專利名稱：一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國(guó)家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào) 性疫病，我國(guó)將其劃為一類動(dòng)物傳染病。目前世界上主要有3種效果較好的豬瘟活疫苗，即日本的GPE株、法國(guó)的 Thiverval株和中國(guó)的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株應(yīng)用最為廣范并為世界上許多 國(guó)家豬瘟的控制和消滅做出了重要貢獻(xiàn)。目前，我國(guó)也實(shí)行強(qiáng)制免疫豬瘟弱毒活疫苗作為 控制豬瘟的主要手段。雖然三種疫苗均能有效用于豬瘟防制，但也都存在著一定不足。其中GPE株、 Thiverval株是用豬源傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的，其存在已知或未知外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)較大，一 旦控制不好，很容易導(dǎo)致某種已有的或新發(fā)現(xiàn)的傳染病大面積流行。其中兔化弱毒活疫苗 目前有兩種生產(chǎn)工藝，第一種工藝是用兔體生產(chǎn)，取接種家兔的組織或淋巴結(jié)或脾臟制苗， 該工藝可以有效避免外源病毒污染，同時(shí)保證了病毒的遺傳穩(wěn)定性，病毒毒力不返強(qiáng)，但需 要使用大量家兔，質(zhì)量控制難度較高且生產(chǎn)成本較高；第二種工藝是應(yīng)用牛、羊原代細(xì)胞或 豬傳代細(xì)胞生產(chǎn)，該工藝避免大量使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但存在外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)(因?yàn)榕?、?原代細(xì)胞或豬傳代細(xì)胞對(duì)很多已知或未知的外源病毒易感)并且病毒遺傳穩(wěn)定性稍差，病 毒有獨(dú)立返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，豬瘟兔化弱毒是經(jīng)過(guò)兔體連續(xù)傳代馴化而成的，種毒并未經(jīng)過(guò) 克隆純化，因次不同批次的種毒對(duì)同一批家兔或同一批次的種毒對(duì)不同批次的家兔感染性 和免疫原性往往存在一定差異。由此可見，亟需一種新的豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝來(lái)克服已有 的幾種疫苗存在的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服豬瘟活疫苗現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的不足之處，提供一種用克隆化豬 瘟兔化弱毒種毒接種兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方 法。該方法具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易于質(zhì)量控制、外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)小、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。 利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗遺傳穩(wěn)定性好、純凈性高、病毒效價(jià)高、免疫原性強(qiáng)。本發(fā) 明是用豬瘟兔化弱毒株病毒經(jīng)過(guò)病毒基因拯救技術(shù)獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-2，該病毒株已于2010年7月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 4059，將CSFV CC-2通過(guò)兔源細(xì)胞和/或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)， 收獲病毒液；將收獲的病毒液加入常用的凍干保護(hù)劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍真空干燥 而制成凍干活疫苗，每頭份含毒量不低于6000TCID5(i或400RID。包括以下技術(shù)步驟1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定
CGMCC No. 4059豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過(guò)應(yīng)用病毒基因拯救法將豬瘟兔化 弱毒進(jìn)行克隆，獲得高度適應(yīng)兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞、基因型單一并且能穩(wěn)定遺傳的純系豬 瘟兔化弱毒株病毒。1. 1豬瘟兔化弱毒的克隆用病毒基因拯救法進(jìn)行。(1)病毒RNA提取RNA提取試劑盒提取豬瘟兔化弱毒細(xì)胞培養(yǎng)液的總RNA ；(2)全基因組cDNA克?、僭O(shè)計(jì)幾對(duì)引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別進(jìn)行純化、回收，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；②將PCR產(chǎn)物分別克隆到載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；③挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，大量培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，雙向測(cè)序鑒定；④將重組質(zhì)粒，酶切，純化；⑤將純化產(chǎn)物連接，得到全基因組cDNA ；⑥將全基因組cDNA克隆到載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；⑦篩選重組載體，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，酶切，純化，得到大量全基因組cDNA ；(3)體外 RNA 轉(zhuǎn)錄；(4)體外RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(5)培養(yǎng)傳代，熒光抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性，則克隆成功，命名為CSFV CC_2(該病毒株 已于2010年7月28日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為 CGMCCNo. 4059)；1. 2克隆株的鑒定經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性(1)對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-2接種兔源細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測(cè) 定毒價(jià)，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)最高毒價(jià)彡106 0TCID50/0. 1ml，經(jīng)微載體或懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià) ^ IO6 8TCID5tlA). Irnl ；將CSFV CC-I接種常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測(cè)定毒價(jià)，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)最高毒價(jià)彡105 0TCID50/0. 1ml，經(jīng)微載體或懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)彡106 °TCID50/0. Iml ；(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-2經(jīng)兔源細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定，第30代 與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 9%，氨基酸同源性為100%;將CSFV CC-2經(jīng)常用 細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定，第30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 5%, 氨基酸同源性為99.9% ；(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-2進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑制該 種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-2以15TCID5(I (或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家兔，結(jié)果 95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；(4)免疫原性將CSFV CC-2以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康豬， 抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時(shí)間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門血毒 (IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫彡41%且持續(xù)不超過(guò)3d ；(5)安全性將 CSFV CC-2(彡 105 °TCID50/0. lml) IOml 注射家兔、IOOml 注射豬、 5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；2疫苗的制備2. 1種毒的繁殖
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將CSFV CC-2種子批種毒接種生長(zhǎng)良好的兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞的種子批細(xì)胞，培 養(yǎng)3 4天后收毒，作為生產(chǎn)用種毒；種毒檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸 藥典二〇〇五年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明文件中簡(jiǎn)稱為《中國(guó)獸藥典》)進(jìn)行 檢驗(yàn)，應(yīng)符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；2. 2生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)種子批細(xì)胞經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，形成單層或生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，用于 繼續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；2. 3生產(chǎn)用病毒液的繁殖將生產(chǎn)種毒接種生長(zhǎng)良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量不少于60000 (或4000RID)；2. 4配苗、分裝和凍干將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；成品檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，應(yīng)不引起明顯癥狀；每頭份含毒量不少于6000TCID5(I(或 400RID)。本發(fā)明涉及的一些專用詞的界定1.兔源細(xì)胞是指兔原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞；2.常用細(xì)胞是指牛睪丸原代細(xì)胞、羊睪丸原代細(xì)胞、羊腎原代細(xì)胞、牛BT細(xì)胞 系、豬SK-6細(xì)胞系、豬ST細(xì)胞系、豬PK-15細(xì)胞系、豬IBRS-2細(xì)胞系；3.細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞在適宜的溫度和密度下，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或細(xì)胞微載體培養(yǎng)或 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明通過(guò)將豬瘟兔化弱毒克隆，獲得高度適應(yīng)細(xì)胞并且能穩(wěn)定遺傳的純系種 毒，再接種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)病毒液，最后配苗、分裝、凍于。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明 具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，保證了種毒的遺傳和生物表現(xiàn)型 的單一性，提高了疫苗的遺傳穩(wěn)定性和生物安全性；(2)相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，生產(chǎn)的病毒液毒價(jià)更高，單位體積 內(nèi)的疫苗有效成分含量更高；(3)相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，疫苗免疫原性更穩(wěn)定、可靠；(4)相對(duì)于已有的兔體制苗技術(shù)，本發(fā)明避免了飼養(yǎng)動(dòng)物、觀測(cè)動(dòng)物等長(zhǎng)時(shí)間、高 強(qiáng)度勞動(dòng)，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)降低了細(xì)菌、霉菌和支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。


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圖1豬瘟病毒兔化弱毒株(細(xì)胞源)7個(gè)cDNA片段。圖2圖中箭頭所示豬瘟病毒兔化弱毒株(細(xì)胞源)克降后在RK-13細(xì)胞上的熒光 染色斑。
具體實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定1.豬瘟兔化弱毒的克隆用病毒基因拯救法進(jìn)行。(1)病毒RNA提取用TRIzol Reagent試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)提取豬 瘟兔化弱毒細(xì)胞培養(yǎng)液的總RNA ；(2)全基因組cDNA克隆1)設(shè)計(jì)7對(duì)引物(序列1 14，表1)分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn) 行純化、回收，瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，結(jié)果出現(xiàn)目標(biāo)條帶，表明擴(kuò)增成功；表1用于擴(kuò)增豬瘟病毒兔化弱毒株(細(xì)胞源)全基因組的引物序列 2)將純化回收的目的基因片段分別克隆至pGEM-T Easy載體(購(gòu)自Promega公 司)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 (購(gòu)自Promega公司)；3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng) 12 16h ；隨機(jī)挑取3-4個(gè)自色單菌落，接種于AMP+ LB液體培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 試劑盒(購(gòu)自 Promega 公司) 提取重組質(zhì)粒，送至北京華大中生科技發(fā)展有限公司雙向測(cè)序鑒定，結(jié)果與設(shè)計(jì)的目的基 因片段序列一致。4)大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，用試劑盒大量提取重組質(zhì)粒，分別用核酸內(nèi)切酶
6(購(gòu)自NEB公司)酶切，純化；5)將純化產(chǎn)物依次用T4DNA連接酶(購(gòu)自NEB公司)連接，得到全基因組cDNA ；6)將全基因組cDNA克隆到pGEM_T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 ；7)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng) 12 16h ；隨機(jī)挑取3-4個(gè)白色單菌落，接種于AMP+ LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h;用試劑盒提取重組質(zhì)粒，送公司雙向測(cè)序鑒定，結(jié)果與目標(biāo)序列一致。8)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，大量提取重組質(zhì)粒，用核酸內(nèi)切酶酶切，純化， 得到大量全基因組cDNA;(3)體外 RNA 轉(zhuǎn)錄ATP 溶液 2 μ 1、CTP 溶液 2 μ 1、GTP 溶液 2 μ 1、UTP 溶液 2 μ 1、 IOXReaction Buffer 2 μ 1、線性化模板DNA 3 μ g、酶混合液2 μ 1，加無(wú)Rnase水補(bǔ)充至 20 μ 1 ；在 PCR 儀中，39°C反應(yīng) 2h ；(4)體外RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞將6孔細(xì)胞板長(zhǎng)滿80%左右的RK-13細(xì)胞；用 Opti-MEM培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO公司)小心稀釋轉(zhuǎn)錄RNA ；將10 μ 1 LipofectamineTM 2000 (購(gòu)自GIBCO公司)加入到240 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫下孵育5min ；再 與稀釋的RNA輕柔混均，室溫下孵育20min ；將轉(zhuǎn)染混合液加入到漂洗過(guò)的6孔細(xì)胞板中， 輕柔搖動(dòng)培養(yǎng)板，使混合液完全覆蓋細(xì)胞表面，放入37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中作用6h ；細(xì)胞 單層用MEM(無(wú)雙抗、無(wú)血清)培養(yǎng)液漂洗三遍，加入MEM培養(yǎng)液(無(wú)雙抗)，置于37°C 的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ；(5)培養(yǎng)傳代按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)染后的病毒液盲傳2 3代，用豬瘟熒光抗體檢 測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性(圖2)，則表明克隆成功，命名為CSFV CC-2；2.克隆株的鑒定經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性(1)對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-2接種RK-13細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測(cè)定毒 價(jià)，經(jīng)懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)彡106-8TCID50/0. Iml ；(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-2經(jīng)RK-13細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定，第30 代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 9%，氨基酸同源性為100% ；(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-2進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑制該 種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-2以15TCID5(I (或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家兔，結(jié)果 95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；(4)免疫原性將CSFV CC-2以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康豬， 抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時(shí)間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門血毒 (IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫彡41%且持續(xù)不超過(guò)3d ；(5)安全性將 CSFV CC-2(彡 105 °TCID50/0. lml) IOml 注射家兔、IOOml 注射豬、 5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；實(shí)施例2疫苗的制備1.種毒的繁殖將CSFV CC-2種子批種毒接種生長(zhǎng)良好的RK-13種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后收 毒，作為生產(chǎn)用種毒；種毒檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；2.生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)種子批細(xì)胞RK-13經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，用于 繼續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；3.生產(chǎn)用病毒液的繁殖將生產(chǎn)種毒接種生長(zhǎng)良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病 毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；4.配苗、分裝和凍干將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；成品檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，結(jié)果不引起明顯癥狀；每頭份含毒量> 6000TCID5(I(或 400RID)。實(shí)施例3疫苗的制備1.種毒的繁殖將CSFV CC-2種子批種毒接種生長(zhǎng)良好的SK-6種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后收毒， 作為生產(chǎn)用種毒；種毒檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)規(guī)定；2.生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)種子批細(xì)胞SK-6經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，用于繼 續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；3.生產(chǎn)用病毒液的繁殖將生產(chǎn)種毒接種生長(zhǎng)良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病 毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；4.配苗、分裝和凍干將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；成品檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，結(jié)果不引起明顯癥狀；每頭份含毒量> 6000TCID5(I(或 400RID)。
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權(quán)利要求
一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是用豬瘟兔化弱毒株病毒經(jīng)過(guò)病毒基因拯救技術(shù)獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC 2，該病毒株已于2010年7月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.4059，將CSFV CC 2通過(guò)兔源細(xì)胞和/或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液；將收獲的病毒液加入常用的凍干保護(hù)劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍真空干燥而制成凍干活疫苗，每頭份含毒量不低于6000TCID50或400RID。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是制備豬瘟活疫苗所用 一株CGMCC No. 4059豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過(guò)應(yīng)用病毒基因拯救法將豬瘟兔化弱毒 進(jìn)行克隆，獲得高度適應(yīng)兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞、基因型單一并且能穩(wěn)定遺傳的純系豬瘟兔 化弱毒株病毒。全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明包括以下技術(shù)步驟(1)豬瘟兔化弱毒株的克隆與鑒定；(2)克隆株種毒的繁殖；(3)生產(chǎn)用細(xì)胞的繁殖；(4)生產(chǎn)用病毒液的繁殖；(5)配苗、分裝和凍干。本發(fā)明具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，病毒免疫原性和遺傳穩(wěn)定性好，外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)小，檢驗(yàn)方便，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗遺傳穩(wěn)定性好、純凈性高、免疫原性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N7/04GK101905020SQ20101024511
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者關(guān)孚時(shí), 戴志紅, 李翠, 王在時(shí), 秦玉明, 蔣卉, 趙耘 申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所