專利名稱：:含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：[0001]本發(fā)明涉及一種葉綠體表達(dá)載體，尤其涉及一種含EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因玉米葉綠體表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及該EPSP合酶基因玉米葉綠體表達(dá)載體在提高玉米草甘膦抗性中的應(yīng)用，屬于玉米抗草甘膦轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：[0002]1988年Boynton等首次利用基因槍法將帶有atpB野生型基因的葉綠體DNA轟擊了atpB突變的衣藻，使其恢復(fù)了光合作用的能力，從而標(biāo)志著葉綠體基因工程的開始。1900年首次利用基因槍法將rrnie基因在煙草葉綠體中得到表達(dá)，拉開了高等植物葉綠轉(zhuǎn)化的帷幕。水稻、玉米及小麥等禾本科植物是重要的糧食作物，但是葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在禾本科植物的應(yīng)用進(jìn)展卻很緩慢。2006年，Lee等首次將GFP和aadA基因成功重組到水稻(Oryzasativa)葉綠體基因組中，為葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在禾本科植物中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)(Lee,S.Μ.，etal.，Plastidtransformationinthemonocotyledonouscerealcrop,rice(Oryzasativa)andtransnmissionoftransgenestotheirprogeny.MolCells，2006.21(3):401-410.)。李軼女等(李軼女等.水稻葉綠體表達(dá)體系的建立及抗PPT葉綠體轉(zhuǎn)化植株的獲得.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007.40(9):1849-1855.)選擇ndhF與trnL的基因間序列作為除草劑PPT抗性基因bar定點(diǎn)整合的位點(diǎn)，將bar基因重組到水稻葉綠體基因中，bar基因在水稻基因組中正常的表達(dá)，既提高了水稻抗PPT的能力，又可以作為轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。Cui等利用基因槍法將GFP和nptII基因轉(zhuǎn)化小麥未成熟盾片和花序，培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)化植株，為葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)成功的應(yīng)用到禾本科植物培育新的品種奠定了基礎(chǔ)(Cui，C.,etal.，Stablechloroplasttransformationofimmaturescutellaandinflorescencesinwheat(TriticumaestivumL.).ActaBiochimBiophysSin(Shanghai).43(4)p.284-91.)。[0003]葉綠體轉(zhuǎn)化的表達(dá)效率高且外源基因可以定點(diǎn)整合，顯花植物每個(gè)葉肉細(xì)胞含有約100個(gè)葉綠體，每個(gè)葉綠體含有約100個(gè)葉綠體基因組拷貝，如果完全同質(zhì)化并有強(qiáng)啟動(dòng)子存在，外源基因可以得到高效的表達(dá)，同時(shí)葉綠體對(duì)外源基因的表達(dá)有很強(qiáng)的承受能力。葉綠體可以直接表達(dá)來自原核的基因；葉綠體基因組具有原核性，葉綠體基因組多順反子轉(zhuǎn)錄、基因排列、調(diào)控方式、密碼子的偏愛性等與原核性很相似。葉綠體的原核性利于原核來源基因的表達(dá)。但是真核基因在葉綠體基因中也能很好的表達(dá)。多基因可以同時(shí)轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率；葉綠體基因組具有重疊基因，是以多順反子為轉(zhuǎn)錄單位，產(chǎn)生多順反子mRNA來合成蛋白質(zhì)，所以由一個(gè)啟動(dòng)子引導(dǎo)下的多個(gè)外源基因可以同時(shí)在葉綠體中表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)，多個(gè)外源基因可以同時(shí)進(jìn)行表達(dá)，而不相互影響，避免因多個(gè)相同的啟動(dòng)子調(diào)控多個(gè)基因在表達(dá)時(shí)產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。葉綠體轉(zhuǎn)化沒有載體序列，位置效應(yīng)和多效應(yīng)；屬于母性遺傳，后代材料穩(wěn)定；安全性高。葉綠體是母系遺傳，外源基因不會(huì)隨花粉傳播，造成基因漂移。[0004]草甘膦是一種高效、廣譜、低殘留、低毒、易被微生物分解和內(nèi)吸傳導(dǎo)的非選擇性的除草劑，被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，其對(duì)大多數(shù)植物具有滅生性。由于草甘膦使用容易、高效、價(jià)格便宜，各國(guó)不斷增加草甘膦的生產(chǎn)量滿足日益增加的需求。轉(zhuǎn)基因的抗草甘膦作物大面積推廣給農(nóng)民提供了草甘膦使用的新領(lǐng)域。1996年孟山都公司開發(fā)的抗草甘膦大豆GTS40-3-2首次銷售，到目前為止已經(jīng)有超過1000個(gè)商業(yè)化的抗草甘膦大豆品種。[0005]迄今為止，抗草甘膦的大豆、棉花、玉米、花生、煙草、甜菜等作物得到了推廣。2003年全世界抗草甘膦大豆種植面積大于0.41億hm2，其它抗除草劑的作物也大量的推廣，主要是抗草甘膦品種。從已經(jīng)推廣的抗草甘膦作物來看，主要是美國(guó)的孟山都公司開發(fā)，轉(zhuǎn)入的基因是CP4EPSPS基因。孟山都將抗草甘膦作物種子與農(nóng)達(dá)除草劑捆綁式銷售，已經(jīng)形成了獨(dú)霸的局面。雖然從微生物、植物等克隆出了一些抗除草劑的EPSPS基因，也獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物，但是很少能達(dá)到推廣的水平。[0006]目前中國(guó)國(guó)內(nèi)還沒有出現(xiàn)廣泛推廣的抗草甘膦的新品種。[0007]葉綠體轉(zhuǎn)化體系具有表達(dá)效率高且外源基因可以定點(diǎn)整合，無論是真核還是原核的外源基因都可以在葉綠體中高效的表達(dá)，尤其是葉綠體屬于母系遺傳，后代材料穩(wěn)定，安全性高，外源基因不會(huì)隨花粉傳播，造成基因漂移等優(yōu)勢(shì)，所以受到愈來愈多的重視。
發(fā)明內(nèi)容[0008]本發(fā)明的目的之一是提供一種含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體；[0009]本發(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建所述含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的方法；[0010]本發(fā)明的目的之三是將所構(gòu)建的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體應(yīng)用于提高玉米的草甘膦抗性。[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，該含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體包括EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)編碼基因的表達(dá)盒，玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶編碼基因的表達(dá)盒位于同源重組片段atpB和rbcL之間。[0012]所述的EPSP合酶基因是公開號(hào)為CN1014^499A(發(fā)明名稱高耐受草甘膦的EPSP合酶及其編碼序列)中所述的編碼EPSP合酶的編碼基因，該基因序列已在該專利文獻(xiàn)(CN101429499A)中全部公開(注EPSP合酶基因?yàn)镃N101^9499A序列表中的SEQIDN02或SEQIDNO3所示的核苷酸序列)。[0013]所述的EPSP合酶基因的表達(dá)盒由啟動(dòng)子、EPSP合酶基因和終止子組成；將EPSP合酶基因置于所述玉米葉綠體特異啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下，即得到本發(fā)明所述的EPSP合酶基因的表達(dá)盒。其中，所述的啟動(dòng)子是玉米葉綠體特異啟動(dòng)子，例如，可以是prrn、atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL等啟動(dòng)子，優(yōu)選的，所述的啟動(dòng)子為prrn啟動(dòng)子，本發(fā)明進(jìn)一步地將prrn啟動(dòng)子序列進(jìn)行了優(yōu)化，將一段含有SD序列的序列(GGGAGG)引入prrn啟動(dòng)子的3’端，提高prrn啟動(dòng)子與核糖體的結(jié)合能力，從而提高下游基因的翻譯水平，所得到的啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQIDNo.1所示；所述的終止子優(yōu)選為psbA終止子，其核苷酸序列為SEQIDNO:2所示。[0014]所述的同源重組片段atpB的核苷酸序列為SEQIDNo.3所示；[0015]所述的同源重組片段rbcL的核苷酸序列為SEQIDNo.4所示。[0016]為了達(dá)到更好的效果，所述的EPSP合酶基因玉米葉綠體表達(dá)載體中還可含有顯性選擇標(biāo)記基因的葉綠體基因表達(dá)盒；該顯性選擇標(biāo)記基因優(yōu)選為細(xì)菌來源的抗菌素抗性基因，更優(yōu)選為抗潮霉素基因(HPT)，其核酸序列為SEQIDNo.5所示；作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案，可以將抗潮霉素基因插入到玉米葉綠體基因組的16srRNA啟動(dòng)子和psbA終止子之間構(gòu)建得到抗潮霉素的葉綠體基因表達(dá)盒。[0017]本發(fā)明另一方面是提供了一種構(gòu)建所述EPSP合酶基因玉米葉綠體表達(dá)載體的方法，該方法包括以下步驟[0018](1)、將EPSP合酶編碼基因可操作的與玉米葉綠體特異啟動(dòng)子和終止子相連接，使EPSP合酶編碼基因置于玉米葉綠體特異啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下，得到EPSP合酶編碼基因的表達(dá)盒；[0019](2)、將玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL分別連接在EPSP合酶編碼基因的表達(dá)盒的兩側(cè)，即得。[0020]本發(fā)明EPSP合酶基因玉米葉綠體表達(dá)載體構(gòu)建的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，包括將EPSP合酶編碼基因克隆到pSK-prrn-T載體的EindIII和)(bal之間，使EPSP合酶基因片段置于玉米葉綠體基因特異啟動(dòng)子ftrn和I^sbA終止子調(diào)控之下得到質(zhì)粒pSK-prrn-A15N-T；將抗潮霉素基因表達(dá)盒插入質(zhì)粒pSK-prrn-A15N_T的Mil和KpnI之間構(gòu)建pSK-prrn-A15N-T-hpt。再將兩個(gè)表達(dá)盒克隆入含有同源重組片段atpB_rbcL的pBR質(zhì)粒BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建得到EPSPSA15N玉米葉綠體表達(dá)載體pBR_PTN_hpt；將pBR-PTN_hpt用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織，篩選得到轉(zhuǎn)化有EPSPSA15N基因的玉米抗性愈傷組織，誘導(dǎo)玉米抗性愈傷組織再生獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株。更進(jìn)一步的，本發(fā)明將所構(gòu)建的EPSP合酶基因玉米葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體，以提高玉米的草甘膦抗性。[0021]為達(dá)上述目的，可以將構(gòu)建的EPSP合酶編碼基因玉米葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米，篩選得到玉米抗性愈傷組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體；誘導(dǎo)抗性愈傷或細(xì)胞分化，再生獲得抗性植株，即得。[0022]所述“轉(zhuǎn)化”是將EPSP合酶編碼基因?qū)氲接衩子鷤M織或細(xì)胞，再采用本領(lǐng)域熟知的細(xì)胞或組織培養(yǎng)方法，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織或細(xì)胞再生得到完整植株。所述的“轉(zhuǎn)化”方法包括顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法以及高速?gòu)椀擂Z擊等，優(yōu)選為基因槍法。[0023]采用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織、細(xì)胞再生獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植株(McCormicketal.PlantCellReports.1986.5:81-84)。[0024]所述的玉米品系優(yōu)選為綜31或綜3。[0025]本發(fā)明采用基因同源重組技術(shù)，將來源于斯氏假單胞菌的EPSP合酶編碼基因構(gòu)建到由玉米葉綠體特異啟動(dòng)子prrn和psbA終止子組合所驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，利用玉米葉綠體基因組中的atpB-rbcL作為同源片段，發(fā)生同源重組，通過基因槍轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入玉米葉綠體中，通過PCR分子生物學(xué)手段檢測(cè)，最終獲得轉(zhuǎn)基因玉米，EPSP合酶編碼基因在玉米葉綠體中得到成功表達(dá)，試驗(yàn)證實(shí)，所獲得的轉(zhuǎn)基因玉米植株具有較強(qiáng)的草甘膦抗性。[0026]本發(fā)明利用玉米葉綠體表達(dá)系統(tǒng)獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻，具有以下優(yōu)點(diǎn)第一，玉米葉綠體能夠高效的表達(dá)外源基因，植株可以獲得良好的抗性；第二，生物安全性高，由于葉綠體是母系遺傳，發(fā)生基因漂移的可能性極低；第三，外源基因能定點(diǎn)整合在玉米葉綠體基因組上；第四，外源基因在后代中可穩(wěn)定表達(dá)；第五，玉米葉綠體基因組具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不結(jié)合組蛋白等特點(diǎn)有利于實(shí)現(xiàn)分子操作。[0027]本發(fā)明采用玉米葉綠體表達(dá)系統(tǒng)獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米，獲得的轉(zhuǎn)基因玉米具有優(yōu)異的草甘膦抗性。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因玉米與原核轉(zhuǎn)化相比外源基因定點(diǎn)插入到玉米葉綠體基因組中，無性狀分離，易于檢測(cè)，省時(shí)高效；外源基因在葉綠體中高效的表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株具有良好的抗性；生物安全性極高，外源基因發(fā)生漂移的可能性極低。[0028]總體而言，本發(fā)明可以顯著提高轉(zhuǎn)基因玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省時(shí)高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。[0029]圖1轉(zhuǎn)基因玉米A15N的PCR檢測(cè)結(jié)果；M:DL2000；1,2,3,4為轉(zhuǎn)基因樣品；5野生型對(duì)照。[0030]圖2葉綠體轉(zhuǎn)基因玉米同質(zhì)化程度的PCR檢測(cè)結(jié)果；M:DL2000；1,2,3轉(zhuǎn)基因樣品；4野生型對(duì)照。具體實(shí)施方式[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。[0032]實(shí)驗(yàn)材料[0033]1.E.coliT0P10購(gòu)自Promega公司；玉米綜31、綜3春夏種植于中國(guó)農(nóng)科院廊坊實(shí)驗(yàn)基地，冬季種植于中國(guó)農(nóng)科院海南島實(shí)驗(yàn)基地。[0034]2.酶與試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶及其配套緩沖液購(gòu)自Promega公司；檢測(cè)所用的所有二抗抗體均購(gòu)自Sigma公司；[0035]3.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)；植物培養(yǎng)基為N6和MS培養(yǎng)基；[0036]實(shí)施例1、EPSP合酶基因的獲得、表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定。[0037]1、玉米葉綠體基因組的提取[0038](1)將5-10g玉米葉片去除葉脈，將葉片剪碎，液氮研磨；[0039](2)加入5倍體積4°C預(yù)冰冷的bufferA(bufferA:50mMTris-HCl,20mMEDTA,0.5M蔗糖，0.25MVc，pH3.5)，勻漿用8層醫(yī)用紗布過濾濾液至預(yù)冷的50mL離心管中，棄殘?jiān)?；[0040](3)濾液1500g/min，15min離心，棄上清，留沉淀；[0041](4)向沉淀中加入3mLbufferA，充分懸浮，轉(zhuǎn)入IOmL離心管中；[0042](5)2000g/min,15min離心，棄上清，收集沉淀；[0043](6)加入2mLbufferB，充分懸浮(bufferB:50mMTris-HCl,20mMEDTA，0.5M蔗糖，1%BSA，7mMβ-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加)；[0044](7)1500g/min,離心lOmin，棄上清，收集沉淀，再用bufferB洗一次；(8)同上離心，棄上清，再加bufferC，洗一次，離心，沉淀大部分為葉綠體(bufferC:50mMTris-HClpH8.0,20mMEDTA，0.5M蔗糖)；(9)葉綠體沉淀懸浮于3mLbufferD(50mMTris-HCl，20mMEDTA)中，加入2mL裂解液(50mMTris-HCl,20mMEDTA,10%N-lauroylsarcosine)，37保溫15min后，加蛋白酶K至100μg/mL繼續(xù)37°C，保溫4h；淀過夜(10)用等體積酚，氯仿抽提。加入3MNaAC至0.3M，兩倍體積的無水乙醇，-20沉(11)離心，沉淀涼至半干，溶于50μLTER(加有RNase的TE)中；2EPSP合酶編碼基因的克隆和葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建2.1目的基因的獲得根據(jù)已知的EPSP合酶編碼基因序列，分別設(shè)計(jì)引物，并且分別引入HindIII位點(diǎn)和)(bal位點(diǎn)，兩對(duì)引物如下A15FP1GAAGCTTATGCATTCCAATGACCTCGA15RP1GTCTAGATCATGAGGCGCCCTC在0.5mLeppendorf管中カロ入ddH2010XPCRbufferIOmMdNTP上游引物A15NFP下游引物A15NRPLATaqDNA聚合酶摸板HindIIIXbaI忍計(jì)40μL5μL1μL1μL1μL1μL1μL50μL反應(yīng)程序95°C95°C56°C72°C30cycles72°C10min2.2抗潮霉素基因(HPT)的克隆根據(jù)已知的質(zhì)粒pSELECT-hygro-mcsanvivoGen，貨號(hào)pseth_mcs)中HPT基因序列設(shè)計(jì)引物，并且分別引入HindIII位點(diǎn)和^CbaI位點(diǎn)，兩對(duì)引物如下HPTFPCAAGCTTATGCAAAAGCCTGAACTCACCGHindIIIHPTRPCTCTAGACTACTCTATTCCTTTGCCCTCXbaI[0063]PCR程序同上述2.1步驟中的PCR程序。2.3PCR產(chǎn)物的回收用普通凝膠進(jìn)行電泳，切下所需DNA條帶，稱重后放入Eppendorf管中，加入3倍體積(v/w)的6mol/LNaI溶液，37°C下使凝膠充分溶解，再加入10μL玻璃奶吸附DNA，室溫下放置5min，稍離心k，去上清，沉淀用NewWash洗液洗滌一次，重復(fù)離心、洗滌三次，晾干后用30yL0.IXTEBuffer溶解DNA，離心后取上清，將DNA保存于_20°C備用。2.4T載體的連接反應(yīng)回收的PCR產(chǎn)物2.5μL、pMD18_T0.5μL禾ロsoulI3μL混勻后，16°C反應(yīng)2h。2.5質(zhì)粒DNA或連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取-70°C凍存的感受態(tài)細(xì)胞，用雙手搓至大部分融化后迅速置冰上。感受態(tài)細(xì)胞完全融化后加入質(zhì)粒DNA20IOOng或連接混合物5μL，輕輕混勻，冰浴30min。42°C熱激90sec，迅速置冰上12min。加入ImLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩(く150rpm)培養(yǎng)lh。4，OOOg離心5min，去部分上清后(留150200μL)涂布于含適當(dāng)抗生素的LB平板上。37°C倒置培養(yǎng)過夜。2.6堿裂解法提取質(zhì)粒DNA2.7重組子的鑒定酶切鑒定首先小量抽提質(zhì)粒DNA，然后利用HindIII和xbal進(jìn)行酶切反應(yīng)，電泳后出現(xiàn)約1.3kb的DNA條帶的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒T-A15N。將重組質(zhì)粒T-A15N進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。3.玉米葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建3.1玉米葉綠體同源載體pBR的構(gòu)建3.1.1同源片段的獲得根據(jù)已知的玉米葉綠體基因組序列分別設(shè)計(jì)引物如下MAtpBFPCAAGCTTCTTGGAAGCTAATCCTCTGGHindIIIMAtpBRP:CGGATCCGAATCTAAATACCTAAATACTAAGBamHIMRbcLFPCGGATCCGATTAGGGTTTGGGTTGCGCBamHIMRbcLRP:GTCTAGAGTTACGAGCTTGTACACAGGXbaI在0.5mLeppendorf管中カロ入ddH2040μ10XPCRbuffer5μLIOmMdNTPIuL上游引物IuL下游引物IuLLATaqDNA聚合酶IuL玉米葉綠體總DNAIuL總計(jì)50μ反應(yīng)程序權(quán)利要求1.一種含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其特征在于，包括5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達(dá)盒，玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL；其中，5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達(dá)盒位于同源重組片段atpB和rbcL之間。2.按照權(quán)利要求1所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其特征在于所述的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達(dá)盒由玉米葉綠體啟動(dòng)子、5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因和終止子組成。3.按照權(quán)利要求2所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其特征在于所述的玉米葉綠體啟動(dòng)子包括/7r_r/7、ai/^、^對(duì)、/^似、/ZS秘WLrbcL啟動(dòng)子；所述的終止子為psbA終止子。4.按照權(quán)利要求3所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其特征在于所述的/Trrz7啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQIDNo.1所示；所述/zs似終止子的核苷酸序列為SEQIDNO:2所示。5.按照權(quán)利要求1所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其特征在于所述的同源重組片段atpB的核苷酸序列為SEQIDNo.3所示；所述的同源重組片段rbcL的核苷酸序列為SEQIDNo.4所示。6.按照權(quán)利要求1所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其特征在于還含有顯性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述的顯性選擇標(biāo)記基因優(yōu)選為細(xì)菌來源的抗菌素抗性基因；更優(yōu)選為抗潮霉素基因，其核苷酸序列為SEQIDNo.5所示。7.含有權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的玉米組織、玉米細(xì)胞或玉米原生質(zhì)體。8.—種構(gòu)建權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)所述含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的方法，該方法包括以下步驟(1)、將5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因可操作的與玉米葉綠體特異啟動(dòng)子和終止子相連接，使5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因置于玉米葉綠體特異啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下，得到5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達(dá)盒；(2)、將玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL分別連接在5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶編碼基因的表達(dá)盒的兩側(cè)，即得。9.權(quán)利要求1所述含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體在提高玉米草甘膦抗性中的應(yīng)用。10.按照權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將所述的含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織、玉米細(xì)胞或玉米原生質(zhì)體，篩選得到玉米抗性愈傷組織或細(xì)胞；C3)誘導(dǎo)玉米抗性愈傷組織或細(xì)胞分化，再生獲得玉米抗除草劑植株。專利摘要本發(fā)明提供了含抗除草劑基因玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體及其應(yīng)用。所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體包括5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因的表達(dá)盒，玉米葉綠體基因組中的同源重組片段atpB以及rbcL；其中，EPSP合酶基因的表達(dá)盒位于同源重組片段atpB和rbcL之間。本發(fā)明還提供了該葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了該葉綠體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體在提高玉米草甘膦抗性中的應(yīng)用，包括將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織或細(xì)胞，篩選得到抗性愈傷組織或細(xì)胞；誘導(dǎo)抗性愈傷組織或細(xì)胞分化，再生獲得玉米抗性植株。本發(fā)明可顯著提高玉米的草甘膦抗性，具有生物安全性高、省時(shí)高效、能耗少、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)A01H5/00GKCN102533844SQ201110433149公開日2012年7月4日申請(qǐng)日期2011年12月21日發(fā)明者倪丕沖,張志芳,李軼女,沈桂芳,王國(guó)增,王金輝,程奇申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan