治療性抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及識(shí)別人C5a受體的人抗體。通過與C5aR結(jié)合，所述抗體抑制C5a信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制促炎信號(hào)?；贑5a及其受體在刺激炎癥中的作用，本發(fā)明還涉及所述人抗C5aR抗體的治療用途，尤其是關(guān)于免疫病癥的治療。
【專利說明】治療性抗體
技術(shù)背景
[0001]本發(fā)明涉及治療性抗體領(lǐng)域。
[0002]背景
每種補(bǔ)體蛋白C3-C5的蛋白水解都會(huì)產(chǎn)生具有信號(hào)傳導(dǎo)分子的氨基-末端陽離子片段(稱為過敏毒素)。這其中最強(qiáng)效的C5a引發(fā)最廣泛的反應(yīng)?？紤]到炎性反應(yīng)的組成部分為白細(xì)胞著邊(margination)和浸潤、顆粒結(jié)合型蛋白水解酶的釋放、活性氧和氮-衍生的自由基的產(chǎn)生、血流和毛細(xì)血管滲漏的改變以及收縮平滑肌的能力，C5a分子是“完全的”促炎介質(zhì)。在亞毫微摩爾至毫微摩爾水平上，C5a分子引發(fā)所有髓樣譜系(嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)的趨化作用，并引起由前列腺素和循環(huán)白細(xì)胞顯著增強(qiáng)的血管通透性。較高的毫微摩爾濃度引發(fā)NADPH氧化酶脫粒和活化。這種生物活性的廣度與其它炎性介質(zhì)形成對比。C5a參與包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、膿毒病、再灌注損傷和成人呼吸窘迫綜合征在內(nèi)的多種病癥的發(fā)病機(jī)理(Gerard和Gerard, 1994 ；Murdoch 和 Finn, 2000)。
[0003]C5a的活性通過C5a與其受體(C5aR)的結(jié)合而介導(dǎo)。C5aR屬于七次跨膜G-蛋白-偶聯(lián)受體的家族。C5aR是C5a的高親和カ受體，Kd為約I nM，并且C5aR位于多種不同細(xì)胞類型(包括白細(xì)胞)上。姆個(gè)細(xì)胞的受體數(shù)量都相當(dāng)高，多達(dá)200，000個(gè)位點(diǎn)/白細(xì)胞。該受體的生物活化發(fā)生在使結(jié)合飽和的范圍內(nèi)。
[0004]C5aR結(jié)構(gòu)符合七次跨膜受體家族，緊接于其胞外N-末端之后的是通過胞內(nèi)環(huán)和胞外環(huán)交替的螺旋間結(jié)構(gòu)域相連的七個(gè)跨膜螺旋，末端是是胞內(nèi)C-末端結(jié)構(gòu)域。C5aR含有延長的N-末端胞外結(jié)構(gòu)域。這種大型N-末端結(jié)構(gòu)域是G-蛋白偶聯(lián)受體(其結(jié)合包括IL-8和fMet-Leu-Phe (FM·LP)受體家族在內(nèi)的肽)所特有的。
[0005]C5aR拮抗劑對C5a反應(yīng)的抑制降低了經(jīng)由C5a介導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)，而不影響其他補(bǔ)體成分。為了這個(gè)目的，先前已經(jīng)描述了 C5aR肽拮抗劑和抗C5a受體抗體(Watanabe等人，1995 ;Pellas 等人，1998 ;Konteatis 等人，1994 ;Kaneko 等人，1995 ;Morgan 等人，1993)。例如，WO 95/00164描述了針對C5aR的N-末端肽(殘基9_29)的抗體。WO03/062278也描述了針對C5aR的抗體。這些小鼠抗體中的3種稱為7F3、6C12和12D4。已經(jīng)證明這些抗體具有優(yōu)良性能，例如非常有效地阻斷C5a與其受體的結(jié)合，在體外終止C5a-引導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的遷移，并在動(dòng)物模型中預(yù)防炎癥。為了控制慢性疾病，可能有必要在數(shù)月或數(shù)年內(nèi)連續(xù)幾次給予所述抗體。然而，給予小鼠抗體的一個(gè)缺點(diǎn)就是:人體免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生其針對小鼠抗體的自身抗體(HAMA反應(yīng))。HAMA反應(yīng)可通過從血液中快速清除小鼠抗體而中和它們，因此阻止小鼠抗體與其靶結(jié)合。為了避免HAMA反應(yīng)的發(fā)生，已經(jīng)采用的ー個(gè)策略就是使小鼠抗體“人源化”，即通過在非表位結(jié)合區(qū)用人序列替換盡可能多的“外源”殘基。
[0006]人源化程序的ー個(gè)主要問題是對抗原的親和カ的損失(Jones等人，1986)，在某些情況下多達(dá)10倍或更高,尤其是當(dāng)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)(Verhoeyen等人，1988)。任何親和力的損失當(dāng)然都是非常不希望的。至少，它意味著不得不將更多的人源化抗體以更高的成本和更大的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)注入患者中。甚至更嚴(yán)重的是，具有減少的親和カ的抗體可能具有更差的生物學(xué)功能，所述功能例如補(bǔ)體溶解、抗體-依賴性細(xì)胞毒性或病毒中和作用。盡管面對這些困難，抗人C5aR抗體的成功的人源化已經(jīng)描述于WO 2009/103113。
[0007]多年來已經(jīng)開發(fā)了多種策略以便進(jìn)一步使將抗體給予患者所致的任何不想要的副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)減至最小，其包括通過產(chǎn)生“完全”人抗體而在患者中降低形成抗藥物抗體的可能性。
[0008]甚至在今天，對適合于治療應(yīng)用的抗體的鑒定也是ー項(xiàng)挑戰(zhàn)性任務(wù)。因此，可用于診斷和/或治療方法的替代的和/或改進(jìn)的C5aR拮抗劑仍然令人非常感興趣。
[0009]概述
本發(fā)明涉及抗C5aR抗體以及它們在診斷和/或治療方法中的用途。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了與人C5aR結(jié)合的一系列抗體，在若干方面，所述抗體在功能上都優(yōu)于先前所述的抗C5aR抗體。
[0010]如本文所示，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了與人C5aR (hC5aR)結(jié)合的一系列人抗體并可取代hC5a與hC5aR的結(jié)合和抑制hC5a介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞遷移。另外本發(fā)明人已經(jīng)成功地將這些抗hC5aR抗體中的一個(gè)的框架區(qū)中存在的非人殘基轉(zhuǎn)化為人種系殘基，而不影響抗體效能。
[0011]此外，通過改變Fe區(qū)，本發(fā)明人已經(jīng)建立了抗hC5aR抗體，所述抗體在體外不誘導(dǎo)吞噬作用、ADCC或CDC。根據(jù)示例性實(shí)施方案的公開內(nèi)容，本發(fā)明的詳情將會(huì)是顯而易見的。
[0012]本發(fā)明的一方面涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述CDR序列包含以下序列組之一:SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQ ID17、18和19，SEQ ID 25、26和27或每種所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的
氨基酸殘基取代。
[0013]本發(fā)明的一方面涉及抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述CDR序列包含以下序列組之一；SEQ ID 5、6和7，5￡0 ID 13、14和15，SEQ ID21、22和23，SEQ ID 29、30和31或每種所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的
氨基酸殘基取代。
[0014]本發(fā)明的一方面涉及特異性結(jié)合hC5aR的人抗體，其中所述抗體優(yōu)選地結(jié)合hC5aR的第二胞外環(huán)。
[0015]本發(fā)明的一方面涉及特異性結(jié)合hC5aR的抗體，其中與IgGl、IgG2、IgG4和IgG4/G2參考序列相比，所述抗體Fe區(qū)已被修飾，降低了所述抗體經(jīng)由Fcy受體(FcyR)相互作用而誘導(dǎo)吞噬作用、ADCC和/或CDC的能力。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體Fe區(qū)是IgGl，在另ー個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)包含ー個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變組:
I )N297Q和/或
II)L234A 和 L235E 和/或
III)G236R 和 L328R 和/或
IV)N297Q、L234A 和 L235E 和/或
V)N297Q、L234A、L235E 和 G237A 和/或
VI)L234A、L235E、G237A、A330S 和 P331S另ー方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體在治療免疫疾病或病癥中的用途。
[0016]另ー方面，本發(fā)明涉及治療疾病或病癥的方法，所述方法包括給予有需要的受試者治療量的本文所述的抗體。
[0017]另ー方面，本發(fā)明提供在受試者中治療或預(yù)防病癥的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是免疫病理性病癥例如自身免疫性疾病。 [0018]根據(jù)本文的公開內(nèi)容(包括示例性的實(shí)施方案)，本發(fā)明的進(jìn)ー步的方面和實(shí)施方案將會(huì)是顯而易見的。由公開內(nèi)容可得出的是，本發(fā)明提供具有本文所表征的多種益處和優(yōu)勢的新的治療性抗體。
[0019]附圖簡述
圖1顯示了在本申請中分離和表征的所選單克隆抗體的可變區(qū)的比對。
[0020]圖2顯示了針對小鼠和人C5aR嵌合體的所選抗體的結(jié)合特異性。將32F3A6、35F12A2和35F32A3與嵌合人/小鼠C5aR的結(jié)合同與Ref Ab Q的結(jié)合進(jìn)行比較。示意性地顯示了嵌合受體。源自人和小鼠C5aR的區(qū)域分別用細(xì)線和粗線顯示。
[0021]圖3顯示了ー個(gè)抗體的可變區(qū)與最近的種系人抗體的可變重鏈和輕鏈序列的比對?！?"表示“在序列中中斷，例如在V、D或J區(qū)段之間。
[0022]圖4是在K/BxN-hC5aR_K0/KI血清轉(zhuǎn)移模型模型中建立炎癥后5天，1.p.給予
0.5、1.5或10mg/kg的單負(fù)荷劑量(箭頭)，接著分別給予0.25、0.5或2 mg/kg的9個(gè)日劑量的3個(gè)治療組的臨床評(píng)分，誤差棒表示土SD。對照接受IgGl 3G12。
[0023]圖5是在銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者和骨關(guān)節(jié)炎患者(對照)的滑液中的C5a蛋白表達(dá)。C5a水平在銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者組中顯著升高(p=0.001; Mann-Whitney)。
[0024]圖6是在克羅恩病(Crohn’ s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎中的C5aR蛋白表達(dá)的半定量分析。通過免疫組織化學(xué)來研究C5aR蛋白表達(dá)并在GraphPad Prism 5中通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)以及Dunn氏多重比較事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P〈0.05被認(rèn)為是顯著的。*Pく 0.05 P〈0.01 ;*** P〈0.0Olo
[0025]定義
除非另有說明，否則本發(fā)明所用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這些技術(shù)在例如以下文獻(xiàn)來源中有描述和解釋:J.Perbal, APractical Guide to Molecular Cloning, John Wiley ana Sons (1984)， J.Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour LaboratoryPress (1989)，T.A.Brown (編輯)，Essential Molecular Biology: A PracticalApproach,第 I 和 2 卷，IRL Press (1991)，D.M.Glover 和 B.D.Hames (編輯)，DNACloning: A Practical Approach,第1-4卷，IRL Press (1995和 1996)，和F.M.Ausubel等人(編車耳)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates andWiley-1nterscience (1988，包括至今的所有更新)，Ed Harlow和David Lane (編輯)Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)，和J.E.Coligan等人(編輯)Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons (包括至今的所有更新)。
[0026]如本文所用，“C5a受體”、“C5aR”、“C5aRl”或“人C5aR”及其變化形式是指人補(bǔ)體成分5受體1，在本領(lǐng)域中也稱為C5a過敏毒素受體和⑶88抗原。C5aR屬于七次跨膜G-蛋白-偶聯(lián)受體家族，并結(jié)合C5a (Gerard和Gerard，1991)。人C5aR氨基酸序列的實(shí)例在SEQ ID NO: 41中提供，然而，正如技術(shù)人員將會(huì)知道的，該分子具有天然存在的等位基因變體，它們也包括在該術(shù)語“C5aR”中。人C5aR的各種結(jié)構(gòu)域定義如下:
氨基酸1- 37:胞外結(jié)構(gòu)域N-末端，
氨基酸38 - 61:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸62 - 71:胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，
氨基酸72 - 94:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸95 - 110:胞外結(jié)構(gòu)域-胞外環(huán)I，
氨基酸111 - 132:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸133 - 149:胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，
氨基酸150 - 174:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸175 - 206:胞外結(jié)構(gòu)域-胞外環(huán)2，
氨基酸207 - 227:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸228 - 242:胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，
氨基酸243 - 264:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸265 - 283:胞外結(jié)構(gòu)域-胞外環(huán)3，
氨基酸284 - 307:跨膜結(jié)構(gòu)域，
氨基酸308 - 350:胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域-C-末端。
[0027]術(shù)語“治療”，如本文所用，是指有需要的任何人類或其它動(dòng)物受試者的醫(yī)學(xué)治療。所述受試者預(yù)期已由醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)從業(yè)人員進(jìn)行體檢，所述從業(yè)人員已給出試驗(yàn)性或確定的診斷，表明使用所述特定治療對所述人類或其它動(dòng)物受試者的健康是有益的。所述治療的時(shí)間安排和目的可根據(jù)受試者的健康狀況，因個(gè)體不同而異。因此，所述治療可以是預(yù)防性的、姑息性的、對癥的和/或治愈性的。就本發(fā)明而言，預(yù)防性的、姑息性的、對癥的和/或治愈性的治療可以代表本發(fā)明的各個(gè)方面。
[0028]與醫(yī)學(xué)治療相關(guān)，本文所用的術(shù)語“受試者”意圖是指任何動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物，例如人、馬、牛、貓和狗，并且在合適時(shí)可與術(shù)語“患者”互換使用。優(yōu)選地，所述受試者是人。本文所用的術(shù)語“治療”、“醫(yī)治”或“療法”及其變化形式包括給予治療有效量的本發(fā)明的抗體，其足以減少或消除病癥的至少ー種癥狀。
[0029]本文所用的術(shù)語“預(yù)防”、“防止”或“阻止”或其變化形式是指保護(hù)受試者免于發(fā)展疾病的至少ー種癥狀，或者降低病癥癥狀的嚴(yán)重程度。
[0030]本文所用的術(shù)語“暴露細(xì)胞”是指提供抗體，使其能夠接觸/結(jié)合人C5aR，只要C5aR存在于細(xì)胞上。
[0031]術(shù)語“有效濃度50%” (縮寫為“EC50”)代表抗體靶向的分子的特定作用(例如抑制/取代(displa ce)人C5a與人C5aR的結(jié)合)的50%所需的本發(fā)明抗體的濃度。本領(lǐng)域人員將會(huì)理解，較低的EC50值相當(dāng)于更強(qiáng)效的抗體。
[0032]本文所用的術(shù)語“抑制”是指顯著降低、和可能完全消除確定的活性。優(yōu)選地，確定的活性被降低或抑制至少50%，更優(yōu)選地至少75%和甚至更優(yōu)選地至少90%。
[0033]在本說明書全文中，術(shù)語“包括”或諸如“包含”、“含有”等變化形式將被理解為是暗指包括所陳述的要素、整數(shù)或步驟或者要素組、整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其他要素、整數(shù)或步驟或者要素組、整數(shù)組或步驟組。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，分子基本上由確定序列組成。
[0035]在另ー個(gè)實(shí)施方案中，分子由確定序列組成。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子例如抗體或DNA序列是分離的分子。術(shù)語“分離的抗體”是指已經(jīng)從其天然環(huán)境的另外的/其它的組分中分離和/或回收的和/或從其天然環(huán)境中的組分混合物中純化的抗體。
[0037]本文所用的術(shù)語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。全長抗體(或完整抗體)包含4條多肽鏈，即通過二硫鍵相連的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL)。重鏈恒定區(qū)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域:CH1、CH2和CH3。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括I個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH區(qū)和VL區(qū)可進(jìn)ー步細(xì)分為超變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))，其間插有更保守的區(qū)(稱為框架區(qū)(FR))。
[0038]每個(gè)VH和VL包括三個(gè)⑶R和四個(gè)FR，從氨基末端到羧基末端按以下順序排列:FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。
[0039]本文所用的術(shù)語“抗體”用于描述完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈，其特異性結(jié)合其相應(yīng)抗原。抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab) S、Fv (典型地，抗體單臂的VL區(qū)和VH結(jié)構(gòu)域)、單鏈Fv (scFv ；參見例如 Bird 等人，Science 1988 ；242:42S-426;和 Huston 等人，PNAS 1988 ；85:5879-5883)、dsFv、Fd (典型地，VH區(qū)和CHI結(jié)構(gòu)域)和dAb (典型地，VH結(jié)構(gòu)域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR結(jié)構(gòu)域；ー價(jià)分子，包括單條VH和單條VL鏈；微抗體(minibodies)、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和k體(kappa bodies)(參見例如111等人，Protein Eng 1997; 10:949-57);駱駝IgG ;IgNAR ;以及ー個(gè)或多個(gè)分離的CDR或功能性互補(bǔ)位，其中分離的CDR或抗原結(jié)合殘基或多肽可結(jié)合或連接在一起，以便形成功能性抗體片段。不同類型的抗體片段已經(jīng)描述或綜述于例如Holliger和Hudson, NatBiotechnol 2005; 2S: 1126-1136 ;W02005040219 和已公布的美國專利申請 20050238646 和20020161201。
[0040]術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(“⑶R”)或“超變區(qū)”，當(dāng)用于本文時(shí)，是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。CDR通常包括以下:輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基24-34 (LI)、50-56 (L2)和89-97 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基31-35 (Hl),50-65 (H2)和95-102 (H3) (Kabat 等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，U.S.Department of Health and Human Services, NIH 公布號(hào).91-3242)和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中來自“超變環(huán)”的那些殘基(殘基26-32 (LI),50-52 (L2)和91-96(L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32 (HI),53-55 (H2)和96-101 (H3) ;Chothia和Lesk, J.Mol.Biol 1987; 196:901-917)。典型地，通過例如以下文獻(xiàn)描述的方法，在該區(qū)中對氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)=Kabat等人，同上。短語例如“Kabat位置”、“Kabat殘基”和“按照Kabat”在本文中是指用于重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的該編號(hào)系統(tǒng)。使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)，肽的實(shí)際線性氨基酸序列可含有較少或另外的氨基酸，對應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域的FR或⑶R的縮短，或插入可變結(jié)構(gòu)域的FR或⑶R中。例如，重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包括在⑶R H2的殘基52之后的氨基酸插入(殘基52a、52b和52c，按照Kabat)和在重鏈FR殘基82之后的插入殘基(例如根基82a、82b和82c等,按照Kabat)。對于給定的抗體,可通過抗體序列的同源區(qū)與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)的序列的比對，確定殘基的Kabat編號(hào)。
[0041]術(shù)語“框架區(qū)”或“FR”殘基是指不在⑶R內(nèi)的那些VH或VL氨基酸殘基，如本文中定義。
[0042]抗體的片段結(jié)晶區(qū)(“Fe區(qū)”/ “Fe結(jié)構(gòu)域”)是與細(xì)胞表面受體(稱為Fe受體)相互作用的抗體的“尾”區(qū)，以及補(bǔ)體系統(tǒng)的ー些蛋白。
[0043]單克隆抗體通常通過將骨髄瘤細(xì)胞與來自經(jīng)所需抗原免疫的小鼠的脾細(xì)胞融合而制備。人單克隆抗體可得自編碼人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠或其它合適物種)?；蛘撸赏ㄟ^包括被稱為庫克隆(repertoire cloning)或卩遼菌體展示/酵母菌展示的技術(shù)來制備重組單克隆抗體。重組抗體工程包括使用病毒或酵母菌、而不是小鼠，以產(chǎn)生抗體。
[0044]術(shù)語“人源化抗體”，如本文所用，是指人/非人嵌合抗體，其含有序列，通常至少是衍生自非人種系免疫球蛋白序列的最小互補(bǔ)決定區(qū)(CDR序列)。因此，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受者抗體):其中來自受者超變區(qū)的殘基被來自非人類物種(供者抗體)的超變區(qū)殘基置換，所述非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類，所述抗體具有所需的特異性、親和カ和能力。
·[0045]至少包含并非衍生自人種系序列的CDR區(qū)的人源化抗體也可稱為“嵌合抗體”，如果典型地通過遺傳工程，由源自不同物種的免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因構(gòu)建抗體輕鏈和重鏈基因的話。例如，可將來自小鼠單克隆抗體的基因的可變區(qū)段連接到人恒定區(qū)段。
[0046]術(shù)語“人抗體”，如本文所用，意圖包括具有這樣的可變區(qū)的抗體:其中框架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。注意到這樣的抗體可仍然包含人種系序列中不存在的氨基酸殘基，因?yàn)樵隗w內(nèi)或體外成熟化而發(fā)生的突變。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，該恒定區(qū)也主要源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可仍然包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過在體外的隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或者通過在體內(nèi)的體細(xì)胞突變而引入的突變)。另ー方面，術(shù)語“人抗體”，如本文所用，無意包括其中CDR序列衍生自其它哺乳動(dòng)物物種例如小鼠的種系并且隨后被移植到人框架序列的抗體或替代的抗原結(jié)合區(qū)(參見以上的人源化抗體)。人抗體可以是人單克隆抗體。這類人單克隆抗體可以通過雜交瘤而產(chǎn)生，所述雜交瘤包括融合到永生化細(xì)胞的、得自轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠，其具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組)的B細(xì)胞。人抗體也可分離自在所選人種系序列上構(gòu)建的序列文庫，用天然的和合成的序列多祥性而進(jìn)ー步多樣化?？赏ㄟ^體外免疫人淋巴細(xì)胞，然后用EB病毒轉(zhuǎn)化該淋巴細(xì)胞，制備人抗體?？梢澡b定人抗體的序列，允許通過重組方法產(chǎn)生抗體。
[0047]此外，人源化抗體、人抗體和完全人抗體可包含受者抗體或供者抗體中不存在的殘基。可以進(jìn)行這樣的修飾以進(jìn)ー步改進(jìn)抗體性能。
[0048]術(shù)語“抗體衍生物”是指抗體的任何修飾形式，例如抗體與另ー種試劑或抗體的綴合物。[0049]術(shù)語“抗原”是指用于免疫具有免疫活性的脊椎動(dòng)物以產(chǎn)生識(shí)別該抗原的抗體的分子實(shí)體。本文的術(shù)語抗原使用更廣泛并且通常意圖包括被抗體特異性識(shí)別的靶分子，因此包括用于免疫過程以產(chǎn)生抗體的分子的片段或模擬物，或者在免疫后用于篩選的這樣的分子，以及用于在通過替代方法(例如噬菌體展示篩選)而獲得抗體的情況下用于篩選的分子。
[0050]術(shù)語“表位”，如本文所用，是在“抗原結(jié)合多肽”例如抗體與其相應(yīng)“抗原”間的分子相互作用的情況下定義。通常，“表位”是指抗體特異性結(jié)合的抗原的區(qū)域或區(qū)，即與抗體物理接觸的區(qū)域或區(qū)。蛋白表位可包含直接參與抗體結(jié)合的抗原中的氨基酸殘基(也稱為表位的免疫顯性成分)和并非直接參與結(jié)合的其它氨基酸殘基，例如被Ab有效阻斷的抗原的氨基酸殘基(換句話說，所述氨基酸殘基在“溶剤-排除的表面”和/或抗體“足跡”內(nèi))。給定的抗原可包含多個(gè)不同表位，其可包括但不限于:線性肽抗原決定簇，構(gòu)象抗原決定簇，其由在天然(成熟)構(gòu)象中彼此位置靠近的一個(gè)或多個(gè)非毗鄰氨基酸組成；和翻譯后的抗原決定簇，其全部或者部分地由共價(jià)連接到該抗原上的分子結(jié)構(gòu)(例如碳水化合物基團(tuán))組成。
[0051]由事實(shí)(即，取決于所用的表位作圖方法，在不同細(xì)節(jié)水平上得到表位的描述和定義)可得出的是，可類似地在不同細(xì)節(jié)水平上，對于相同Ag上的不同Ab的表位進(jìn)行比較。
[0052]術(shù)語“結(jié)合”、“特異 性結(jié)合”和“結(jié)合特異性”在本文中用于描述抗體或其抗原結(jié)合片段的選擇性。
[0053]本發(fā)明的抗體可特異性結(jié)合C5aR，表明該抗體對于其它抗原具有顯著更低的親和力，其中顯著更低可以是例如至多為1/2，或至多為1/5或至多為1/10?？贵w可以進(jìn)ー步是物種特異性的，例如抗體以高親和力特異性結(jié)合人C5aR，而非小鼠C5aR。
[0054]術(shù)語“結(jié)合親和力”在本文中用作兩個(gè)分子(例如抗體或其片段與抗原)間非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度的度量。該術(shù)語“結(jié)合親和力”用于描述ー價(jià)相互作用(內(nèi)在活性)?？赏ㄟ^測定解離常數(shù)(Kd)定量測定通過ー價(jià)相互作用的兩個(gè)分子(例如抗體或其片段與抗原)間的結(jié)合親和力。繼而可通過復(fù)合物形成和解離的動(dòng)力學(xué)測量例如通過SPR方法測定Kdo對應(yīng)于一價(jià)復(fù)合物的結(jié)合和解離的速率常數(shù)分別稱為結(jié)合速率常數(shù)ka (或kj和解離速率常數(shù)kd (或koff)。Kd通過等式Kd = kd/ka與ka和kd相關(guān)。
[0055]此外，“親和力”涉及分子(例如抗體)的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和配體(例如抗原)之間的結(jié)合強(qiáng)度。分子X對配體Y的親和カ用解離常數(shù)(Kd)來表示，該常數(shù)是占據(jù)溶液中存在的半數(shù)X分子的結(jié)合位點(diǎn)所需的Y的濃度。較小的Kd表示較強(qiáng)或較高的親和カ相互作用，并且需要較低的配體濃度占據(jù)這些位點(diǎn)。同樣，可通過測定和比較目標(biāo)相互作用(例如抗體與抗原間的特異性相互作用)的Kd值與非目標(biāo)相互作用的Kd值，來評(píng)價(jià)相互作用的特異性。
[0056]典型地，抗體對靶的Kd可比對其它非靶分子(例如無關(guān)物質(zhì)或環(huán)境中的伴隨物質(zhì)或?qū)φ?的Kd小2倍，優(yōu)選地5倍，更優(yōu)選地10倍。更優(yōu)選地，Kd可為小50倍，例如小100倍，或小200倍；甚至更優(yōu)選小500倍，例如小1，000倍，或小10，000倍。
[0057]該解離常數(shù)的值可通過眾所周知的方法直接測定，甚至對于復(fù)雜混合物可通過例如以下文獻(xiàn)給出的方法計(jì)算:Caceci等人(Byte 9:340-362, 1984)。例如,可通過例如以下文獻(xiàn)中公開的方法，用雙過濾硝基纖維素濾器結(jié)合測定來確定Kd:Wong & Lohman (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90, 5428-5432，1993)。評(píng)價(jià)配體例如抗體對于靶的結(jié)合能力的其它標(biāo)準(zhǔn)測定是本領(lǐng)域已知的，包括例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡、RIA和流式細(xì)胞術(shù)分析。也可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定例如SPR來評(píng)價(jià)抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和結(jié)合親和力。
[0058]可進(jìn)行競爭性結(jié)合測定，其中將抗體與靶的結(jié)合同該靶的另ー種配體(例如另ー種抗體)與該靶的結(jié)合進(jìn)行比較。發(fā)生50%抑制時(shí)的濃度稱為Ki。在理想條件下，Ki等于Kd。Ki值絕不會(huì)小于Kd，因此對Ki的測量可被方便地替代為提供Kd的上限。
[0059]正如技術(shù)人員將會(huì)理解的，“親合力(avidity) ”涉及兩分子例如抗體和抗原之間的相互關(guān)系的總體強(qiáng)度。親合力同時(shí)取決于親和力和相互作用的效價(jià)(valency)。
[0060]用于確定給定抗體的功能性的另外測定可包括基于細(xì)胞的測定，其對給定抗原和抗體結(jié)合的作用是特異性的。
[0061]本領(lǐng)域已知的術(shù)語“同一性”是指通過比較序列而確定的兩個(gè)或更多個(gè)多肽的序列間的關(guān)系。在本領(lǐng)域，“同一性”也指通過兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基串(string)之間的匹配數(shù)而確定的多肽間的序列相關(guān)性程度。“同一性”測量兩個(gè)或更多個(gè)序列中較小的之間相同匹配的百分比，其中通過具體的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即“算法”)處理空位(gap)比對(如果有的話)。可通過已知方法容易地計(jì)算出相關(guān)多肽的同一性。這類方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中描述的那些:Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編輯，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing:1nformatics and GenomeProjects, Smith, D.ff.編輯,Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysisof Sequence Data,第 I 部分，Griffin, A.M.,和 Griffin, H.G.編輯，HumanaPress, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.^PDevereux,J.編輯，M.Stockton Press, New York, 1991;和 Carillo 等人，SIAM J.AppliedMath.48, 1073 (1988)。
[0062]設(shè)計(jì)了用于確定同一性的優(yōu)選方法，以得到所測試序列間的最大匹配。確定同一性的方法描述于公眾可得的計(jì)算機(jī)程序中。用于確定兩個(gè)序列間同一性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括 GCG 程序包,包括 GAP (Devereux 等人，Nucl.Acid.Res.12, 387 (1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP、BLASTN和 FASTA (Altschul 等人，J.Mol.Biol.215, 403-410 (1990))。BLASTX 程序可公開獲自美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)和其它來源(BLAST Manual, Altschul 等人 NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.20894 ；Altschul等人，同上)。眾所周知的Smith Waterman算法也可用于確定同一‘注。
[0063]例如，使用計(jì)算機(jī)算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, ffis.),比對待確定％序列同一11"生的兩個(gè)多肽，用于相應(yīng)氨基酸的最佳匹配(“匹配跨度(matched span) ”，由算法確定)?？瘴婚_放罰分(經(jīng)計(jì)算為平均對角線的3倍；“平均對角線”是所用的比較矩陣的對角線的平均值；“對角線”是通過特定比較矩陣而賦值給每個(gè)完美氨基酸匹配的分值或數(shù)量)和空位延伸罰分(其通常是{分?jǐn)?shù)(1/10)}乘以空位開放罰分)、以及比較矩陣?yán)鏟AM 250或BLOSUM 62共同用于該算法。該算法還使用標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(參見Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence andStructure,第5卷，附錄3 (1978)用于PAM 250 比較矩陣；Henikoff 等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 型，10915-10919 (1992)用于 BLOSUM 62 比較矩陣)。
[0064]用于肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括如下:
算法:Needleman 等人，J.Mol.Biol.48, 443-453 (1970);比較矩陣:BLOSUM62來自Henikoff等人，PNAS USA型，10915-10919 (1992);空位罰分:12，空位長度罰分:4，相似性閾值:0。 [0065]用上述參數(shù)，GAP程序是有用的。使用GAP算法，上述參數(shù)對于肽比較是默認(rèn)參數(shù)(連同末端空位無罰分)。
[0066]“保守的氨基酸取代”可以包括一個(gè)氨基酸殘基被另ー殘基取代，使得對該位置上的氨基酸殘基的極性或電荷很少或沒有影響。這以下述氨基酸組為例，其中一個(gè)氨基酸被同組中的不同氨基酸取代被認(rèn)為是保守的取代:親水性:Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser> Thr ;脂族:Val、lie、Leu、Met ;堿性:Lys、Arg、His ;芳族:Phe、Tyr、Trp。此外，任何殘基都可以頻繁地被丙氨酸取代。
[0067]此外，若期需，可將非天然氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物作為取代或添加引入到本發(fā)明的抗體和/或免疫球蛋白鏈。這樣的氨基酸包括但不限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體、2，4- 二氨基丁酸、a-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、3 -丙氨酸、氟代-氨基酸、設(shè)計(jì)氨基酸(designer amino acid)例如(6-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和一般而言的氨基酸類似物。
[0068]可通過將合適核苷酸變化引入本發(fā)明的核酸，或通過所需多肽的體外合成，制備本發(fā)明的抗體和/或免疫球蛋白鏈的氨基酸序列突變體。這樣的突變體包括例如氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代?？芍苽淙笔?、插入和取代的組合，以得到最終的構(gòu)建體，只要最終的多肽產(chǎn)物具有所需特征?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)來制備突變的(改變的)多肽。例如,可使本發(fā)明的多核苷酸經(jīng)歷體外誘變。這樣的體外誘變技術(shù)包括使該多核苷酸亞克隆到合適的載體，將該載體轉(zhuǎn)化到“增變(mutator) ”菌株例如大腸桿菌(￡ coif)XL-1 red (Stratagene)并將該轉(zhuǎn)化的細(xì)菌增埴合適的傳代次數(shù)?？墒褂帽疚乃龅募夹g(shù)容易地篩選源自突變的/改變的DNA的產(chǎn)物，以確定它們是否具有受體結(jié)合活性和/或受體抑制活性。
[0069]在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變體中，突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)將取決于待修飾的特征。突變的位點(diǎn)可被單獨(dú)修飾或系列修飾，例如，通過(I)首先用保守氨基酸選擇物取代，然后根據(jù)獲得的結(jié)果用更激進(jìn)的選擇物取代，(2)刪除靶殘基，或(3)插入與定位位點(diǎn)(located site)相鄰的其他殘基。
[0070]氨基酸序列缺失范圍一般為約1-15個(gè)殘基，更優(yōu)選為約1-10個(gè)殘基，以及典型地為約1-5個(gè)連續(xù)的殘基。
[0071]描述
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了對于生物治療劑和特定抗體的功能性和功效的若干相關(guān)方面，本發(fā)明的主要領(lǐng)域是用于通過抑制C5a與C5aR的結(jié)合而治療炎性疾病的抗體。
[0072]本發(fā)明的一方面涉及一系列抗體中的ー種或多種，其特征在于它們的功能性和/或CDR的氨基酸序列、重鏈和輕鏈的可變區(qū)和/或Fe結(jié)構(gòu)域的序列。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是全長抗體，其包括標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)構(gòu)域和區(qū)。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是抗體片段，所述片段可使用常規(guī)重組或蛋白質(zhì)エ程技術(shù)而獲得。本發(fā)明的抗體片段可通過截短而制備，例如通過從多肽的N-端和/或C-端末端除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。片段也可通過ー個(gè)或多個(gè)內(nèi)部缺失而產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體可以是或可包含本發(fā)明所基于的抗體中的任何一個(gè)的片段。本發(fā)明的抗體可以是或可包含這些抗體或其變體中的ー個(gè)的抗原結(jié)合部分。例如，本發(fā)明的抗體可以是這些抗體或其變體中的ー個(gè)的Fab片段，或者它可以是源自這些抗體或其變體中的ー個(gè)的單鏈抗體。
[0075]本發(fā)明的抗體可來自不同物種，包括哺乳動(dòng)物物種，例如小鼠、大鼠、兔、豬或非人類靈長類。所述抗體可以是嚙齒類抗體和更特別的是小鼠抗體?；蛘咚隹贵w可來自非哺乳動(dòng)物物種，例如雞。所述抗體還可以是人源化抗體或人抗體。
[0076]本發(fā)明的抗體可具有與另ー種本發(fā)明的抗體競爭性結(jié)合C5aR的能力，如本文所述?？稍跇?biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定中，根據(jù)它們與已知的本發(fā)明抗體交叉競爭的能力而鑒定這類交叉競爭的抗體。這類交叉競爭可表明兩種抗體結(jié)合到相同的、重疊的或相似的表位上。
[0077]人抗體
如本文的實(shí)施例所述，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了源自轉(zhuǎn)基因小鼠并包含人免疫球蛋白種系基因座的一系列抗C5aR抗體。所述抗體被分離成單克隆雜交瘤抗體并評(píng)價(jià)其結(jié)合特征。正如所述，C5aR是七次跨膜GPCR和保留了天然構(gòu)象的可溶性形式(不可能生產(chǎn))。為了產(chǎn)生阻斷hC5a與hC5aR結(jié)合的人抗體，轉(zhuǎn)基因小鼠用表達(dá)天然hC5aR的細(xì)胞來免疫。然而，阻斷的抗體非常難以獲得，在鑒定具有所需阻斷特性的人抗體之前，本發(fā)明人進(jìn)行了 32次融合。從35次融合和超過100，000個(gè)雜交瘤上清液的篩選中，總共得到11種阻斷的抗體。
[0078]此外，因?yàn)閔C5aR的性質(zhì),不可能通過標(biāo)準(zhǔn)Biacore分析而測定抗體的親和力，因此根據(jù)功能性hC5aR-依賴性讀出而建立測定，從中測定IC50和EC50值，如實(shí)施例2和實(shí)施例7所述。
[0079]一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合C5aR的人抗體，并且進(jìn)一步優(yōu)選的是所述抗體特異性結(jié)合hC5aR，使得與hC5aR的結(jié)合強(qiáng)于與來自其他物種例如尤其是小鼠C5aR的結(jié)合。在ー個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是所述抗體結(jié)合C5aR的第二胞外環(huán)和更優(yōu)選人C5aR的第二環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合人C5aR的第二胞外環(huán)，而非鼠C5aR的第二胞外環(huán)。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體僅可結(jié)合天然構(gòu)象的C5aR的第二胞外環(huán)。
[0080]抗C5aR抗體的功能性依賴于所述抗體顯著抑制或降低C5a與C5aR的結(jié)合的能力。
[0081]在一個(gè)實(shí) 施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合C5aR的人抗體或涉及本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)，其中所述抗體能夠顯著抑制或降低C5a與C5aR的結(jié)合。這可以通過本文的實(shí)施例2中所述的取代(displacement)測定(SPA)而測定,從中可測定IC50值。如表1所不，所分離和描述的11種抗體的IC50濃度低于50nM。在本發(fā)明的進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述抗體在SPA測定中能夠取代hC5a，其IC50低于50nM，例如低于40nM，例如低于30nM，例如低于20nM，例如低于10nM，例如低于5nM或甚至低于4nM，或其中IC50低于3nM或甚至低于2.5nM或2.0nM。
[0082]在進(jìn)ー步測定中，評(píng)價(jià)了抗C5aR抗體抑制C5a_依賴性的人嗜中性粒細(xì)胞遷移的能力并且發(fā)現(xiàn)ー些所鑒定的人抗體與先前所述的C5aR抗體相比是C5a-介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞遷移的更強(qiáng)效的抑制劑(WO 2009/103113的Q)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此涉及本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)或結(jié)合C5aR的人抗體，其中所述抗體能夠顯著抑制人嗜中性粒細(xì)胞的遷移。在一個(gè)實(shí)施方案中，與在IOnM C5a和無抗C5aR抗體存在下觀察到的遷移水平相比，所述抗體抑制遷移至小于50%，小于40%，小于30%，小于20%，或小于10%。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，在10 nM C5a和抗體存在下在30分鐘后測定遷移，與在10nM C5a和無抗體存在下在30分鐘后所觀察到的遷移水平相比。或者，根據(jù)同樣的設(shè)置，使用IC50值，可表示抗體抑制嗜中性粒細(xì)胞遷移的能力。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，IC50低于2.5 Mg/ml,例如低于2.5 Mg/ml,例如低于1.5 Mg/ml,例如低于1.2 Mg/ml或甚至低于
1.0 M-g/ml。
[0083]作為標(biāo)準(zhǔn)Biacore分析的替代方法，可以通過實(shí)施例7所述的對嗜中性粒細(xì)胞的競爭結(jié)合測定來測定hC5aR抗體的功能性。該功能性是指通過競爭配體結(jié)合測定而測量的抗體親和力，但是也可認(rèn)為是相互作用的親合力的度量。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中涉及本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)或結(jié)合C5aR的人抗體，其中通過對嗜中性粒細(xì)胞的競爭配體結(jié)合測定而測量的抗體親和カ或親合力低于0.80nM、0.70nM、0.60nM，例如低于
0.50nM、0.45nM、0.40nM 或 0.35nM。
[0084]使用鈣流量(calcium-flux)測定，探究了用于表征抗體的另外選項(xiàng)，所述測定測量抗體在離體時(shí)抑制C5a誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞活化的能力，同樣描述于實(shí)施例7。在ー個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)或結(jié)合C5aR的人抗體，其中在鈣流量測定中測定的IC50低于7.0Pg/ml，例如低于5.0μg/ml，例如低于
2.5μg/ml。
[0085]基于次級(jí)效應(yīng)例如cdlb和cd62L表達(dá)，額外的離體測定可用于測定抗體抑制或中和C5a誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞成熟的能力。CDllb和CD62L是嗜中性粒細(xì)胞的成熟標(biāo)記，因?yàn)樗鼈冊谕ㄟ^C5a/C5aR相互作用而活化之后分別被上調(diào)和下調(diào)。
[0086]測定了在CDllb上調(diào)測定中的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)或結(jié)合C5aR的人抗體，其中在CDllb上調(diào)測定中測定的IC50低于3.5Pg/ml，例如3.0Pg/ml，例如低于2.5Pg/ml，例如低于2.0lVml或例如1.5μg/ml或甚至低于1.0μg/ml 。
[0087]同樣，測定了在CD62L下調(diào)測定中抗體的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)或結(jié)合C5aR的人抗體，其中在CD62L下調(diào)測定中測定的IC50低于1.8吒/ml，例如低于1.5μg/ml，例如低于1.2 μg/ml或甚至低于1.0Mg/ml。
[0088]選擇了 4種單克隆抗體用于測序，以測定可變區(qū)序列和尤其是CDR序列。序列比對見圖1并且序列同樣包括在所附序列表中。
[0089]序列表包括分離的抗體相關(guān)的以下序列:
SEQ ID 1-3: Vh 35F32A3 CDR 1-3
SEQ ID 4: Vh 35F32A3
SEQ ID 5-7: Vl 35F32A3 CDR 1-3
SEQ ID 8: Vl 35F32A3以類似方式，SEQ ID 9-16描述了 32F3A6 以類似方式，SEQ ID 17-24描述了 35F12A2 以類似方式，SEQ ID 25-32描述了 35F24A3 可變區(qū)或CDR序列所定義的抗體
因此，本發(fā)明的抗體可以根據(jù)CDR序列、重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列和其上的小修飾(本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行這樣的修飾而不改變抗體功能性)而定義。這包括每個(gè)⑶R序列內(nèi)的ー個(gè)或多個(gè)(例如1、2或3個(gè)氨基酸殘基)的氨基酸取代、缺失或插入。
[0090]一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合C5aR的抗體，其由CDR區(qū)序列定義，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含選自以下組的⑶R1、⑶R2和⑶R3序列:
a)SEQ ID 1、2和3，其中所述序列中的O、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸；和
b)SEQ ID 9、10和11，其中所述序列中的0、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸；和
c)SEQ ID 17、18和19，其中所述序列中的0、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸；和
d)SEQ ID 25、26和27，其中所述序列中的O、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸。
[0091 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合C5aR的抗體，其由CDR區(qū)序列定義，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列；
其中所述⑶Rl序列包含SEQ ID 1、9、17、25或所述序列中的ー個(gè)，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代；和
其中所述⑶R2序列包 含SEQ ID 2、10、18、26或所述序列中的ー個(gè)，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代；和
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 3、11、19、27或所述序列中的ー個(gè)，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0092]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合C5aR的抗體，其由CDR區(qū)序列定義，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含選自以下組的⑶R1、⑶R2和⑶R3序列:
a)SEQ ID 5、6和7，其中所述序列中的O、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸；和
b)SEQ ID 13、14和15，其中所述序列中的0、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸；和
c)SEQ ID 21、22和23，其中所述序列中的O、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸；和
d)SEQ ID 29、30和31，其中所述序列中的O、1、2或3個(gè)包含被不同的氨基酸殘基取代的1、2或3個(gè)氨基酸。
[0093]一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合C5aR的抗體，其由CDR區(qū)序列定義，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列；
其中所述⑶Rl序列包含SEQ ID 5、13、21、29或所述序列中的ー個(gè)，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代；和其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 6、14、22、30或所述序列中的ー個(gè)，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代；和
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 7、15、23、31或所述序列中的ー個(gè)，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0094]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 1、2和3或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可變輕鏈的CDR包含SEQ ID 5、6和7或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。
[0095]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 9、10和11或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可變輕鏈的CDR包含SEQ ID 13,14和15或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。
[0096]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 17,18和19或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可變輕鏈的CDR包含SEQ ID 21、22和23或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。
[0097]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 25,26和27或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可變輕鏈的CDR包含SEQ ID 29、30和31或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。
[0098]因此本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和CDR3序列，其中所述⑶R序列包含以下序列組之一:SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQ ID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27或者每ー序列具有至多兩個(gè)取代、缺失和/或插入的所述序列和其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列組之一:SEQ ID 5、6和7，5已0 ID 13、14 和 15，SEQ ID 21、22和23，5已0 ID29、30和31或者甸一序列具有至多兩個(gè)取代、缺失和/或摘入的所述序列。
[0099]因此本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和CDR3序列，其中所述⑶R序列包含以下序列組之一:SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQ ID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27或者每ー序列具有至多ー個(gè)取代、缺失和/或插入的所述序列和其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列組之一:SEQ ID 5、6和7，5已0 ID 13、14 和 15，SEQ ID 21、22和23，5已0 ID29,30和31或者每ー序列具有至多ー個(gè)取代、缺失和/或插入的所述序列。
[0100]因此本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和CDR3序列，其中所述⑶R序列包含以下序列組之一:SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQ ID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27，和其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述⑶R序列包含以下序列組之一:SEQ ID 5、6和7，SEQ ID 13、14和15，SEQ ID 21、22和23，5已0 ID 29、30 和 31。
[0101]本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 4、
12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO: 4、12、20或28具有至少96、97、98或99%同一性的序列。
[0103]本發(fā)明的一方面涉及抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。[0104]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中涉及抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO 8、16、24或32具有至少96、97、98或99%同一性的序列。
[0105]因此本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO:4,12,20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。
[0106]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO: 4具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 8具有至少96、97、98或99%同一性的序列。
[0107]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO: 12具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 16具有至少96、97、98或99%同一性的序列。
[0108]因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 20具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 24具有至少96、97、98或99%同一性的序列。
[0109]因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO:28具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 32具有至少96、97、98或99%同一性的序列。[0110]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ IDNO 39具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO 40具有至少96、97、98或99%同一性的序列。
[0111]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中是抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO 39確定和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO 40確定。
[0112]在抗體成熟期間，自發(fā)突變可發(fā)生在框架區(qū)中，如本文實(shí)施例6和7所述，將所分離的單克隆抗體中的一個(gè)的可變區(qū)與人抗體種系序列進(jìn)行比較，以對于重鏈和輕鏈兩者鑒定最近的人種系序列。為了使免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)最小化，因此決定進(jìn)ー步優(yōu)化抗體，即通過在框架區(qū)內(nèi)引入點(diǎn)突變以構(gòu)建在框架區(qū)內(nèi)具有人種系序列的抗體，正如實(shí)驗(yàn)中可見，這不影響抗體功能性。
[0113]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體，所述抗體由與上文所述的參考抗體的可變區(qū)的序列同一性來定義，其中所述抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)在框架區(qū)中包含ー個(gè)或多個(gè)突變。依據(jù)本發(fā)明，可能有吸引カ的是，引入一個(gè)或多個(gè)突變，以增加與最近的人種系序列的同一性，盡管也可考慮其它突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的突變是保守的突變。
[0114]通過Fe區(qū)定義的抗體
Fe區(qū)使抗體能夠活化免疫系統(tǒng)，抗體可經(jīng)工程改造以便在Fe區(qū)內(nèi)包含修飾，通常改變一種或多種其功能性質(zhì)，例如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、Fe-受體結(jié)合、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和/或抗原-依賴性細(xì)胞毒性，或缺乏它們。此外，本發(fā)明的抗體可經(jīng)化學(xué)修飾(例如可將ー個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分連接到抗體)或經(jīng)修飾以改變其糖基化，此外也改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)。
[0115]本發(fā)明的一方面涉及結(jié)合C5aR的抗體或本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)，其中Fe區(qū)具有針對ー個(gè)或多個(gè)Fe Y R的降低的或消除的結(jié)合親和力。[0116]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的結(jié)合C5aR、優(yōu)選人C5aR的抗體，或本文所述的由序列定義的抗體(參見下文)，其中Fe區(qū)具有針對ー個(gè)或多個(gè)Fe Y R的降低的結(jié)合親和力。
[0117]在一個(gè)實(shí)施方案中，與分別由SEQ ID NO 33、34、35和36定義的IgGl、IgG2、IgG2/4或IgG4 Fe參考序列相比，本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出針對ー個(gè)或多個(gè)Fe Y R的降低的結(jié)合親和力。因?yàn)樘囟ǖ陌被釟埢韶?fù)責(zé)Fe Y R相互作用和在本文中所考慮的作用，所以可能有利的是，應(yīng)用這樣的抗體，其中Fe區(qū)的所述特定氨基酸殘基已被不同的氨基酸取代。
[0118]在一個(gè)實(shí)施方案中，與分別由SEQ ID 33、34、35和36定義的IgGl、IgG2、IgG4/G2或IgG4 Fe參考序列相比,所述Fe區(qū)包括ー個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變,降低了針對ー個(gè)或多個(gè)Fe Y受體或補(bǔ)體成分的親和カ。
[0119]為了評(píng)價(jià)在Fe區(qū)內(nèi)引入點(diǎn)突變的結(jié)果，如實(shí)施例4所述，評(píng)價(jià)了一系列抗C5aR抗體的效應(yīng)子功能。建立了吞噬作用測定以測定Fe區(qū)在抗hC5aR抗體誘導(dǎo)人單核細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞(表達(dá)hC5aR)吞噬作用的能力中的作用?？蓮谋?看出，在所述測定中，若干Fe變體降低了抗C5aR抗體所誘導(dǎo)的吞噬作用水平。
[0120]在本發(fā)明抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體在體外不顯著誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用，意味著吞噬作用水平并未顯著超過背景，當(dāng)在抗C5aR抗體不存在時(shí)測定。在ー個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不產(chǎn)生對吞噬作用的任何可檢測的誘導(dǎo)。如實(shí)施例4所述，可使用人嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行用于評(píng)價(jià)吞噬作用水平的測定。
[0121 ] 在替代測定中，評(píng)價(jià)了抗hC5aR抗體誘導(dǎo)ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性)和⑶C(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)的能力。建立這些測定以測試Fe變體經(jīng)由ADCC或⑶C依賴性機(jī)制而介導(dǎo)細(xì)胞消耗的能力，并假定能夠模擬在體內(nèi)環(huán)境中的活性。
[0122]如實(shí)施例4所述，這些測定應(yīng)用表達(dá)hC5aR的細(xì)胞作為靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞(單核細(xì)胞-消耗的PMBC)或含有補(bǔ)體的血清，以引發(fā)反應(yīng)。
[0123]在本發(fā)明抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不顯著誘導(dǎo)ADCC，意味著ADCC水平并未顯著超過背景，當(dāng)在抗C5aR抗體不存在時(shí)測定。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述抗體不產(chǎn)生對ADCC的任何可檢測的誘導(dǎo)，也就是說ADCC水平并未超過背景。
[0124]在本發(fā)明抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不顯著誘導(dǎo)CDC。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不產(chǎn)生對CDC的任何可檢測的誘導(dǎo)，也就是說CDC水平并未超過背景。
[0125]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述序列已經(jīng)修飾以改變效應(yīng)細(xì)胞的ー種或多種功能?？赏ㄟ^在氨基酸序列內(nèi)的點(diǎn)突變而得到Fe序列的修飾。重鏈Fe區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG4或IgG2/4嵌合序列。參考序列在序列表中定義如下=IgGl由SEQ ID NO: 33 定義，IgG2 由 SEQ ID NO: 34 定義，IgG2/4 由 SEQ ID NO: 35 定義和 IgG4由 SEQ ID NO: 36 定義。
[0126]在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e區(qū)是 IgGl (SEQ ID NO: 33)、IgG2 (SEQ ID NO: 34)、IgG2/4 (SEQ ID NO: 35)或IgG4 (SEQ ID NO: 36)，其具有ー個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變:
a.E233P b.L234A 或 V234A 或 F234L 或 F234V
c.L235E 或 L235Ad.G236R 或 G236A
e.G237A
f.S239D
g.S254W
h.N297Q
1.L328R
j.A330S
k.P331S
1.1332E
Fe變體間的差異在于它們與Fe Y R或補(bǔ)體系統(tǒng)的成分相互作用的能力，如上所述。Fe區(qū)中的序列差異進(jìn)ー步影響了抗體的結(jié)構(gòu)和靈活性，這也可能影響抗體功能。如實(shí)施例5和表3所述，本發(fā)明人進(jìn)ー步證明了與具有IgG4型的Fe區(qū)的相應(yīng)抗體相比，抗hC5aR抗體(其中Fe區(qū)是IgGl型的，其具有或沒有額外的點(diǎn)突變)是hC5aR介導(dǎo)的作用的更強(qiáng)效的抑制劑。因此，本發(fā)明的 實(shí)施方案涉及本文定義的任何抗體，其具有IgGl同種型的Fe區(qū)或至少IgGl同種型的Fe鉸鏈區(qū)。
[0127]在一個(gè)實(shí)施方案中，與SEQ ID N0.33所定義的IgGl Fe參考序列相比，所述IgGlFe區(qū)包含1-10個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選的是Fe區(qū)包含較少突變，例如在AA 231-240中的1_8個(gè)氨基酸取代，或例如在AA 328-334中的1-5個(gè)氨基酸取代。氨基酸取代優(yōu)選在如上所述的體外降低抗體顯著誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用、ADCC和/或CDC的能力的取代中選擇。
[0128]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fe區(qū)是包含ー個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變的IgGl:
a)N297Q 和/或
b)L234A 和/或
c)L235E 或 L235A 和/或
d)G236R 或 G236A 和/或
e)G237A 和/或
f)L328R和/或
g)A330S 和/或
h)P331S。
[0129]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fe區(qū)是包含ー個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變組的IgGl:
a)N297Q 和/或
b)L234A 和 L235E 和/或
c)L234A 和 G236R 和/或
d)L235E 和 G236R 和/或
e)L234A、L235E 和 G236R 和/或
f)G236R 和 L328R 和/或
g)N297Q、L234A 和 L235E 和/或
h)N297Q、L234A、L235E 和 G236R 和/或
i)N297Q、L234A、L235E 和 G237A 和/或 j) L234A、L235E、G237A、A330S 和 P331S。[0130]k) N297Q、L234A、L235E、G237A、A330S 和 P331S。
[0131]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體Fe區(qū)是包含ー個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變組的IgGl:
a)N297Q 和/或
b)L234A 和 L235E 和/或
c)G236R 和 L328R 和/或
d)N297Q、L234A 和 L235E 和/或
e)N297Q、L234A、L235E 和 G237A和/或
f)L234A、L235E、G237A、A330S 和 P331S。
[0132]技術(shù)人員清楚，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)則，可引入重鏈和輕鏈的框架區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變，因?yàn)槿〈被釟埢诒景l(fā)明范圍內(nèi)。本文所述的功能性測定可用于證實(shí)這樣的突變不影響抗體的功能性。
[0133]由上文顯然的是，所鑒定的抗體的結(jié)合特異性由可變區(qū)或CDR提供，并且顯然，本發(fā)明包括具有類似抗原結(jié)合區(qū)的不同類型的抗體。
[0134]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是全長抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是抗體片段或單鏈抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在ー個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是人、小鼠、大鼠、兔、豬或非人類靈長類的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是小鼠抗體或人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是人源化抗體。正如本申請的定義部分所述，人源化抗體至少包括并非源自人種系序列的⑶R區(qū)。由上文還顯然的是，與種系序列相比，人抗體可包含ー個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，但通常認(rèn)為所述序列應(yīng)當(dāng)至少在框架區(qū)或Fe區(qū)內(nèi)與人種系序列具有至少95%同一性。
[0135]藥物制劑
本發(fā)明還包括藥物組合物/制劑，所述藥物組合物/制劑包含藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明的多肽或抗體，以及包含所述組合物的藥盒。
[0136]在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的抗體可以配制在藥物組合物中?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域的通用知識(shí)配制這樣的藥物組合物，所述知識(shí)例如參見藥典或Remington。
[0137]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含本文所述的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。所述制劑可以呈水性制劑或干制劑形式，在給藥之前將其在水或水性緩沖液組合物中重構(gòu)。
[0138]本發(fā)明的抗體的藥物組合物可包含鹽和/或緩沖劑，例如W02011/104381中所述的組合物。
[0139]在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的藥物組合物可適于多種用途，例如W02011/147921中所述的組合物。
[0140]治療方法
本發(fā)明的一方面涉及在受試者中治療或預(yù)防病癥的方法，所述方法包括給予有需要的受試者治療量的本文所述的抗體。正如先前的公開例如WO 2009/103113中所述，抗C5aR抗體可用干/適合于治療多種疾病和病癥。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及治療免疫性疾病或病癥、尤其是炎性疾病的方法。本文的實(shí)施例8進(jìn)ー步支持這一點(diǎn)，即通過在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中證明本發(fā)明的抗C5aR抗體的功能性。實(shí)施例9-11證明了在來自銀屑病性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎患者的組織樣品中C5aR的上調(diào)。這進(jìn)ー步證明了抗C5aR抗體可抑制來自銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者的滑液所誘導(dǎo)的PMN的細(xì)胞遷移。
[0141]治療方法可g在治愈疾病或病癥，但對于包括免疫性和炎性疾病例如慢性疾病或病癥在內(nèi)的某些疾病，緩解ー種或多種癥狀也認(rèn)為是治療，其對于受試者可以是顯著的改善，甚至只要達(dá)到部分癥狀緩解或者作用僅是暫時(shí)的或部分的。 [0142]本發(fā)明的方法包括治療ー種或多種疾病，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’ s disease)、炎性腸病(IBD)、克羅恩病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、腸易激綜合征、多發(fā)性硬化(MS)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠狀動(dòng)脈病、慢性阻塞性肺病(COPD)、間質(zhì)性肺病、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化病、骨關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、移植物抗宿主病、斯耶格倫綜合征(Sjogren’ s syndrome)、自身免疫性腎炎、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’ s syndrome)、慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病、ANCA-相關(guān)的脈管炎、葡萄膜炎、硬皮病、大庖性類天皰瘡、阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s Chorea)、囊性纖維化、痛風(fēng)、年齡相關(guān)性黃斑變性、變態(tài)反應(yīng)、哮喘和急慢性炎癥所致的其它自身免疫性疾病。在一個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述疾病或病癥是急性或慢性炎癥，其中所述病癥可以是自身免疫性疾病。在ー個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、炎性腸病(IBD)包括克羅恩病(CD)或潰瘍性結(jié)腸炎(UC)或腸易激綜合征。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述病癥是RA或SLE。除了慢性疾病之外，抗C5aR抗體可能與例如以下急性指征有關(guān):移植、局部缺血/再灌注損傷(例如急性心肌梗塞、中風(fēng))、膿毒病(例如SIRS、MODS、ALI)、動(dòng)脈粥樣硬化和腦內(nèi)出血(ICH)。
[0143]另ー方面，本發(fā)明涉及用于治療疾病或病癥的本文所述的抗體、分離的抗體或抗體組合物。在進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，所述抗體、分離的抗體或抗體組合物用于治療本文在以上對于治療方法所述的ー種或多種疾病和病癥。
[0144]本發(fā)明的一方面涉及本文所述的抗體、分離的抗體或抗體組合物在制備用于治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述疾病或病癥可以是如同本文在以上對于治療方法所述的。
[0145]給藥方式
本發(fā)明的抗體可經(jīng)胃腸外、例如靜脈內(nèi)、例如肌內(nèi)、例如皮下給予?；蛘?，本發(fā)明的抗體可以經(jīng)由非胃腸外途徑例如經(jīng)ロ或局部給予。本發(fā)明的抗體可以預(yù)防性地給予。在ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下給予。
[0146]給藥劑量和時(shí)間安排將很可能取決于多種因素，包括所涉及的疾病/病癥或癥狀以及目的受試者。通常，預(yù)期給予所述抗體的劑量為0.010 mg/kg至4-6 mg/kg。同樣，所述抗體的劑量方案也將取決于各受試者和所述受試者的疾病狀態(tài)，但合乎需要的是，按照本發(fā)明采用一種治療，其中將所述抗體(或抗體組合物)每周一次或每兩周一次或甚至以更低的間隔，例如毎月一次給予受試者。
[0147]本發(fā)明的抗體可以按需要而給予，也就是說所述抗體可根據(jù)患者的體驗(yàn)而給予，例如當(dāng)特定癥狀出現(xiàn)或當(dāng)特定生物標(biāo)記的量達(dá)到預(yù)定水平吋。
[0148]具體的聯(lián)合治療
本發(fā)明的抗體可與一種或更多種其它治療藥劑或制劑聯(lián)合給予。其它藥劑可以是增強(qiáng)本發(fā)明的抗體的效果的藥劑。其它藥劑可以是預(yù)期用于治療患者的其它癥狀或病況。例如，其它藥劑可以是鎮(zhèn)痛藥、免疫抑制劑或抗炎藥。其它藥劑可以是另一種單克隆抗體，例如國際專利申請W0 2008/022390和W0 2009/103113中所述的那些中的一種。
[0149]可以多種不同方式實(shí)現(xiàn)兩種或更多種藥劑的聯(lián)合用藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體和其它藥劑可以在單個(gè)組合物中一起給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體和其它藥劑可以在作為聯(lián)合治療的組成部分的單獨(dú)組合物中給予。例如，調(diào)節(jié)劑可以在給予其它藥劑之前、之后或同時(shí)給予。
[0150]本發(fā)明的抗體可與其它藥物(例如甲氨蝶呤、地塞米松和潑尼松)和/或其它生物藥物聯(lián)合給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明，抗體可以與一種或多種選自ATC codeMO 1C類的抗風(fēng)濕藥和ATC code L04的免疫抑制劑(描述于W0 2009/103113)的治療藥劑聯(lián)合給予，所述治療藥劑包括但不限于硫唑嘌呤、氯喹、羥氯喹、環(huán)孢菌素、D-青霉胺、金鹽(金硫基蘋果酸鈉、金諾芬(auranofm))、來氟米特、甲氨蝶呤、二甲胺四環(huán)素、柳氮磺胺吡啶和環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)類固醇、麥考酚酸或麥考酚酯和他克莫司，和在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案中，一種或多種輕氯喹(Plaquenil)、柳氮磺胺吡唳(Azulfidine)和甲氨蝶呤、地塞米松和/或潑尼松。
[0151]在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的抗體也可與其它抗體聯(lián)用(例如與結(jié)合趨化因子受體(包括但不限于CCR2和CCR3)的抗體聯(lián)用，或與抗TNF或其它抗炎藥或與現(xiàn)有的血漿制品(例如用于預(yù)防性或治療性治療的市售的丙種球蛋白和免疫球蛋白)聯(lián)用。本發(fā)明的抗體也可用作單獨(dú)給予的組合物，與抗生素和/或抗微生物藥聯(lián)合給予。
[0152]抗體可以與藥劑例如已經(jīng)用于自身免疫的藥劑聯(lián)合給予，所述藥劑包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑，例如 IFN-beta、Orencia ? (CTLA4_Ig)、Humira ? (抗 TNF)、Cimzia ? (抗TNF>PEG Fab) >Tysabri ? (a4_ 整聯(lián)蛋白 mAb)、Simponi ?、Rituxan/MabThera ?、Actemra/RoActemra ?、Kineret ?、Raptiva、Ustekimumab、非留體抗炎藥(NSAID)例如 Asprin ?、Ibuprofen "*等，皮質(zhì)類固醇、疾病修飾性抗風(fēng)濕藥(DMARD)例如Plaquenil ? (輕氯喹)、Azulfidine? (柳氮橫胺吡唳)、Methotrexate ? (甲氨蝶呤)等、Copaxone? (glatirimeracetate)、Gilneya? (芬戈莫德)，抗生素例如Flagyl ?、Cipro ?、局部(皮膚施用的)藥物包括局部皮質(zhì)類固醇、維生素D類似物乳膏(Dovonex ?)、局部類視色素(Tazorac ?)、潤濕劑、局部免疫調(diào)節(jié)劑(他克莫司和吡美莫司)、煤焦油、地蒽酚等等，此外，還有光療例如PUVA、UVB和CellC印t? (麥考酚酸嗎乙酯)可以與采用本發(fā)明抗體的治療聯(lián)合。
[0153]可以是待治療受試者已經(jīng)接受一種或多種其它藥物治療(在可將本發(fā)明的抗體加入到所述治療方案中的情況下)。
[0154]抗體制備的方法
可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備抗體，主要依賴于雜交瘤克隆用于產(chǎn)生抗體，或者在重組宿主中表達(dá)抗體，其中 后者描述于W02010/000864。根據(jù)本領(lǐng)域的知識(shí)，可以構(gòu)建編碼所需抗體鏈的核苷酸序列并用于抗體的重組表達(dá)，其中可從一條或兩條多核苷酸表達(dá)重鏈和輕鏈。
[0155]本發(fā)明在另一方面涉及一個(gè)或多個(gè)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本文所述的抗體的抗體鏈的多肽序列。
[0156]一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及包含一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本文所述的抗體的抗體鏈的多肽序列。
[0157]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括在支持抗體鏈的一個(gè)或多個(gè)多肽序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞。所述方法可以進(jìn)一步包括抗體鏈由在一個(gè)毗鄰的多核苷酸上的兩個(gè)單獨(dú)的可讀框編碼和任選地從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。
[0158]本發(fā)明可由以下實(shí)施方案來描述，但并非將本發(fā)明限制于此。
[0159]實(shí)施方案
1.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 1或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 2或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 3或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。 [0160]2.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 1、2和3或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0161]3.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 1、2和3相同。
[0162]4.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 5或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 6或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 7或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。
[0163]5.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 5、6和7或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0164]6.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 5、6和7相同。
[0165]7.抗體，其中重鏈可變區(qū)如實(shí)施方案1、2或3中的任一個(gè)所定義和其中輕鏈可變區(qū)如實(shí)施方案4、5或6中的任一個(gè)所定義。
[0166]8.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 9或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 10或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 11或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。[0167]9.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 9、10和11或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0168]10.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 9、10和11相同。
[0169]11.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 13或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 14或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 15或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。
[0170]12.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 13,14和15或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0171]13.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 13、14 和15相同。
[0172]14.抗體，其中重鏈可變區(qū)如實(shí)施方案8、9或10中的任一個(gè)所定義和其中輕鏈可變區(qū)如實(shí)施方案11、12或13中的任一個(gè)所定義。
[0173]15.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 17或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 18或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 19或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。
[0174]16.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 17,18和19或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0175]17.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 17、18和19相同。
[0176]18.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 21或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 22或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 23或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。
[0177]19.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 21、22和23或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0178]20.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 21、22和23相同。
[0179]21.抗體，其中重鏈可變區(qū)如實(shí)施方案15、16或17中的任一個(gè)所定義和其中輕鏈可變區(qū)如實(shí)施方案18、19或20中的任一個(gè)所定義。
[0180]22.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 25或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 26或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 27或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。
[0181]23.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 25、26和27或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0182]24.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 25、26和27相同。
[0183]25.抗體，其中所 述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，
其中所述⑶R1序列包含SEQ ID 29或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 30或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或
其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 31或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。
[0184]26.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列包含SEQ ID 29,30和31或所述序列的變體，其中1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸殘基取代。
[0185]27.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1XDR2和⑶R3序列，其中所述⑶R序列與SEQ ID 29、30和31相同。
[0186]28.抗體，其中重鏈可變區(qū)如實(shí)施方案22、23或24中的任一個(gè)所定義和其中輕鏈可變區(qū)如實(shí)施方案25、26或27中的任一個(gè)所定義。
[0187]29.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列。
[0188]30.實(shí)施方案29的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)在框架區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)突變。
[0189]31.實(shí)施方案29的抗體，其中所述突變是保守的突變。
[0190]32.實(shí)施方案29的抗體，其中所述突變增加與最近的人種系序列的同一性。
[0191]33.實(shí)施方案32的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO 39確定。[0192]34.抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。
[0193]35.實(shí)施方案34的抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)在框架區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)突變。
[0194]36.實(shí)施方案35的抗體，其中所述突變是保守的突變。
[0195]37.實(shí)施方案35的抗體，其中所述突變增加與最近的人種系序列的同一性。
[0196]38.實(shí)施方案34的抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO 40確定。
[0197]39.抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列和其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。
[0198]40.實(shí)施方案39的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)的序列與SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少96%，例如97%，例如98%或例如99%同一性和其中所述輕鏈可變區(qū)的序列與SEQID NO: 8、16、24或32具有至少96%,例如97%,例如98%或例如99%同一性。
[0199]41.實(shí)施方案39或40的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)在框架區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)突變和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)在框架區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)突變。
[0200]42.實(shí)施方案41的抗體，其中所述突變是保守的突變。
[0201]43.實(shí)施方案41的抗體，其中所述突變增加與最近的人種系序列的同一性。
[0202]44.實(shí)施方案41的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID NO 39確定和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)由SEQ ID NO 40確定。
[0203]45.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體結(jié)合C5aR。
[0204]46.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是全長抗體或抗體片段或單鏈抗體。
[0205]47.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
[0206]48.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是人、小鼠、大鼠、兔、豬或非人類靈長類的抗體。
[0207]49.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是小鼠抗體或人抗體。
[0208]50.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。
[0209]51.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是人抗體。
[0210]52.結(jié)合C5aR的人抗體。
[0211]53.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體結(jié)合人C5aR。
[0212]54.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體結(jié)合C5aR的第二胞外環(huán)。
[0213]55.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體結(jié)合人C5aR的第二胞外環(huán)。
[0214]56.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體結(jié)合人C5aR，而非鼠C5aR。
[0215]57.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體結(jié)合人C5aR的第二胞外環(huán)、而非鼠C5aR的第二胞外環(huán)。
[0216]58.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體僅結(jié)合天然構(gòu)象的人C5aR的第二胞外環(huán)。
[0217]59.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體顯著抑制或降低C5a與人C5aR
的結(jié)合。[0218]60.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在SPA測定中能夠取代C5a，其IC50低于10 nM或低于5 nM或優(yōu)選地低于3 nM。
[0219]61.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在體外顯著抑制嗜中性粒細(xì)胞的遷移。
[0220]62.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中與在10nM C5a和無抗體存在下30分鐘后觀察到的遷移水平相比，當(dāng)在10 nM C5a存在下30分鐘后測定，所述抗體減少遷移至小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于15%或小于10%，或其中在相同設(shè)置下IC50低于2.5 Pg/ml，例如低于2.5 Pg/ml，例如低于1.5 Pg/ml，例如低于1.2 Pg/ml或甚至低于1.0Kg/ml。
[0221]63.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中當(dāng)通過對嗜中性粒細(xì)胞的競爭配體結(jié)合測定而測定的所述抗體的親和力低于0.80 nM，例如低于0.50 nM或0.35 nM。
[0222]64.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在離體中和C5a誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞活化，且在鈣流量測定中測定的IC50低于7.0 Pg/ml，例如低于5.0 Pg/ml，例如低于 2.5 M-g/ml。
[0223]65.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在離體抑制C5a誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞成熟，且
a.在⑶lib上調(diào)測定中測 定的IC50低于3.5 Pg/ml，例如低于2.5 Pg/ml，例如低于1.5 Pg/ml或甚至低于1.0 Pg/m或
b.在CD62L下調(diào)測定中測定的IC50低于1.8 Pg/ml，例如低于1.5 Pg/ml，例如低于1.2 Pg/ml 或甚至低于 1.0 Pg/ml。
[0224]66.結(jié)合C5aR的抗體，其中與分別由SEQ ID 33、34、35和36定義的IgGl、IgG2、IgG4或IgG4/G2 Fc參考序列相比，F(xiàn)c區(qū)具有與一個(gè)或多個(gè)Fc y受體的減少的親和力/降低的結(jié)合。
[0225]67.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中與分別由SEQ ID 33、34、35和36定義的IgGl、IgG2、IgG4或IgG4/G2 Fc參考序列相比，F(xiàn)c區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，降低了針對一個(gè)或多個(gè)Fcy受體的親和力。
[0226]68.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在體外不顯著誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用。
[0227]69.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在體外不顯著誘導(dǎo)ADCC。
[0228]70.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體在體外不顯著誘導(dǎo)CDC。
[0229]71.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中Fc區(qū)是IgGl (SEQ ID NO: 33)、IgG2(SEQ ID NO: 34)、IgG2/4 (SEQ ID NO: 35)或 IgG4 (SEQ ID NO: 36)，其具有一個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變:
a.E233P
b.L234A 或 V234A 或 F234L 或 F234V
c.L235E 或 L235A
d.G236R 或 G236A
e.G237A
f.N297Qg.L328R
h.A330S
1.P331S。
[0230]72.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中Fc區(qū)是IgGl或IgGl突變體。
[0231]73.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中與SEQ ID N0.33中所定義的IgGl Fc參考相比，F(xiàn)c區(qū)是包含1-10個(gè)氨基酸取代的IgGl Fc突變體。 [0232]74.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中Fc區(qū)是包含在AA 231-240中的1_8個(gè)氨基酸取代的IgGl Fc突變體，其中IgGl Fc參考序列如SEQ ID N0.33中所定義。
[0233]75.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中Fc區(qū)是包含在AA 328-334中的1_5個(gè)氨基酸取代的IgGl Fc突變體，其中IgGl Fc參考序列如SEQ ID N0.33中所定義。
[0234]76.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中抗體Fc區(qū)是IgGl，其具有一個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變組:
a.N297Q 和 / 或
b.L234A 和 L235E 和 / 或
c.G236R 和 L328R 和 / 或
d.N297Q、L234A 和 L235E 和 / 或
e.N297Q、L234A、L235E 和 G237A 和 / 或
f.L234A、L235E、G237A、A330S 和 P331S。
[0235]77.前述實(shí)施方案52-76中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是全長抗體或抗體片段或單鏈抗體。
[0236]78.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
[0237]79.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是人、小鼠、大鼠、兔、豬或非人類靈長類的抗體。
[0238]80.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是小鼠抗體或人抗體。
[0239]81.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是人抗體或人源化抗體。
[0240]82.前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體是人抗體。
[0241]83.用于治療免疫性疾病或病癥的前述實(shí)施方案中任一個(gè)的抗體。
[0242]84.實(shí)施方案83的抗體，其中所述病癥是炎性疾病。
[0243]85.實(shí)施方案83的抗體，其中所述病癥是急性或慢性炎癥。
[0244]86.實(shí)施方案83的抗體，其中所述病癥是自身免疫性疾病。
[0245]87.實(shí)施方案83-86中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下給予。
[0246]88.前述實(shí)施方案83-87中任一個(gè)的抗體，其中給予所述抗體的劑量為0.010 mg/kg 直至 6 mg/kg。
[0247]89.前述實(shí)施方案83-88中任一個(gè)的抗體，其中每周一次或每兩周一次給予所述抗體。
[0248]90.前述實(shí)施方案83-89中任一個(gè)的抗體，其中所述抗體與其它藥物聯(lián)合給予。
[0249]91.前述實(shí)施方案83-90中任一個(gè)的抗體，其中所述疾病或病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、炎性腸病(IBD)、克羅恩病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)或腸易激綜合征。[0250]92.前述實(shí)施方案83-91中任一個(gè)的抗體，其中所述患者正用其它藥物例如甲氨蝶呤治療。
[0251]93.在受試者中治療或預(yù)防病癥的方法，所述方法包括給予有需要的受試者治療量的實(shí)施方案1-82中任一個(gè)的抗體。
[0252]94.實(shí)施方案93的方法，其中所述病癥是免疫性疾病或病癥。
[0253]95.實(shí)施方案93或94的方法，其中所述抗體經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下給予。
[0254]96.實(shí)施方案93-95中任一項(xiàng)的方法，其中給予所述抗體的劑量為0.010 mg/kg直至 6 mg/kgο
[0255]97.實(shí)施方案93-96中任一項(xiàng)的方法，其中每周一次或每兩周一次給予所述抗體。
[0256]98.實(shí)施方案93-97中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體與至少一種其它藥物聯(lián)合給予。
[0257]99.實(shí)施方案93-98中任一項(xiàng)的方法，其中所述病癥是免疫病理性病癥例如自身免疫性疾病。
[0258]100.實(shí)施方案93-99中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是罹患以下疾病的患者:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、炎性腸病(IBD)、克羅恩病(CD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)或腸易激綜合征。
[0259]101.實(shí)施方案93 -101中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者正用其它藥物治療。
[0260]102.藥物組合物，所述藥物組合物包含實(shí)施方案1-82中任一個(gè)的抗體以及任選的藥學(xué)上可接受的載體。
[0261]103.實(shí)施方案102的藥物組合物，所述藥物組合物呈水性制劑或干制劑形式，在給藥之前將其在水/水性緩沖液中重構(gòu)。
[0262]104.分離的多核苷酸,所述多核苷酸編碼實(shí)施方案1-82中任一個(gè)的抗體的多肽序列。
[0263]105.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含實(shí)施方案104的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。
[0264]106.生產(chǎn)實(shí)施方案1-82中任一個(gè)的抗體的方法，所述方法包括在支持所述抗體的一個(gè)或多個(gè)多肽序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)實(shí)施方案105的宿主細(xì)胞。
[0265]107.實(shí)施方案106的方法，其中所述重鏈和輕鏈由在一個(gè)毗鄰的多核苷酸上的兩個(gè)單獨(dú)的可讀框編碼。
[0266]108.實(shí)施方案106或107的方法，所述方法進(jìn)一步包括從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述抗體。
[0267]109.實(shí)施方案1-82中任一個(gè)的抗體在制備藥物中的用途。
[0268]110.實(shí)施方案1-82中任一個(gè)的抗體在制備用于治療以下免疫性疾病或病癥的藥物中的用途:例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、炎性腸病(IBD)或腸易激綜合征。
實(shí)施例
[0269]實(shí)施例1:人抗hC5aR抗體的產(chǎn)生 免疫和篩選
一般而言，產(chǎn)生針對GPCR的抗體是困難的，因?yàn)榫哂姓_天然蛋白構(gòu)象的可溶性蛋白是非常難以生產(chǎn)(如果不可能)。傳統(tǒng)地，過量表達(dá)GPCR的細(xì)胞已經(jīng)用于免疫，但是所導(dǎo)致的抗體反應(yīng)卻趨向于非常不特異，這使得難以鑒定具有所需特性即能夠阻斷配體結(jié)合和GPCR信號(hào)傳導(dǎo))的抗體。的確，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)開發(fā)可阻斷C5a與C5aR結(jié)合的人抗hC5aR抗體是非常具有挑戰(zhàn)性的，并且在鑒定這些抗體之前應(yīng)用多種免疫策略。
[0270]HumAb小鼠(Medarex)用具有高表達(dá)人C5aR (約80，000拷貝/細(xì)胞)的L1.2_小鼠細(xì)胞(小鼠B細(xì)胞淋巴瘤系)免疫(Lee等人Nat.Biotechnol, 2006 ; 10:1279-1284)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)程序，將來自免疫小鼠的脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合。因?yàn)槿狈扇苄詇C5aR，所以不能在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定中篩選上清液，因此建立了基于細(xì)胞的結(jié)合測定。通過W02008/022390中所述的FACS分析，測試所得雜交瘤上清液與穩(wěn)定表達(dá)高數(shù)量(約1，000, 000拷貝/細(xì)胞)天然hC5aR的經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠細(xì)胞系(RBL)的結(jié)合。通常，將雜交瘤上清液與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(用CellTracker標(biāo)記)和hC5aR-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、或來自hC5aR敲出/敲入(Κ0ΚΙ)小鼠的嗜中性粒細(xì)胞的混合物一起孵育(W0 2005/060739)，并與APC-綴合的F(ab’) 2山羊抗人IgG (IgG-APC) 一起孵育。鑒定與hC5aR-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、而非未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合的上清液，然后將產(chǎn)生抗hC5aR的雜交瘤亞克隆并測試與人嗜中性粒細(xì)胞和分離自Κ0ΚΙ小鼠的骨髓衍生的嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。使用蛋白A瓊脂糖和標(biāo)準(zhǔn)方案，從雜交瘤上清液中純化抗hC5aR抗體。
[0271]實(shí)施例2:抗hC5aR抗體的鑒定和表征
如所述的，獲取人抗hC5aR抗體的方法是有問題的，在鑒定hC5a/hC5aR阻斷的抗體之前，必須進(jìn)行32次融合。從35次融合和超過100，000個(gè)雜交瘤上清液的篩選中，僅鑒定出11個(gè)可阻斷hC5a與hC5aR結(jié)合的克隆。用于表征抗體的測定描述如下。參考抗體(Ref.Ab Q)描述于W02009/103113。另外，適于在鈣流量測定中和在⑶lib上調(diào)中測定親和力和功能性的進(jìn)一步測定描述于實(shí)施例7。
[0272]取代測定
應(yīng)用閃爍接近測定(Scint illation Proximity Assay, SPA),以便測定抗hC5aR抗體取代hC5a與hC5aR的結(jié)合的效能。SPA的詳述在美國專利4568649和制造商(AmershamBiosciences)給出的方案中提供。簡而言之，純化自RBL_hC5aR細(xì)胞的攜帶受體的膜片段結(jié)合到包被有麥胚凝集素(WGA)的閃爍微顆粒。加入放射標(biāo)記的hC5a (1251)示蹤物之后，與受體的結(jié)合將導(dǎo)致從顆粒發(fā)射光。特別對于SPA原理，僅彼此直接接近的放射性同位素和顆粒將發(fā)射光。即只有與受體結(jié)合的放射標(biāo)記的hC5a與WGA-顆粒足夠接近，以產(chǎn)生光。因此，所發(fā)射的光量表示結(jié)合受體的125I_hC5a的量。該測定是競爭測定，其中抗hC5aR/未標(biāo)記的hC5a與示蹤物競爭性結(jié)合到受體。在該測定中，將固定量的1251_標(biāo)記的C5a加入到WGA-顆粒和C5aR受體，導(dǎo)致一定量的光發(fā)射，測定為每分鐘的計(jì)數(shù)(cpm)。如果加入未標(biāo)記的C5a或抗C5aR，其與受體的結(jié)合將導(dǎo)致較低的cpm，因?yàn)?25I C5a的取代。％取代計(jì)算如下:


S0...S mux
S:樣品
sfflax:非特異性結(jié)合。通過添加足以替代特異性結(jié)合的1251-hC5a的量的未標(biāo)記的hC5a而測定。[0273]S0:最大結(jié)合。不加入未標(biāo)記的hC5a。
[0274]IC50值定義為取代50% C5a的濃度。在實(shí)驗(yàn)之間cpm保持恒定，IC50值相當(dāng)于示蹤物隨時(shí)間的衰減。測定人抗hC5aR抗體取代1251-hC5a的效能(IC50)，數(shù)據(jù)在表1中提供。
[0275]嗜中性粒細(xì)胞遷移(趨化作用)測定
在Boyden室中分析了抗體抑制hC5a (或mC5a)-依賴性嗜中性粒細(xì)胞遷移的效能。分離自人或動(dòng)物血的嗜中性粒細(xì)胞用鈣黃綠素染色并加入到Boyden室的上區(qū)室并與抗體混合。將hC5a或mC5a施加到Boyden室的下區(qū)室并作為嗜中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘物起作用。通過對通過3或5 μ m fIuoroblok膜的鈣黃綠素染色的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù),測定嗜中性粒細(xì)胞遷移到下室的能力。
[0276]人PMN (多形核白細(xì)胞；粒細(xì)胞)得自抽入含有EDTA的小管中的人血樣品。通過在室溫下使血(4份)通過Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care)梯度(3份)離心30分鐘(400 X g)，分離血細(xì)胞。將含PMN的層懸浮于含有葡聚糖-500 (Sigma)的PBS (磷酸緩沖鹽水)I小時(shí)，以除去污染的紅細(xì)胞。將上清液在室溫下離心5分鐘(250 X g),然后使用0.2% NaCl，使剩余紅細(xì)胞經(jīng)滲透性裂解55秒。通過1.2% NaCl + PBS使溶液等滲并在250X g離心5分鐘，然后重復(fù)滲透性裂解。離心后，將PMN重懸于反應(yīng)混合物(RM): HBSS (目錄號(hào) 14175 Gibco)，其含有 NaCl 137mM, KCl 5.3mM, Na2HPO4 0.33mM, NaHCO3 4mM, KH2PO4
0.44mM,葡萄糖 5mM ;補(bǔ)充有 MgSO4*7H20 0.4mM, MgCl2, 0.5mM, CaCl2 0.5mM, HEPES20mM。通過NucleoCounter (Chemometec)測定細(xì)胞密度。通過顯微術(shù)評(píng)價(jià)吉姆薩-染色的樣品，PMN懸液含有>95%嗜中性粒細(xì)胞。
[0277]裝載PMN:鈣黃綠素，AM，(Fluka)溶于DMSO (二甲亞砜)并用含有細(xì)胞(2xl06細(xì)胞/ml)的RM稀釋1000X，得到10 μΜ濃度。將懸液在37° C溫箱中孵育30分鐘，然后用RM洗滌3次以除去過量鈣黃綠素。最后將細(xì)胞重懸于RM (4χ106細(xì)胞/ml)。
[0278]通過Boyden室技術(shù),使用FluoroBlok? 3 μ m孔徑大小96-孔(目錄號(hào)351161.BDFalcon (VWR))評(píng)價(jià)遷移。含有Fluoroblok膜的上室即插入物用在lmg/ml PBS中的人纖維蛋白原(目錄號(hào)F3879-1G，Sigma)在37° C包被2小時(shí)。洗滌后，所述膜用含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封閉。用RM再次洗滌后，將IO5鈣黃綠素-裝載的PMN (有或無hC5aR-抗體)加入到各孔并放入含有對照溶液或化學(xué)引誘物hC5a (Sigma, C5788)的接收板(下室)。每組包括至少6孔。然后,在讀板器(SpectraMax, Molecular devices或 Fluoroscan, Thermo Labsystems.)中，在 485/538nm 處,在 37。C,每 5 分鐘測定板，達(dá)60分鐘。在30分鐘時(shí)的值(以相對熒光單位計(jì))用作遷移的度量。
[0279]曲線擬合。抗體抑制遷移的能力使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software,Inc.)測定，表示為IC50。
[0280]表1包括來自取代測定和趨化測定的數(shù)據(jù)，所述測定測試了 10μ g/ml人mAb抑制人嗜中性粒細(xì)胞的hC5a-依賴性(IOnM)遷移的能力。將抗體不存在時(shí)所得的值設(shè)置為100。從3個(gè)供體匯集數(shù)據(jù)。平均值包括在表1中。3種mAb 32F3A6、35F12A2和35F32A3在這兩種測定中都顯示最強(qiáng)效能，其等于或略高于對照抗體Ref的效能。Ab是W02009/103113中所述的Q。
【權(quán)利要求】
1.結(jié)合C5aR的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列， 其中所述⑶Rl序列包含SEQ ID 1、9、17或25或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的任何所述序列和/或 其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 2、10、18或26或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的任何所述序列和/或 其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 3、11、19或27或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的任何所述序列。
2.結(jié)合C5aR的抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列， 其中所述⑶Rl序列包含SEQ ID 5、13、21或29或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的任何所述序列和/或 其中所述⑶R2序列包含SEQ ID 6、14、22或30或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的任何所述序列和/或 其中所述⑶R3序列包含SEQ ID 7、15、23或31或者具有1、2或3個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的任何所述序列。
3.權(quán)利要求1或2中任ー項(xiàng)的抗體，其中所述抗體選自: a.抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQID 1、2和3或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中輕鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 5、6和7或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入 b.抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQID 9、10和11或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中輕鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 13、14和15或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列， c.抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQID 17、18和19或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中輕鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 21、22和23或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列， d.抗體，其中重鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQID 25、26和27或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中輕鏈可變區(qū)的⑶R包含SEQ ID 29,30和31或者具有I個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。
4.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體,其中所述抗體的重鏈可變區(qū)包含與SEQID NO: 4、12,20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列和/或其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO: 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同ー性的序列。
5.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是人抗體。
6.結(jié)合C5aR的第二胞外環(huán)的人抗體。
7.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中所述抗體結(jié)合人C5aR和優(yōu)選地結(jié)合人C5aR的第二胞外環(huán)。
8.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中當(dāng)通過對嗜中性粒細(xì)胞的競爭配體結(jié)合測定而測定時(shí)所述抗體的親和カ低于0.80 nM。
9.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中所述抗體顯著抑制或降低C5a與C5aR的結(jié)合。
10.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中所述抗體在體外顯著抑制人嗜中性粒細(xì)胞的遷移。
11.結(jié)合人C5aR的抗體，其中與分別由SEQID 33、34、35和36定義的IgGl、IgG2、IgG4或IgG4/G2 Fe參考序列相比，F(xiàn)e區(qū)具有與ー個(gè)或多個(gè)Fe y受體的降低的結(jié)合親和力。
12.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中所述抗體在體外不顯著誘導(dǎo)ADCC、CDC和/或嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用。
13.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其中Fe區(qū)是IgGl(SEQ ID NO: 33)、IgG2 (SEQID NO: 34), IgG2/4 (SEQ ID NO: 35)或 IgG4 (SEQ ID NO: 36)，其具有ー個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)突變:
a.E233P
b.L234A 或 V234A 或 F234L 或 F234V
c.L235E 或 L235A
d.G236R 或 G236A
e.G237A
f.N297Q
g.L328R
h.A330S
1.P331S。
14.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其用于治療。
15.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的抗體，其用于治療免疫性疾病或病癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡性腎炎、炎性腸病(IBD)或腸易激綜合征。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK103596982SQ201280028064
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月6日
【發(fā)明者】S.扎恩, L.H.澤尤特恩, A.J.漢森, K.克杰加亞爾德, S.倫德 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司