一種生產(chǎn)苦杏氰甙作為殺蟲劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)苦杏氰甙作為殺蟲劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展，家庭小花園、小菜園產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，產(chǎn)生了巨大的家庭用殺蟲劑消費(fèi)市場(chǎng)。家庭所用的殺蟲劑不是傳統(tǒng)的殺蟲劑，是要無公害、綠色、有機(jī)的殺蟲劑。
[0003]植物細(xì)胞工程是在植物組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新學(xué)科，具有基礎(chǔ)理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)并舉的特點(diǎn)，為研究從苦杏仁提取氰甙提供了理論知識(shí)。
[0004]古代很多中醫(yī)書籍中均記載杏仁“有小毒”，“有毒”?？嘈尤蕷⑾x劑被家庭中常見的蟑螂等及蔬菜害蟲食后，其所含的苦杏仁甙在口腔、食道、胃和腸中遇水，經(jīng)苦杏仁酶的水解后釋放出氫氰酸，苦杏仁在口內(nèi)嚼碎與唾液混合能產(chǎn)生氫氰酸，氰離子與含鐵的細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合，妨礙正常呼吸，因組織缺氧，機(jī)體陷入窒息狀態(tài)；氫氰酸還能作用于呼吸中樞和血管運(yùn)動(dòng)中樞，使之麻痹，最后導(dǎo)致死亡。
[0005]氰是碳氮化合物，是蔬菜的營(yíng)養(yǎng)元素，噴在蔬菜葉面上很快被吸收，害蟲食入會(huì)中毒，48小時(shí)后，碳氮化合物分解成碳、氮營(yíng)養(yǎng)元素被植物利用；人食用后不會(huì)對(duì)人身造成傷害。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是研制一種植物次生代謝物殺蟲劑，具有殺蟲活性，使用中對(duì)人畜比較安全，而且還兼有殺菌和刺激作物生長(zhǎng)的作用，達(dá)到殺蟲防病、增產(chǎn)增收的多重功效，主要用于家庭陽臺(tái)種植的小花園、小菜園的病蟲害防治。
[0008]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
生產(chǎn)苦杏氰甙作為殺蟲劑的方法，包括:選擇增殖速度快而且細(xì)胞內(nèi)氰甙含量高的苦杏胚芽細(xì)胞株作為種質(zhì)和規(guī)?；a(chǎn)苦杏氰甙兩部分；其具體操作方法如下:
所述的選擇增殖速度快而且細(xì)胞內(nèi)氰甙含量高的苦杏胚芽細(xì)胞株作為種質(zhì)步驟如下:
(1)取正季生長(zhǎng)的苦杏胚芽，作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，取苦杏胚芽后，注意保鮮和清潔；
(2)苦杏胚芽表面消毒:于三角瓶中放自來水60毫升自來水和2-3克洗衣粉，并將苦杏胚芽放入，在輕輕攪動(dòng)1-1.5分鐘；用自來水龍頭小水流沖洗2-3小時(shí)后，將苦杏胚芽夾到另一個(gè)滅菌三角瓶中；倒入75%的酒精放置I分鐘后，倒掉酒精；再倒入0.1%次氯酸鈣12 - 15分鐘后，倒出次氯酸鈣，用滅菌水沖洗3次，再在無菌水中靜泡3-4分鐘，用滅菌過的鑷子將苦杏胚芽夾到吸水紙上吸干表面水，用滅菌刀將苦杏胚芽切成2毫米左右大??； (3)制作培養(yǎng)基:配方是在I升MS基本培養(yǎng)基上，加肌醇100毫克、V B I 8毫克、VB 6 8毫克、N A 8毫克、甘氨酸6毫克、蔗糖40克、2.4 — D 1.5毫克、N A A 1.5毫克、瓊脂6克；攪拌均勻，為固體培養(yǎng)基，pH為5.8，對(duì)固體培養(yǎng)基進(jìn)行120°C、20分鐘蒸汽滅菌，形成濕度較大的無菌固體培養(yǎng)基；
(4)誘導(dǎo)苦杏胚芽愈傷組織:把切好的苦杏胚芽接種在培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，每瓶裝40毫升培養(yǎng)基，接種10毫克切好的苦杏胚芽；置于培養(yǎng)基溫度27°C的條件下，誘導(dǎo)傅傷組織；20天后長(zhǎng)出愈傷組織；
(5)繼代培養(yǎng)苦杏胚芽愈傷組織:將20天后長(zhǎng)出愈傷組織，轉(zhuǎn)移到上述相同的培養(yǎng)基上，每個(gè)三角瓶移入5 - 7塊初始苦杏胚芽愈傷組織，在1500 L U X A熒光燈的光培養(yǎng)下，每40天繼代一次；
(6)挑選苦杏胚芽愈傷組織:經(jīng)過3- 4次繼代培養(yǎng)后的苦杏胚芽愈傷組織，用滅菌針頭挑選出生長(zhǎng)旺盛、顆粒狀的苦杏胚芽愈傷組織；
(7)將挑選出生長(zhǎng)旺盛、顆粒狀的苦杏胚芽愈傷組織，一部分用于繼續(xù)繼代培養(yǎng)，另一部分用于規(guī)?；a(chǎn)苦杏氰甙；
所述的規(guī)?；a(chǎn)苦杏氰甙的操作方法如下:
(1)將挑選出生長(zhǎng)旺盛、顆粒狀的苦杏胚芽愈傷組織接種在三角瓶裝的液體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基配方為I升無菌水的基礎(chǔ)上，加肌醇100毫克、V B I 8毫克、V B 6
8毫克、N A 8毫克、甘氨酸6毫克、蔗糖40克、2.4 — D 1.5毫克、N A A 1.5毫克，攪拌均勻，進(jìn)行滅菌處理，而制成的液體培養(yǎng)基；每個(gè)為三角瓶裝100毫升液體培養(yǎng)基，接種2克鮮重的苦杏胚芽愈傷組織；
(2)將接種后的三角瓶放在往復(fù)80— 90次/分鐘的搖床上培養(yǎng)，光培養(yǎng)為1500 L UX A熒光燈，溫度為27°C，接種后10天為第一繼代，按照I瓶擴(kuò)大為10瓶的數(shù)量；要求每個(gè)三角瓶裝100毫升液體培養(yǎng)基，接種2克左右鮮重的苦杏胚芽愈傷組織的數(shù)量，以后每7天繼代一次，擴(kuò)大一次，共計(jì)7次；
(3)將苦杏胚芽愈傷組織返回固體培養(yǎng)基，經(jīng)過7次繼代和擴(kuò)大培養(yǎng)后，將培養(yǎng)苦杏胚芽愈傷組織，放在40毫米X40毫米，高20毫米的滅菌不銹鋼盤的原固體培養(yǎng)基上接種，固體培養(yǎng)基厚度在10毫米，放置黑暗條件下，培養(yǎng)20天；
(4)培養(yǎng)20天后的苦杏胚芽愈傷組織和培養(yǎng)基，通過磁力攪拌反應(yīng)器作用，分離出苦杏胚芽愈傷組織；
(5)將培養(yǎng)的苦杏胚芽愈傷組織烘干，提取苦杏氰甙。
[0009]本發(fā)明提供的一種從野生苦杏仁提取氰甙有毒成分，進(jìn)行工廠化制造無公害制造殺蟲劑的方法，利用研制的培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)野生苦杏仁胚芽細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)脫分化形成愈傷組織；然后培養(yǎng)愈傷組織變?yōu)榫哂蟹至涯芰Φ募?xì)胞，細(xì)胞大量繁殖；收集培養(yǎng)物，提取苦杏仁氰甙；歸為有機(jī)化合物腈類，是碳和氮兩種元素的化合物，結(jié)構(gòu)式N = C-C =，無色帶苦杏仁味的劇毒氣體，其毒性與HCN相似。可溶于水、乙醇和乙醚，加熱至400°C以上聚合成不溶性的白色固體，用于有機(jī)合成殺蟲劑。
[0010]苦杏仁:杏仁分甜杏仁和苦杏仁。一般說來，栽培杏所產(chǎn)的大多是甜杏仁，野生的則多為苦杏仁；苦杏仁一般用來入藥，其毒性比一般甜杏仁高數(shù)十倍，從深山老林中尋找野生苦杏樹，移來栽培，盡量避免人為干擾，失去野性。
[0011]苦杏仁氰甙:苦杏仁氰甙是苦杏樹的次生代謝物，是苦杏樹在長(zhǎng)期逆境中進(jìn)化的表現(xiàn)，是通過改變其代謝途徑，提高抗病蟲害的能力，通過技術(shù)測(cè)試，苦杏樹中杏仁的氰甙含量高，特別是苦杏仁在萌發(fā)時(shí)，胚芽細(xì)胞中氰甙含量最高，是作為種質(zhì)最理想的細(xì)胞株。
[0012]本發(fā)明的有益效果:該殺蟲劑屬植物次生代謝物殺蟲農(nóng)藥的優(yōu)點(diǎn)是，具有殺蟲活性，使用中對(duì)人畜比較安全，而且還兼有殺菌和刺激作物生長(zhǎng)的作用；達(dá)到殺蟲防病、增產(chǎn)增收的多重功效，主要用于家庭陽臺(tái)種植的小花園、小菜園的病蟲害防治。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1:生產(chǎn)苦杏氰甙作為殺蟲劑的方法，包括:選擇增殖速度快而且細(xì)胞內(nèi)氰甙含量高的苦杏胚芽細(xì)胞株作為種質(zhì)和規(guī)?；a(chǎn)苦杏氰甙兩部分；其具體操作方法如下:
所述的選擇增殖速度快而且細(xì)胞內(nèi)氰甙含量高的苦杏胚芽細(xì)胞株作為種質(zhì)步驟如下:
(1)取正季生長(zhǎng)的苦杏胚芽，作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，取苦杏胚芽后，注意保鮮和清潔；
(2)苦杏胚芽表面消毒:于150毫升三角瓶中，放自來水60毫升自來水和2-3克洗衣粉，并將苦杏胚芽放入，在輕輕攪動(dòng)1-1.5分鐘；防止苦杏胚芽流掉的前提下，用自來水龍頭小水流沖洗2-3小時(shí)后，在超凈臺(tái)上小心地用滅菌鑷子將苦杏胚芽夾到另一個(gè)滅菌三角瓶中；倒入75%的酒精放置I分鐘后，倒掉酒精；再倒入0.1%次氯酸鈣12 - 15分鐘后，倒出次氯酸鈣，用滅菌水沖洗3次，再在無菌水中靜泡3-4分鐘，用滅菌過的鑷子將苦杏胚芽夾到吸水紙上吸干表面水，用滅菌刀將苦杏胚芽切成2毫米左右大小；
(3)制作培養(yǎng)基:配方是在I升MS基本培養(yǎng)基上，加肌醇100毫克、V B I 8毫克、VB 6 8毫克、N A 8毫克、甘氨酸6毫克、蔗糖40克、2.4 — D 1.5毫克、N A A 1.5毫克、瓊脂6克；攪拌均