一種成纖維細(xì)胞特異性啟動子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種成纖維細(xì)胞特異性啟動子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細(xì)胞（fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時期的間充 質(zhì)細(xì)胞（mesenchymalcell)分化而來。成纖維細(xì)胞對不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺 損W及創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重要的作用。各種創(chuàng)傷均會造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死和 組織缺損，必須通過細(xì)胞增生和細(xì)胞間基質(zhì)的形成來進(jìn)行組織修復(fù)。在此修復(fù)過程中，成纖 維細(xì)胞的作用極為重要。
[0003] 細(xì)胞重編程技術(shù)是近年發(fā)展起來的細(xì)胞治療及組織修復(fù)與再生研究領(lǐng)域的熱點 與前沿。因成纖維細(xì)胞是各種組織器官中廣泛存在的一種細(xì)胞類型，因其具有數(shù)量大、來 源豐富的優(yōu)勢，成纖維細(xì)胞已經(jīng)成功細(xì)胞重編程研究領(lǐng)域的重要細(xì)胞來源。最近有研究通 過直接重編程的方法，采用屯、臟特異的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的不同組合形式，成功地將人和 小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為屯、肌樣細(xì)胞，運些細(xì)胞具有與屯、肌相似的基因表達(dá)模式和肌節(jié)結(jié) 構(gòu)，甚至有少量可W跳動的細(xì)胞（Ieda 1,化JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V,化yashi Y,Bruneau BG, Srivastava D.Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyoc}ftes by defined factors. Cell, 2010, 142(3) :375-86)。直接屯、肌細(xì)胞重編程 可將屯、臟原位成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換成有功能的屯、肌細(xì)胞，成為屯、血管修復(fù)與再生領(lǐng)域的一個全 新方法。
[0004] W豐富的成纖維細(xì)胞為祀細(xì)胞，利用細(xì)胞重編程技術(shù)進(jìn)行原位重編程，將成纖維 細(xì)胞重編程為不同種類的細(xì)胞類型，用于各種損傷組織器官的修復(fù)與再生，已經(jīng)成為細(xì)胞 治療及再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域極具潛力的新途徑。因此，建立成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因 動物模型，W及建立專口用于成纖維細(xì)胞表型鑒定及細(xì)胞譜系追蹤的報告基因載體系統(tǒng)， 已經(jīng)成為細(xì)胞重編程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。然而，上述研究均需要有效的成纖 維細(xì)胞特異性啟動子及其報告基因載體系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種成纖維細(xì)胞特 異性啟動子。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述成纖維細(xì)胞特異性啟動子的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明通過尋找一個更加有效的成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)基因FSPl的啟動子區(qū) 域，克隆成纖維細(xì)胞特異性激活的啟動子，并構(gòu)建該啟動子的巧光霉素報告基因載體。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明提供一種成纖維細(xì)胞特異性啟動子，來源于小鼠，由小鼠FSPl基因獲得， 命名為"mFSPl"或"啟動子mFSPl"，其DNA序列如SEQIDN0:1所示，片段長度為232化P。 mFSPl或啟動子mFSPl在FSPl基因中的具體位置：從-1079bp到+1242bp ;其結(jié)構(gòu)包含： TSS上游的1079bp，第一個外顯子（非編碼區(qū)），第一個內(nèi)含子，第二個外顯子中起始密碼子 (ATG)的上游序列（圖1)。
[0010] 所述的成纖維細(xì)胞特異性啟動子mFSPl的DNA序列如SEQIDNO:1所示：
[0012] 本發(fā)明所述啟動子的克隆方法如下所述：
[0013] 首先，設(shè)計并合成下列PCR引物，用于擴增包含F(xiàn)SPl基因的部分5' -UTR區(qū)域及 部分編碼區(qū)域的DNA片段，命名為mFSPl-p，大小為3229bp(-1079bp至巧15化P)(圖1)。
[0014] 所述PCR引物的DNA序列如下所示：
[0015] FSPl-F:5' -ATGTCTTCTTGGCTTACTTTTGTTT-3f;(沈QIDNO:3)
[0016] FSP1-R:5< -TCATCTGAGGAGTCTTCACTTCTTC-3< ;(沈QIDN0:4)
[0017] 然后，將上述PCR產(chǎn)物（3229bp)克隆到祀ASY-Blunt載體中，經(jīng)菌落PCR驗證及 測序驗證后，構(gòu)建pEASYB-mFSPl-p克隆載體。 陽0化]所述的mFSPl-p的DNA序列如沈QIDNO:2所示：

[0020] 含有所述的成纖維細(xì)胞特異性啟動子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組 菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0021] 所述的重組載體為將所述成纖維細(xì)胞特異性啟動子插入pMCS-GDLuc的化nl和 位點間得到的重組載體。
[0022] 擴增所述成纖維細(xì)胞特異性啟動子的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。 陽02引所述的引物對的DNA序列如下所示：
[0026] 上述引物中大寫字母及下劃線DNA序列為與模板中FSPl啟動子序列結(jié)合的區(qū)域； 方框內(nèi)的小寫字母為與pMCS-GDLuc報告基因載體中重疊的DAN序列；單獨的小寫字母為添 加的酶切位點序列。
[0027] 本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞特異性啟動子的巧光霉素報告基因重組載體的構(gòu)建方法 如下所述： 陽02引首先，設(shè)計并合成下列PCR引物，W pEASYB-mFSPl-p載體為DAN模板，PCR擴增FSPl啟動子區(qū)域，大小為2321bp。
[0029]所述PCR引物的DNA序列如下所示：
陽03引上述引物中大寫字母及下劃線DNA序列為與模板中FSPl啟動子序列結(jié)合的區(qū)域； 方框內(nèi)的小寫字母為與pMCS-GDLuc報告基因載體中重疊的DAN序列；單獨的小寫字母為添 加的酶切位點序列。
[0033] 然后，通過融合PCR技術(shù)，將所擴增的DNA片段與線性化的pMCS-GDLuc載體進(jìn) 行重組、連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑選單克隆、菌落PCR驗證及測序驗證后，構(gòu)建報告基因重組載體 pMCS-mFSPI-GDLuc,簡稱為pmFSPI-GDLuc。
[0034] 所述的成纖維細(xì)胞特異性啟動子在使目的基因在成纖維細(xì)胞中特異表達(dá)中的應(yīng) 用。
[0035] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果： W36] 本發(fā)明W來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3細(xì)胞）的基因組DNA為模板，W成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)基因FSPl為祀基因，克隆其5'端的啟動子區(qū)域，大小為 232化P(從-1079bp到+1242bp)，包含：TSS上游的1079bp，第一個外顯子（非編碼區(qū)），第 一個內(nèi)含子，第二個外顯子中起始密碼子（ATG)的上游序列。并將其克隆到巧光霉素報告 基因載體pMSC-GDLuc載體中，進(jìn)而構(gòu)建pmFSPl-GDLuc巧光報告基因載體。細(xì)胞功能研究 表明，本發(fā)明所構(gòu)建報告基因載體pmFSPl-GDLuc能夠特異性地在成纖維細(xì)胞中高效表達(dá)， 而在非成纖維細(xì)胞中僅有極少量的表達(dá)。因此，本發(fā)明成功克隆到成纖維細(xì)胞特異性啟動 子mFSPl(232化P)，并成功構(gòu)建了該啟動子的巧光報告基因載體，為細(xì)胞重編程、細(xì)胞譜系 追蹤及條件性基因表達(dá)調(diào)控研究提供了有效的材料及研究工具。
【附圖說明】
[0037] 圖1是本發(fā)明所述FSPl基因及其啟動子序列。
[0038] 圖2是本發(fā)明所述pEASYB-mFSPl-p載體構(gòu)建及其驗證結(jié)果。其中，A為FSPl-F/ FSPl-R引物擴增的mFSPl-p(3.沈b)的DNA片段的電泳圖譜巧為1~6號克隆的菌落PCR 電泳結(jié)果；C為祀ASYB-mFSPl-p載體的正向及反向測序結(jié)果；D為祀ASYB-mFSPl-p載體的 圖譜。
[0039] 圖3是本發(fā)明所述pmFSPl-GDLuc巧光報告基因載體構(gòu)建及其驗證結(jié)果。其中，A為 FSPl-luc-F/FSPl-luc-R引物擴增的啟動子mFSPl(2. 3化）的DNA片段的電泳圖譜；B為！~ 3號克隆的菌落PCR電泳結(jié)果；C為pmFSPl-GDLuc載體的反向測序結(jié)果；D為pmFSPl-GDLuc 載體的圖譜。 W40] 圖4是利用雙巧光霉素載體系統(tǒng)驗證pmFSPl-GDLuc載體的功能。其中，pTK-Re化UC載體為內(nèi)參報告基因載體；pMCS-GDLuc為對照報告基因載體；pmFSPl-GDLuc為 待檢測的報告基因載體。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0042] 實施例1FSPl基因啟動子序列及部分編碼序列的DNA片段克隆 陽0創(chuàng) （1)在NCBI數(shù)據(jù)庫調(diào)出小鼠來源的FSPl基因序列（Gene10:20198)，并對基因結(jié) 構(gòu)進(jìn)行分析，查找轉(zhuǎn)錄起始位點TSS、起始密碼子、終止密碼子、外顯子及內(nèi)含子區(qū)域（如圖 1所示）。 W44] 似利用PrimerPrimer5. 0軟件設(shè)計并合成下列PCR引物，