專利名稱：：創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝及其在水生動(dòng)物的應(yīng)用的制作方法創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝及其在水生動(dòng)物的應(yīng)用駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種致病菌滅活疫苗的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：創(chuàng)傷弧菌(W6Wovw/"辨cus)是一種低度嗜鹽性弧菌，屬于人魚共患病病原，能導(dǎo)致人與鰻鱺產(chǎn)生敗血癥和嚴(yán)重傷口感染。大致可分為生物i、生物n、生物iiih個(gè)型，其中生物i型主要危害了人的健康，可導(dǎo)致人感染后致死率高達(dá)60%以上；而生物ii型則為鰻鱺的主要細(xì)菌性傳染病病源之一，上個(gè)世紀(jì)70-80年代，曾讓日本、歐美等鰻鱺產(chǎn)業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失；近五年來，我國沿海地區(qū)養(yǎng)殖鰻鱺因創(chuàng)傷弧菌而引起發(fā)病也十分嚴(yán)重，臨床上呈現(xiàn)急性和遷延性兩種過程，養(yǎng)殖場鰻鱺創(chuàng)傷弧菌病可反復(fù)發(fā)作，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)通常采用抗生素和消毒劑等化學(xué)藥物防治創(chuàng)傷弧菌病，易造成了環(huán)境污染、藥物殘留和抗藥性等問題，影響水產(chǎn)品出口，甚至消費(fèi)者的健康。目前，國內(nèi)外研究創(chuàng)傷弧菌主要惻重流行病學(xué)和致病機(jī)理等，而比較少關(guān)注水產(chǎn)疫苗的研制與開發(fā)。有關(guān)發(fā)酵工藝研究主要集中在大腸桿菌等工業(yè)微生物，弧菌發(fā)酵工藝方面至今未見報(bào)道；有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物病尉SCOMs的研究報(bào)道也僅見本實(shí)驗(yàn)室的嗜水氣單胞節(jié)SCOMs研究，而創(chuàng)傷弧節(jié)SCOM疫苗的制備工藝研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能優(yōu)化創(chuàng)傷弧菌疫苗的發(fā)酵培養(yǎng)、提高發(fā)酵液中疫苗活菌生物含量、且疫苗的應(yīng)用效果較好的創(chuàng)傷弧菌全菌免raij激復(fù)合物疫苗的制備工藝及其水生動(dòng)物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過如下步驟的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)它包括如下步驟(l)將創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增與擴(kuò)大培養(yǎng)，(2)對培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行滅活，(3)對滅活的菌液進(jìn)行無活菌檢驗(yàn)(4)離心收集滅活的創(chuàng)傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行超聲波破碎，(6)免翻微復(fù)合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復(fù)合物。本發(fā)明選用的創(chuàng)傷弧菌毒力較強(qiáng)(LD5o約為200cfti/g)、且培養(yǎng)^#和優(yōu)化的培養(yǎng)基能使發(fā)酵液的活菌生物含量實(shí)現(xiàn)翻番，培養(yǎng)出的創(chuàng)傷弧菌生物量高達(dá)50mg/ml以上；為創(chuàng)傷弧菌疫苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。具體實(shí)肺式本發(fā)明的具體工藝步驟如下(1)將創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增與擴(kuò)大培養(yǎng)選擇公認(rèn)TSB培養(yǎng)基和改良的TSB培養(yǎng)基；將經(jīng)常規(guī)檢測合格的創(chuàng)傷弧菌毒株接種到含有TSB的細(xì)菌培養(yǎng)物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31°0度溫、100-200轉(zhuǎn)/射中的條件下振蕩培養(yǎng)14-18小時(shí)，將該培養(yǎng)液作為種子液；以0.5-10%預(yù)擴(kuò)增的培養(yǎng)物接種于發(fā)酵罐內(nèi)的新鮮高壓滅菌的改良TSB培養(yǎng)液中大規(guī)模培養(yǎng)36-60小時(shí)；所述的改良的TSB培養(yǎng)液的成分為葡萄糖0.18°/。-0.22%(W/V為水的體積重量百分比，以下同。)、胰蛋白胨1.2%-1.8%(W/V)、大豆胨0.2%-0.6%(W/V)、玉米漿0.2%-0.6%(￥/￥)、磷酸氫二鉀0.15%-0.25°/。(W/V)、氯化鈉1.0%"2.0%(WAO、磷酸鐵0.0005%-0.002%(W/V)和酵母膏0.05%-0.2%(W/V);發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)為接種量為0.5-10%、溫度25-31。C、轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分鐘；空氣流量為35-15L/min;11值6.5-7.5;發(fā)酵20-28小時(shí)后按間隔3-10分鐘、自動(dòng)工作15-20秒補(bǔ)濃縮料共5001111，所述的濃縮料的重量份數(shù)比為葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即為發(fā)酵菌液。(2)對培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行滅活將菌液收集于滅菌罐中，添加終濃度為0.1-0.5%(V/V體積百分比)的福爾馬林，室溫罐內(nèi)翻滾震蕩3-5小時(shí)后，置于3-5。C冰箱中過夜或經(jīng)過48小時(shí)，可徹底滅活。為了確保徹底滅活需對滅菌后滅菌罐中的菌液(即滅活菌液)進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，無菌檢驗(yàn)的方法是充分搖勻滅菌后的滅活菌液，滅菌槍頭吸取0.2-1.0ml的滅活菌液，超凈工作臺(tái)上鋪平板，放置26-30"恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，滅菌完全的培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)沒有菌落出現(xiàn)，試驗(yàn)設(shè)空白平板對照。G)離心收集滅活的創(chuàng)傷弧菌在8000-12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下，離心20-30分鐘，收集、濃縮細(xì)菌；發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)菌的生物量(濕重)應(yīng)為25-50gT、所述的離心收集的細(xì)菌用滅菌生理鹽水重懸，每升菌苗的離心后定容至生物量125-175g丄1。上述經(jīng)過大量培養(yǎng)、滅活及離心濃縮、收集的滅活細(xì)菌即為菌苗的半成品。(4)對收集的滅活創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行超聲波破碎，菌體粗蛋白的制備(細(xì)菌裂解，蛋白釋放)采用市售的JY98-3D超聲波破碎儀，超聲波的超聲探頭(又稱為變幅桿)的直徑為20mm，超聲功率設(shè)為800瓦；將超聲波破碎儀用70%酒精進(jìn)行潔凈消毒；將滅活的200-400ml的濃縮菌液放入專用超聲杯中，待濃縮菌液預(yù)凍或預(yù)溶至留有少量冰晶時(shí)進(jìn)行低溫超聲破碎；破碎的作用程序?yàn)殚g隔時(shí)間10秒，工作時(shí)間5秒，如此循環(huán)反復(fù)作用總時(shí)間為6分鐘/輪。共作用3輪，全程時(shí)間為18分鐘，實(shí)際作用時(shí)間為6分鐘。指針顯示的輸出起始功率在720瓦左右，最后階段的功率可接近設(shè)置值800瓦。本發(fā)明中還可以采用其它細(xì)菌破碎儀，只要能達(dá)到對滅活后的細(xì)菌進(jìn)行破碎的目的即可。第一次超聲波裂解后的用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整細(xì)菌蛋白濃度至(5)免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)組分的配制在超聲裂解的菌體粗蛋白中、每lOOm!菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2%(W/V)的皂苷(QuilA)(出處ACCURATECHEMICAL&SC正NTIFICCORPORATION)和每ml菌液中各添加100-150ug.ml"的卵磷脂和膽固醇(終濃度)。由于卵磷脂和膽固醇都是不易溶于水的有纟幾物，配制卵磷脂和膽固醇時(shí)先將兩種物質(zhì)、溶解于氯仿中配成100-150mg.mT'儲(chǔ)存液，現(xiàn)配現(xiàn)用或-2(TC凍存?zhèn)溆谩?6)超聲波處理制備免疫刺激復(fù)合物菌體粗蛋白按上述配苗比例添加皂苷、卵磷脂和膽固醇構(gòu)成免疫刺激復(fù)合物的基質(zhì)后，待預(yù)凍或預(yù)溶至留有少量冰晶時(shí)，置于超聲波破碎儀內(nèi)進(jìn)行低，聲破碎、控制超聲破碎倉內(nèi)溫度不高于35"C。程序設(shè)置為間隔時(shí)間10秒，超聲作用5秒，全程時(shí)間為18分鐘。溫度不高于6(TC。在潔凈條件下，將超聲處理的免疫刺激復(fù)合物收集于500ml滅菌疫苗專用塑料瓶內(nèi)混勻后，測定免^lt激復(fù)合物蛋白濃度，用滅菌PBS調(diào)整免疫刺激復(fù)合物的蛋白濃度至8-12mg.mr1。二7爐聲處理后得到制品即為創(chuàng)傷弧菌免1」激復(fù)合物疫苗；將制得的免1」'激復(fù)合物疫苗在-20°(:凍存?zhèn)溆谩?7)分裝將創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗分裝于100ml經(jīng)150-17(TC干熱處理1.5-2.5小時(shí)的疫苗專用玻璃瓶，加蓋、貼標(biāo)簽，-201:凍存。(8)成品檢驗(yàn)將分裝后的成品進(jìn)行性狀檢驗(yàn)和純粹檢驗(yàn)；凍存前制品為棕黃色均勻濃稠液體，有輕微硫臭味；凍結(jié)狀態(tài)為棕黃色冰塊；所述的性狀檢驗(yàn)為制品用0.01MPBS1:100稀釋，差速離心去除細(xì)胞碎片，再，離心濃縮ISCOMs，飽和磷鉤酸負(fù)染后置透射電鏡下觀察，可觀察到直纟5為35nm40nm籠格狀結(jié)構(gòu)；所述的純粹檢驗(yàn)為抽檢2/10已分裝的疫苗，無菌條件下用移液器吸取混勻的ISCOMs0.1-0.5ml，均勻涂平板，26-30。C恒溫箱培養(yǎng)48小時(shí)觀察應(yīng)無細(xì)菌生長。為了保證所獲得的培養(yǎng)物中無污染物的存在，在上述步驟(1)之后步驟(2)之前進(jìn)行培養(yǎng)物的污染菌落檢測；具體方法如下每一批預(yù)擴(kuò)增和擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)均設(shè)同批次培養(yǎng)基空白對照，將培養(yǎng)基空白對照污染者廢棄。從每一批次生產(chǎn)的細(xì)菌中隨機(jī)抽樣(2/10)劃板培養(yǎng)，鑒定菌落形態(tài)、色澤，觀察有無雜菌生長；進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)評估細(xì)菌的抗原性，不合格產(chǎn)品高壓滅活后廢棄。為了確保在步驟(2)至陟驟(4)的過程中沒有發(fā)生污染情況，在步驟(4)之后和步驟(5)之前最好進(jìn)行污染菌落檢驗(yàn)以及抗原性檢驗(yàn)，污染菌落檢驗(yàn)方法與上述的無菌檢驗(yàn)方法相同，抗原性檢測方法為濃縮后的菌苗以滅菌生理鹽水(或PBS)作10-20倍稀釋后，菌體凝集試驗(yàn)評估其抗原性。在步驟(5)之后步驟(6)之前，還可以對經(jīng)過破碎工序的菌液進(jìn)行蛋白檢測，該檢測方法屬于已有公知的方法，檢測方法為以新鮮配置的牛血清白蛋白(BSA)作曲線，Bradford法測定一次破碎后的蛋白濃度。在步驟(7)之后，還可以經(jīng)過透射電鏡下的觀測與鑒定的步驟，該步驟的具體過程如下典型ISCOMs的結(jié)構(gòu)為直徑35nm-40nm的顆粒狀，中間為疏水區(qū)，有6個(gè)對稱的點(diǎn)狀物比較均勻地分布在其周圍，構(gòu)成免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)結(jié)構(gòu)的典型基質(zhì)。創(chuàng)傷弧菌全菌ISCOMs制品因成分復(fù)雜未做進(jìn)一步的超速離心處理，飽和磷鴇酸負(fù)染后置透射電鏡下觀察，不易觀察到典型的ISCOMs結(jié)構(gòu)。樣品經(jīng)100倍，8000-12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30辦中，去除細(xì)胞碎片，34000-36000轉(zhuǎn)/分鐘離心,處理后，可在電鏡下觀察到直徑為35nm40nm的籠格狀結(jié)構(gòu)。將經(jīng)過本發(fā)明方法制得的創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗經(jīng)過安全性檢測和效力檢驗(yàn)的結(jié)果如下。所述的安全性檢驗(yàn)分為如下步驟(a)實(shí)驗(yàn)魚及其飼養(yǎng)條件選擇健康活躍、無病癥、無體外寄生蟲感染的鰻鱺，置50X30X40cm3玻璃水族箱注水至箱深的1/2處，每個(gè)水族箱放養(yǎng)鰻鱺10-25尾，置于室內(nèi)，控溫空調(diào)控制室溫24。C土rC。7jC源為暴氣自來水，每日換水1/3。普通小型充氣機(jī)連續(xù)充氣直到試驗(yàn)結(jié)束；鰻鱺在試驗(yàn)前暫養(yǎng)7天以上，檢驗(yàn)無寄生蟲感染，試驗(yàn)期間停止投食。(b)對鰻魚的安全性試驗(yàn)浸浴以滅菌自來水將創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗稀釋為200iig.mT1，浸浴歐洲鰻鱺10-25尾，24小時(shí)后換水；同樣體積滅菌自來水浸浴同批鰻鱺10-25尾為對照；實(shí)驗(yàn)組與對照組均設(shè)重復(fù)平行組，連續(xù)觀察7-14天，鰻鱺無病理反應(yīng)，可判定批次疫苗是安全可靠的。注射滅菌PBS(0.01mol)將創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗稀釋為2000ug.mT1，一次性注射器以0.1ml/尾的劑量注射鰻鱺10-25尾，對照食曼li10-25尾注射等劑量滅菌PBS;實(shí)驗(yàn)組與對照組均設(shè)重復(fù)平行組，連續(xù)觀察7-14天，鰻鱺無病理反應(yīng)，可判定批次疫苗是安全可靠的。灌胃滅菌PBS(0.01mol)將創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗稀釋為4000Pg.mT1，一次性注射器(配硅膠管)以0.21111/尾的劑量灌胃鰻鱺10-25尾，對照鰻鱺10-25尾灌胃等劑量滅菌PBS;實(shí)驗(yàn)組與對照組均設(shè)重復(fù)平行組，連續(xù)觀察7-14天，鰻鱺無病理反應(yīng)，可判定批次疫苗是安全可靠的。所述的效力檢驗(yàn)步驟如下(a)試驗(yàn)魚標(biāo)準(zhǔn)及飼養(yǎng)餅規(guī)格5-50g/尾(便于采血)。試驗(yàn)魚免疫前血清抗體檢驗(yàn)隨機(jī)選擇3尾以上鰻鱺采集血清，血清凝集或ELISA法評估免疫前的血清抗體效價(jià)。本底抗體滴度;疑集價(jià)大于22(顯著凝集)、ELISA抗體效價(jià)大于1:200不宜作為試驗(yàn)用魚。試驗(yàn)魚的健康標(biāo)準(zhǔn)及飼養(yǎng)條件同安全性檢驗(yàn)(a)。(b)注射免疫、及攻毒以滅菌生理鹽7jC將創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗調(diào)整為350-450ug.mT1濃度的懸液。鰻鱺經(jīng)魚安定麻醉后，每尾腹腔注射上述免疫懸液0.1ml，每組10-25尾，對照組鰻鱺腹腔注射等劑量的滅菌生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組與對照組均設(shè)重復(fù)平行組。攻毒于免疫后的第25-40天，用新鮮制備的創(chuàng)傷弧菌菌株的菌液(2X104-5X105cfb)腹腔注射攻毒，7-14天內(nèi)觀察并統(tǒng)計(jì)死亡情況。實(shí)驗(yàn)室疫苗注射免疫后攻毒試驗(yàn)i微結(jié)果(見表l)，免疫組的免疫保護(hù)力為100%和對照組的存活率為0%。表l對照和免SgJc洲S，F(xiàn)J03-X2菌株攻擊的成活率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(c)口服免疫、采血及攻毒倉iJ傷弧節(jié)SCOM疫苗，在鰻場對鰻鱺進(jìn)行口服免疫試驗(yàn)。按每噸魚體重每天拌料50ml疫苗，連續(xù)口服7天，間隔一周后再服7天；以不添加疫苗的常規(guī)飼料投喂魚ft麗為對照組。攻毒于第2次免疫后的第25-60，行攻毒試驗(yàn)，試驗(yàn)分2組，免疫組與對照組，每組10-25尾；免疫組與對照組均設(shè)重復(fù)平行組。用新#羊制備的創(chuàng)傷弧菌菌株的菌液(2X104-5X105cfU)腹腔注射攻毒，7-14天內(nèi)觀察并統(tǒng)計(jì)死亡情況。田間疫苗口服免疫后攻毒試驗(yàn)免疫組的免疫保護(hù)力為100%，對照組的存活率為23.1%;試驗(yàn)結(jié)果見敦表2對照和i&S日本mFJ03-X2菌^J女擊的j^S率t激<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于，它包括如下步驟(1)將創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增與擴(kuò)大培養(yǎng)，(2)對培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行滅活，(3)對滅活的菌液進(jìn)行無活菌檢驗(yàn)(4)離心收集滅活的創(chuàng)傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行超聲波破碎，(6)免疫刺激復(fù)合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復(fù)合物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免MU激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于將創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增與擴(kuò)大培養(yǎng)的方法為選擇TSB培養(yǎng)基和改良的TSB培養(yǎng)基;將經(jīng)常規(guī)檢測合格的創(chuàng)傷弧菌毒株接種到含有TSB的細(xì)菌培養(yǎng)物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31。C恒溫、100-200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)14-18小時(shí)，將該培養(yǎng)液作為種子液；以0.5-10%預(yù)擴(kuò)增的培養(yǎng)物接種于發(fā)酵罐內(nèi)的新鮮高壓滅菌的改良TSB培養(yǎng)液中大規(guī)模培養(yǎng)36-60小時(shí)；所述的改良的TSB培養(yǎng)液隨體積重量百分比W/V的成分為葡萄糖0.18°/。-0.22%、胰蛋白胨1.2%-1.8%、大豆胨0.2%-0.6%、玉米槳0.2%-0.6%、磷酸氫二鉀0.15%-0.25%、氯化鈉1.0%-2.0%、磷酸鐵0.0005%~0.002%和酵母膏0.05%-0.2%;發(fā)酵±咅養(yǎng)條件參數(shù)為接種量為培養(yǎng)基1^只的0.5-10%、溫度25-3rC、轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分鐘；空氣流量為35-151/min;培養(yǎng)基的pH值6.5-7,5;發(fā)酵20-28小時(shí)后按間隔3-10分鐘、自動(dòng)工作15-20秒補(bǔ)濃縮料共500ml，所述的^t縮料的重量份數(shù)比為葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即為發(fā)酵菌液。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的對培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行滅活的方法為將菌液收集于滅菌罐中，添加終濃度V/V體積百分比為0.1-0.5%的福爾馬林，室溫罐內(nèi)翻滾震蕩3-5小時(shí)后，置于3-5。C冰箱中過夜或經(jīng)過48小時(shí)，可徹底滅活；所述的無菌檢驗(yàn)如下充分搖勻細(xì)菌，滅菌槍頭吸取0.2-1.Oml的滅活菌液，超凈工作臺(tái)上鋪平板，放置26-30。C恒溫i咅養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，滅菌完全的培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)沒有菌落出現(xiàn)，試驗(yàn)設(shè)空白平板對照。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的倉ij傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的帝ij備工藝，其特征在于所述的離心收集滅活的創(chuàng)傷弧菌的方法為在8000-12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下，離心20-30分鐘，收集、濃縮細(xì)菌；發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)菌的生物量的濕重應(yīng)為25-50g.1—、所述的離心收集的細(xì)菌用滅菌生理鹽水重懸，每升菌苗的離心后定容至生物量125國175g,r1。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的對收集的滅活創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行超聲波破碎的方法為采用市售的JY98-3D超聲波破碎儀，超聲波的超聲探頭的直徑為20mm，超聲功率設(shè)為800瓦；將超聲波破碎儀用70%酒精進(jìn)行潔凈消毒;將滅活的200400ml的濃縮菌液放入專用超聲杯中，待濃縮菌液預(yù)凍或預(yù)溶至留有少量冰晶時(shí)進(jìn)行低溫超聲破碎、控制超聲破碎倉內(nèi)溫度不高于35'C;破碎的作用禾M^為間隔時(shí)間10s，工作時(shí)間5s，如此循環(huán)反復(fù)作用總時(shí)間為6^H中/輪；共作用3輪，全程時(shí)間為18分鐘，實(shí)際作用時(shí)間為6分鐘；指針顯示的輸出起始功率在720瓦左右，最后階段的功率可接近設(shè)置值800瓦。第一次超聲波裂解后的用滅菌磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)菌蛋白濃度至8-12mg,mT1。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的免疫刺激復(fù)合物組分的配制方法如下在超聲裂解的菌體粗蛋白中、每100ml菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2%W/V的皂苷和每ml菌液中各添加終濃度100-150ug.ml"的卵磷脂和膽固醇。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的倉怖弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于酉己帝柳磷脂和膽固醇時(shí)先將兩種物質(zhì)溶解于氯仿中配成100-150mg.ml"儲(chǔ)存液，現(xiàn)配現(xiàn)用或-20'C凍存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求7所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的超聲波處理制備免疫刺激復(fù)合物的方法為菌體粗蛋白按上述配苗比例添加皂苷、卵磷脂和膽固醇構(gòu)成免疫刺激復(fù)合物的基質(zhì)后，待濃縮菌液預(yù)凍或預(yù)溶至留有少量冰晶時(shí)進(jìn)行低溫超聲破碎、控制超聲破碎倉內(nèi)溫度不高于35。C;程序設(shè)置為間隔時(shí)間10秒，超聲作用5秒，全程時(shí)間為18分鐘；溫度不高于6(TC;在潔凈條件下，將超聲處理的免疫刺激復(fù)合物收集于500ml滅菌疫苗專用塑料瓶內(nèi)混勻后，測定免疫剌激復(fù)合物蛋白濃度，用滅菌PBS調(diào)整免疫刺激復(fù)合物的蛋白濃度至S-lSmg.!!!!'1;二次超聲處理后得到制品即為創(chuàng)傷弧菌免疫刺激復(fù)合物疫苗；將制得的免疫刺激復(fù)合物疫苗在-2(TC凍存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激物疫苗的制備工藝，其特征在于，它還包括如下步驟分裝和成品檢驗(yàn)步驟；所述的分裝步驟為將創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗分裝于100ml經(jīng)150-17(TC干熱處理1.5-2.5小時(shí)的疫苗專用玻璃瓶，加蓋、貼標(biāo)簽，-20匸凍存；所述的成品檢驗(yàn)步驟為將分裝后的成品進(jìn)行性狀檢驗(yàn)和純粹檢驗(yàn)；凍存前制品為棕黃色均勻濃稠液體，有輕微硫臭味；凍結(jié)狀態(tài)為棕黃色冰塊；所述的性狀檢驗(yàn)為制品用0.01MPBS1:100稀釋，差速離心去除細(xì)胞碎片，再超速離心濃縮ISCOMs，飽和磷鉤酸負(fù)染后置透射電鏡下觀察，可觀察到典型的直徑為35nm-40nm籠格狀結(jié)構(gòu)；所述的純粹檢驗(yàn)為抽檢2/10已分裝的疫苗，無菌條件下用移液器吸取混勻的ISCOMs0.1-0.5ml，均勻涂平板，26-3(TC恒溫箱培養(yǎng)48小時(shí)觀察應(yīng)無細(xì)菌生長。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免^lj激復(fù)合物疫苗的制備工藝，其特征在于，在上述步驟(1)之后步驟(2)之前進(jìn)行培養(yǎng)物的污染菌落檢測；具體方法如下每一批預(yù)擴(kuò)增和擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)均設(shè)同批次培養(yǎng)基空白對照，將培養(yǎng)基空白對照污染者廢棄；從每一批次生產(chǎn)的細(xì)菌中隨機(jī)抽樣2/10劃板培養(yǎng)，鑒定菌落形態(tài)、色澤，觀察有無雜菌生長；進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)評估細(xì)菌的抗原性，不合格產(chǎn)品高壓滅活后廢棄。11、根據(jù)權(quán)禾腰求I一IO中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗在水生動(dòng)物的應(yīng)用，其特征在于將制得的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗應(yīng)用于水生動(dòng)物的創(chuàng)傷弧菌的免疫預(yù)防。12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗在水生動(dòng)物的應(yīng)用，其特征在于采用注射給藥的方式或采用口服給藥的方式進(jìn)行免疫預(yù)防。全文摘要本發(fā)明涉及一種創(chuàng)傷弧菌全菌免疫刺激復(fù)合物疫苗的制備工藝及其在水生動(dòng)物的應(yīng)用，它包括如下步驟(1)將創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增與擴(kuò)大培養(yǎng)，(2)對培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行滅活，(3)對滅活的菌液進(jìn)行無活菌檢驗(yàn)(4)離心收集滅活的創(chuàng)傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行超聲波破碎，(6)免疫刺激復(fù)合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復(fù)合物。本發(fā)明選用的創(chuàng)傷弧菌毒力較強(qiáng)(LD₅₀約為200cfu/g)、且培養(yǎng)條件和優(yōu)化的培養(yǎng)基能使發(fā)酵液的活菌生物含量實(shí)現(xiàn)翻番，培養(yǎng)出的創(chuàng)傷弧菌生物量高達(dá)50mg/ml以上；為創(chuàng)傷弧菌疫苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。文檔編號C12N1/20GK101361971SQ20081007191公開日2009年2月11日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者劉曉東,林天龍,林能鋒,許斌福申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所