能完全開發(fā)出用于冷凍具有特殊性質(zhì)的犬精液精子的試劑，以及應(yīng)用該試劑的方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種通過應(yīng)用所述組合物冷凍從一個(gè)雄性犬收集的精液的方法，通過所述方法該精液可以儲存很長一段時(shí)間并可以方便地被攜帶，通過所述方法該冷凍犬精液可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間被解凍，以用于人工授精。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種應(yīng)用根據(jù)冷凍方法冷凍的精液進(jìn)行人工授精的方法，通過所述方法可以繁殖優(yōu)異的動(dòng)物，并且該方法可以被廣泛推廣。
為完成第一個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種用于冷凍犬精液的組合物，其包括基于100ml蒸餾水的0.25-4.5g檸檬酸鈉、0.45-4.0g右旋糖、0.01-0.3g青霉素、50,000-500,000 IU鏈霉素、0.25-0.45g過氧化氫酶、0.045-0.25g蛋黃、1.5-15ml甘油和0.02-0.1μg犬血清。
為完成第二個(gè)目的，本發(fā)明提供了應(yīng)用該組合物冷凍犬精液的方法，其包括以下步驟(a)通過按摩方法或電擊(electrical shock)收集雄性犬的精液，(b)離心收集到的精液，分離并除去上清液，只留下下層的精液，(c)將下層的精液與組合物等體積混合，預(yù)冷混合物，(d)進(jìn)一步將該組合物加入到步驟(c)得到的混合物中，將精液與該組合物的體積比降低至1∶2，再次冷卻得到的混合物，和(e)將液體氮加入到步驟(d)得到的混合物中，冷凍該混合物。
為完成第三個(gè)目的，本發(fā)明提供了用于犬人工授精的方法，包括下列步驟(a)檢測雌犬準(zhǔn)確的排卵期以改善生殖率，(b)將為完成本發(fā)明第二個(gè)目的的方法制備的冷凍的精液加入到0.3-1.5wt％氯化鈉溶液和犬血清的混合物中，加熱至30-40℃，將其解凍，(c)通過顯微鏡測定解凍的精液中精子的活動(dòng)能力，和(d)將解凍的精液注入到雌犬的陰道，按摩雌犬的陰蒂。
本發(fā)明者進(jìn)行了廣泛的研究，開發(fā)了用于冷凍犬精液的方法以及應(yīng)用其的組合物，發(fā)現(xiàn)了通過將犬血清與類似于用于?；蜇i的常規(guī)稀釋液的組合物相結(jié)合，可以冷凍儲存犬精液，由此完成了本發(fā)明。
下面將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。
先描述用于冷凍犬精液的組合物。
按照本發(fā)明的用于冷凍犬精液的組合物的制備是通過將用于調(diào)節(jié)緩沖功能、酸性(pH)和精子滲透壓的0.25-4.5g檸檬酸鈉、作為新陳代謝和能量源的0.45-4.0g右旋糖、作為用于防止感染的抗生素的0.01-0.3g青霉素、50,000-500,000 IU鏈霉素、0.25-0.45g過氧化氫酶、0.045-0.25g蛋黃、1.5-15ml甘油和0.02-0.1μg犬血清均勻混合到100ml蒸餾水中進(jìn)行的。由此制備的組合物以大約2ml為單位冷凍，當(dāng)使用時(shí)將其解凍。
按照本發(fā)明的組合物能夠儲存精液很長一段時(shí)間，并能同時(shí)維持冷凍精液中含有的精子的生存能力和活動(dòng)能力，其含有在解凍后表現(xiàn)出正常繁殖能力和傳遞速率的犬血清。
下面，將描述應(yīng)用該組合物的用于冷凍犬精液的方法。
冷凍犬精液第一步是先收集犬精液。作為精液收集方法，可以使用本領(lǐng)域公知的方法，而沒有任何限制，優(yōu)選按摩方法或電擊(electricalshock)。下面簡要描述應(yīng)用最廣泛的按摩方法。
由于精子與尿混合后迅速死亡，優(yōu)選雄犬在收集精液前先小便。然后將雄犬的生殖器插入具有人工陰道的測試管中進(jìn)行按摩，使雄犬的精液射入到測試管中。為了使通過該方法收集精液更有效，讓發(fā)情的雌犬在雄犬周圍徘徊?；蛘?，將含有發(fā)情雌犬的陰道分泌物的冷凍棉花或海棉解凍，當(dāng)收集精液時(shí)讓雌犬聞到其氣味。
在應(yīng)用按摩方法收集精液時(shí)，將精液分成三份樣品，在不同的試管中收集。其中，含有精子的精液樣品是第二份收集的樣品。每份樣品收集的時(shí)間間隔大約是10-20秒。然而，在某些情況下第一和第二份樣品間的時(shí)間間隔太短以至于無法辨別。在本發(fā)明中優(yōu)選使用第二份樣品。然而，當(dāng)無法從第二份樣品區(qū)別第一份樣品時(shí)，將三份樣品都收集到一個(gè)測試管中備用。
然后通過離心方法分離收集到的精液，棄去上清液，只留下下層沉積的精液，離心在大約500-1100RPM/分進(jìn)行6分鐘。
將下層沉積的精液與上述制備的組合物在室溫等體積混合，然后預(yù)冷混合物。其中冷卻時(shí)間為約10-20分鐘，冷卻溫度為約5℃。在室溫下進(jìn)一步將預(yù)冷的混合物與組合物混合，得到精液與組合物以1∶2的體積比混合的混合物，然后再次在相同的溫度和時(shí)間下進(jìn)行冷卻。經(jīng)過預(yù)冷和再冷的冷卻步驟，精液和混合物完全均勻混合。
然后通過滴管吸取預(yù)定量的再次冷卻混合物，將2-3滴滴到干冰的表面。由于干冰的表面溫度為大約-79℃，該混合物被冷凍到該溫度。將該冷凍的混合物與干冰分離，置于裝有約-196℃液氮的容器中，然后完全密封，由此完成了冷凍犬精液的過程。由于該冷凍的混合物在液氮中為小球狀，該方法被稱為“小球(pellet)方法”。
除了上述小球方法，犬精液可以通過應(yīng)用吸管的方法進(jìn)行冷凍，下面簡要描述該方法。
將再次冷卻的混合物細(xì)分為大約0.5ml的樣品，放入吸管中。每20-30個(gè)吸管分成一組，浸入到含有液氮的容器中。當(dāng)吸管浸入到容器中進(jìn)行冷凍時(shí)，是將它們逐漸浸入，而不是立即浸入到容器的底部。開始，將它們浸入到容器的的上部，保持一段預(yù)定的時(shí)間，然后將它們浸入到容器的中部，保持一段預(yù)定的時(shí)間，然后浸入到容器的底部。
由此冷凍的精液可以運(yùn)輸和儲存很長一段時(shí)間，如果需要在解凍后可以用作人工授精。
下面接著描述應(yīng)用冷凍精液的人工授精方法。
首先，為了進(jìn)行人工授精，進(jìn)行測試以確定雌犬是否處于排卵期。排卵期測試采用本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行，如陰道細(xì)胞測試或激素測試。
然后，通過如下方法將冷凍的精液解凍將冷凍的精液加入到0.3-1.5wt％氯化鈉溶液和加熱的少量犬血清的混合物中，將混合物加熱至30-40℃，其有利于維持精子的生存能力和形狀。并且，盡管該混合物可以直接加熱，但由于很難控制溫度，優(yōu)選將含有氯化鈉溶液和犬精液的密封容器浸入到約50℃熱水中進(jìn)行加熱。
在應(yīng)用由此解凍的精液進(jìn)行人工授精前，通過顯微鏡測定解凍的精液中精子的數(shù)量、形狀和活動(dòng)能力。成功的人工授精取決于向前移動(dòng)的精子的數(shù)量。根據(jù)它們的活動(dòng)能力將精子分為四類。
0類表示精子只是尾部移動(dòng)，而不能向前移動(dòng)的情況，1類表示少于20％的精子向前移動(dòng)的情況，2類表示20-50％的精子向前移動(dòng)的情況，3類表示50-80％的精子向前移動(dòng)的情況，4類表示超過80％的精子向前移動(dòng)的情況。當(dāng)將解凍的精液置于玻片上并通過顯微鏡觀察時(shí)，只有2類或更高類活動(dòng)能力的精液可以用于人工授精。
然后，將解凍的精液注入到處于產(chǎn)卵期的雌犬的陰道，按摩雌犬的陰蒂，完成人工授精。
除了上述人工授精方法，解凍的精液可以通過外科手術(shù)的方式注入到雌犬的子宮。換句話說，肚臍下部切一大約2cm小口，拉起子宮，通過注射器直接將雄犬的精液注入到雌犬的子宮中。然后，依次縫合腹膜、腹肌和皮膚。
進(jìn)行發(fā)明的最佳實(shí)施方式通過下面實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，它們絕不是為了限制本發(fā)明的范圍。
檸檬酸鈉 0.35g右旋糖2.5g青霉素0.02g鏈霉素100,000 IU過氧化氫酶0.35g蛋黃 0.05g甘油 2ml
犬血清 0.05μg犬精液的冷凍方法通過電擊(electrical shock)收集體重43kg的6歲牧羊犬的精液。收集的精液量為6.2ml。然后通過離心方法分離收集到的精液，棄去上清液，只留下下層沉積的精液，在500-1100RPM/分下離心6分鐘。
將由此分離的下層精液與上述制備的組合物在室溫等體積混合，然后預(yù)冷混合物。其中冷卻時(shí)間為10-20分鐘，冷卻溫度為約5℃。然后將組合物進(jìn)一步加入到預(yù)冷的混合物中，使精液與組合物以體積比1∶2混合。然后將得到的混合物在相同的溫度和時(shí)間下再次進(jìn)行冷卻。
然后通過滴管吸取預(yù)定量的再次冷卻的混合物，將2-3滴滴到干冰的表面。由于干冰的表面溫度為約-79℃，該混合物被冷凍到該溫度。將該冷凍的混合物與干冰分離，置于裝有約-196℃液氮的容器中，然后完全密封，由此完成了冷凍犬精液的過程。應(yīng)用冷凍精液的人工授精三個(gè)體重30kg的3歲雌性牧羊犬用作人工授精。通過陰道細(xì)胞測試以確定雌犬是否處于排卵期。
然后，需要將上述方法冷凍的精液解凍。解凍是通過如下的方法進(jìn)行的將冷凍的精液加入到0.3-1.5wt％氯化鈉溶液和少量犬血清的混合物中，將混合物加熱至38℃，保持5小時(shí)。
然后，在應(yīng)用該解凍的精液進(jìn)行人工授精前，通過將解凍的精液置于玻片上用顯微鏡觀察，以檢測存活精子的活動(dòng)能力。成功的人工授精取決于向前移動(dòng)的精子的數(shù)量。向前移動(dòng)的精子的百分比大約為85％，其適合于人工授精。
下一步，將解凍的精液分成三份，然后注入到處于產(chǎn)卵期的雌犬的陰道。然后按摩每只雌犬的陰蒂5分鐘，完成人工授精。
人工授精完成后1個(gè)月進(jìn)行懷孕檢測，結(jié)果所有三只雌犬都已懷孕。后來三只雌犬分別生出4、6和9只健康小狗。
在本實(shí)施例中，按照與實(shí)施例1相同的方法制備冷凍犬精液的組合物，只是使用的是0.02μg犬血清。
然后通過與實(shí)施例1相同的方法，應(yīng)用該組合物進(jìn)行犬精液的冷凍和人工授精。
在該實(shí)施方案中，使用一只體重40kg的5歲雄性牧羊犬和三只3歲的體重為25kg、30kg和28kg的雌性牧羊犬。
解凍精液的活動(dòng)能力測試結(jié)果表明精子向前移動(dòng)的百分比為60％，其適合用于人工授精。
人工授精完成后1個(gè)月進(jìn)行懷孕檢測，結(jié)果兩只雌犬都已懷孕。后來兩只雌犬分別生出5和6只健康小狗。對照實(shí)施例1在該對照實(shí)施例中，按照實(shí)施例1制備用于冷凍犬精液的相同組合物，并按照與實(shí)施例相同的方法冷凍犬精液，除了組合物與犬精液的體積比為1∶1外。并按照與實(shí)施例1相同的方法收集同一只雄犬的犬精液。
按照與實(shí)施例1相同的方法解凍冷凍的精液，測試解凍的精液中精子的活動(dòng)能力。測試結(jié)果表明精子向前移動(dòng)的百分比小于20％，其不適合用于人工授精。對照實(shí)施例2在該對照實(shí)施例中，按照與實(shí)施例1相同的方式制備用于冷凍犬精液的相同組合物，除了組合物中不含有犬血清外。冷凍方法和解凍方法與實(shí)施例1中相同，并按照與實(shí)施例1相同的方法收集同一只雄犬的犬精液。
按照該對照實(shí)施例冷凍和解凍的精子的活動(dòng)能力測試表明，精子只是尾部活動(dòng)，而不能向前移動(dòng)，其不適合用于人工授精。
如上所述，本發(fā)明提供了用于冷凍犬精液的方法，其中犬精液由于其精子的特性，難于冷凍儲存，本發(fā)明還提供了該方法中使用的組合物。因此，犬精液可以在冷凍狀態(tài)下保存，由此可以保留犬的優(yōu)良品種。并且，冷凍的雄性犬精液可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和地點(diǎn)用于人工授精，因此能夠增加犬的出生率。
權(quán)利要求
1.一種用于冷凍犬精液的組合物，其包括基于100ml蒸餾水的0.25-4.5g檸檬酸鈉、0.45-4.0g右旋糖、0.01-0.3g青霉素、50,000-500,000 IU鏈霉素、0.25-0.45g過氧化氫酶、0.045-0.25g蛋黃、1.5-15ml甘油和0.02-0.1μg犬血清。
2.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所要求的組合物冷凍犬精液的方法，其包括以下步驟(a)通過按摩方法或電擊收集雄性犬的精液；(b)離心收集到的精液，分離并除去上清液，只留下下層的精液；(c)將下層的精液與組合物等體積混合，預(yù)冷混合物；(d)進(jìn)一步將該組合物加入到步驟(c)得到的混合物中，將精液與該組合物的體積比降低至1∶2，再次冷卻得到的混合物；和(e)將液體氮加入到步驟(d)得到的混合物中，冷凍該混合物。
3.一種用于犬人工授精的方法，包括下列步驟(a)檢測雌犬準(zhǔn)確的排卵期以改善生殖率；(b)將如權(quán)利要求2的方法制備的冷凍的精液加入到0.3-1.5wt％氯化鈉溶液和犬血清的混合物中，加熱至30-40℃，將其解凍；(c)通過顯微鏡測定解凍的精液中精子的活動(dòng)能力；和(d)將解凍的精液注入到雌犬的陰道，按摩雌犬的陰蒂。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于冷凍犬精液的組合物,應(yīng)用該組合物冷凍犬精液的方法和使用該冷凍犬精液進(jìn)行人工授精的方法。用于冷凍犬精液的組合物含有0.25－4.5g檸檬酸鈉、0.45－4.0g右旋糖、0.01－0.3g青霉素、50,000－500,000 IU鏈霉素、0.25－0.45g過氧化氫酶、0.045－0.25g蛋黃、1.5－15ml甘油和0.02－0.1μg犬血清。冷凍犬精液的方法包括以下步驟:(a)通過按摩方法或電擊(electrical shock)收集雄性犬的精液,(b)離心收集到的精液,分離并除去上清液,只留下下層的精液,(c)將下層的精液與組合物等體積混合,預(yù)冷混合物,(d)進(jìn)一步將該組合物加入到步驟(c)得到的混合物中,將精液與該組合物的體積比降低至1∶2,再次冷卻得到的混合物,(e)將液體氮加入到步驟(d)得到的混合物中,冷凍該混合物。
文檔編號A01K67/00GK1351484SQ00808000
公開日2002年5月29日 申請日期2000年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月28日
發(fā)明者孫華燮 申請人:孫華燮