專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)癌癥的寡糖分布法的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求提交于2004年6月22日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/582,250的優(yōu)選權(quán)，將其全文納入本文作為參考。
關(guān)于在聯(lián)邦政府贊助的研究和開(kāi)發(fā)中完成的發(fā)明的權(quán)屬聲明本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的第R01-GM049077號(hào)基金(或合同)的政府資助下完成的。政府對(duì)本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
卵巢癌在美國(guó)是第五大致死性癌癥，它是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。根據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)的報(bào)道(2002)，美國(guó)將約有23,300名婦女被診斷患有卵巢癌，而13,900名將死于該疾病。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)卵巢腫瘤細(xì)胞的類(lèi)型對(duì)卵巢腫瘤進(jìn)行了分類(lèi)，其種類(lèi)包括例如上皮細(xì)胞瘤、生殖細(xì)胞瘤、間質(zhì)細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤。上皮細(xì)胞瘤是最為常見(jiàn)的類(lèi)型，在卵巢表面上典型地長(zhǎng)有異常團(tuán)塊。間質(zhì)細(xì)胞瘤和生殖細(xì)胞瘤通常較少見(jiàn)。
卵巢癌常被稱(chēng)為″無(wú)癥狀殺傷者″，這是因?yàn)樗鼪](méi)有明顯的早期癥狀。事實(shí)上，只有在卵巢癌已擴(kuò)散到卵巢以外之后才會(huì)顯現(xiàn)出卵巢癌的特異性癥狀。及早檢測(cè)出的卵巢癌是很容易治療的，因此早期診斷非常重要。例如，如果在擴(kuò)散到卵巢以外之前檢測(cè)出卵巢癌，則95％的婦女將能存活5年以上；然而，如果在晚期才診斷出的話(huà)，僅28％的婦女能存活5年以上。
鑒別生物標(biāo)記以診斷和治療癌癥的最新進(jìn)展主要集中在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究上。例如，已通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)或基因表達(dá)分析鑒別了諸如骨橋蛋白、periostin和HE7(WFDC2)的蛋白質(zhì)，已表明它們是卵巢癌的潛在診斷標(biāo)記(Kim等，JAMA，2871671-1679(2002)；Hellstrom等，Cancer Res.，633695-3700(2003)；Gillan等，Cancer Res.，625358-5364(2002))。然而，它們作為癌癥診斷標(biāo)記的效用尚未知。
粘蛋白是由各種類(lèi)型的上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)(Van den Steen等，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，33151-208(1998))。上皮細(xì)胞在組織/器官的外壁上表達(dá)，并參與細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，它常作為組織與其環(huán)境間的界面。粘蛋白是由正常分泌型上皮細(xì)胞分泌的，其在保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞存活中起著重要的作用(Hanisch，Biol.Chem.，382143-149(2001))。粘蛋白的特征通常為具有高水平糖基化的大的糖蛋白。寡糖(主要是O-連接或粘蛋白型寡糖)構(gòu)成了粘蛋白質(zhì)量的大部分(Van den Steen等，id)。
長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為粘蛋白與癌癥的發(fā)病機(jī)理有聯(lián)系(Hollingsworth等，Nat.Rev.Cancer，445-60(2004))。大多數(shù)類(lèi)型的腺癌(即上皮細(xì)胞癌)常伴有高水平的粘蛋白產(chǎn)生(Hollingsworth等，同前)。例如，卵巢癌中的粘蛋白(如MUC1和CA 125(MUC 16))上升(Stimpfl等，Cancer Lett.，145133-141(1999))。發(fā)現(xiàn)MUC 1通常與乳腺癌相關(guān)(Hanisch等，Eur.J.BioChem.，236；318-327(1996)；Lloyd等，J.Biol.Chem.，27133325-33334(1996)；Croce等，Br.Cancer Res.Treatment，81195-207(2003))。已將CA 125(MUC 16)常規(guī)作為卵巢癌癥標(biāo)記用于臨床中，并被評(píng)價(jià)為有效用于卵巢癌患者監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)的生化工具(Bast等，N.Engl.J.Med.，309883-887(1983)；Bast等，J.Clin.Invest.，681331-1337(1981))。然而，僅在50％的FIGO(婦產(chǎn)科國(guó)際聯(lián)盟評(píng)分系統(tǒng)，International Federation of Gynecology and Obstetrics scoring system)I期卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)血清CA 125水平的提高(Jacobs等，Hum.Reprod.，41-12(1989))。另外，大部分患有諸如子宮內(nèi)膜異位或盆腔炎的良性病癥的婦女也會(huì)有CA 125水平的提高(Jacobs等，id；Mashasi等，Obstret.Gynecol.，72328-331(1988))。因此，血清CA 125水平的提高不是檢測(cè)早期發(fā)病的卵巢癌的適宜指示。
對(duì)粘蛋白(例如CA 125)水平的評(píng)估因幾種因素而變得復(fù)雜。首先，粘蛋白是具有高分子量(例如，107道爾頓)的高異質(zhì)性糖蛋白。其次，目前用于檢測(cè)粘蛋白的抗體方法不精確且不能定量。再次，通常檢測(cè)的粘蛋白(例如CA 125)在不同的卵巢癌腫瘤類(lèi)型中的表達(dá)不相同。
因此，本領(lǐng)域需要鑒別出用于腺癌(例如卵巢癌或乳腺癌)早期檢測(cè)或診斷的生物標(biāo)記。本發(fā)明滿(mǎn)足了這一需求和其它需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于在個(gè)體中鑒別癌癥特異性寡糖的方法，以及用于在個(gè)體中確定癌癥株的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)是否存在特異性的癌癥標(biāo)記以在個(gè)體中診斷癌癥或癌癥階段的方法，以及通過(guò)給予抗此類(lèi)標(biāo)記的抗體治療癌癥的方法。此外，本發(fā)明提供了含O-連接寡糖的癌癥標(biāo)記，以及用于診斷或治療癌癥的試劑盒。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒別癌癥特異性寡糖的方法，所述方法包括；(a)從測(cè)試樣品中選擇性地釋放所述寡糖，其中所述測(cè)試樣品是獲自癌細(xì)胞系或患有癌癥的個(gè)體的樣品；(b)采用矩陣輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorptionionization，MALDI)-傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)獲得所述寡糖的質(zhì)譜；以及(c)將所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，通過(guò)所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜中獨(dú)特寡糖的存在來(lái)鑒別所述癌癥特異性寡糖。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中確定癌癥株的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜與至少一種已知癌癥株的質(zhì)譜分布進(jìn)行比較，其中，通過(guò)所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜與一種已知癌癥株的質(zhì)譜分布的相似性來(lái)確定所述癌癥株。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括檢測(cè)獲自所述個(gè)體的樣品中是否存在獨(dú)特的寡糖，其中所述獨(dú)特寡糖的存在指示所述個(gè)體患有癌癥。
在還有另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，所述樣品中含NeuGc O-連接寡糖與含NeuAc O-連接寡糖的比例高于所述對(duì)照樣品指示所述個(gè)體患有癌癥。
在還有一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，所述樣品中硫酸化O-連接寡糖的百分比低于所述對(duì)照樣品指示所述個(gè)體患有癌癥。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在選自下組的癌癥標(biāo)記硫酸化寡糖、含N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid)(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖或它們的組合，其中，存在所述癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有癌癥。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中診斷癌癥的階段的方法，所述方法包括(a)從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在第一癌癥標(biāo)記，其中所述第一癌癥標(biāo)記選自1HexNAc:1Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO3H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO3H；2HexNAc:3Hex:1SO3H；4HexNAc:1Hex:1SO3H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO3H；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；或它們的組合；以及(c)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在第二癌癥標(biāo)記，其中所述第二癌癥標(biāo)記選自1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1 1NeuGc:1Fuc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；1HexNAc:1Hex:1SO3H；2HexNAc:2Hex:2 Fuc:1SO3H；1HexNAc:2Fuc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；或它們的組合，其中存在所述第一癌癥標(biāo)記而不存在所述第二癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有早期癌癥，而存在第二癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有晚期癌癥。
在還有另一方面，本發(fā)明提供了一種癌癥標(biāo)記，其包含具有選自下組的組分的O-連接寡糖:1HexNAc:1Hex:1SO3H；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO3H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO3H；2HexNAc:3Hex:1SO3H；4HexNAc:1Hex:1SO3H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO3H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO3H；1HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1 NeuGc:1Fuc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex；1NeuGc；1HexNAc:2Fuc；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex；2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；2Hex；1HexNAc:1Hex；3Hex；1HexNAc:2Hex；3Hex:1HexNAc；1Hex*:2Hex:1HexNAc；4Hex:1HexNAc；3Hex:2HexNAc；1Hex*:2Hex:2HexNAc；4Hex:2HexNAc；1Hex*:3Hex:2HexNAc；5Hex:2HexNAc；4Hex:3HexNAc；5Hex:3HexNAc；1Hex*:4Hex:3HexNAc；2Hex*:3Hex:1HexNAc；m/z 221+[HexA]1；m/z 221+[HexA]2；m/z 221+[HexA]3；m/z 221+[HexA]4；m/z 221+[HexA]5；m/z 221+[HexA]6；m/z 221+[HeXA]7；m/z 361+[HexA]1；m/z 361+[HexA]2；m/z 361+[HexA]3；m/z 361+[HexA]4；m/z 361+[HexA]5；m/z 361+[HexA]6；m/z 551+[HexA]1；m/z 551+[HexA]2；m/z 551+[HexA]3；m/z 551+[HexA]4；m/z 551+[HexA]5；m/z 555+[HexA]1；m/z 555+[HexA]2；m/z 555+[HexA]3；m/z 604+[HexA]1；m/z 604+[HexA]2；m/z 604+[HexA]3；m/z 604+[HexA]4；或它們的組合。
在還有一方面，本發(fā)明提供了一種在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的特異性結(jié)合于癌癥標(biāo)記的抗體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含(a)包含多種癌癥標(biāo)記的陣列；(b)特異性結(jié)合于所述陣列上的所述多種癌癥標(biāo)記的多種抗體；以及(c)對(duì)獲自所述個(gè)體的樣品使用所述陣列和所述多種抗體的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含(a)特異性結(jié)合于癌癥標(biāo)記的抗體；以及(b)使用所述抗體的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)。
通過(guò)以下詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)是很明確的。
附圖概述

圖1顯示了O-連接寡糖中的已知核心結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)和N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)的結(jié)構(gòu)。
圖3所示為選擇性釋放和分離用于MALDI-FTMS的O-連接寡糖的大致步驟的流程圖。
圖4所示為用10％乙腈洗脫的獲自O(shè)VCAR-3的O-連接寡糖的陽(yáng)離子(positive)(A)和陰離子(negative)(B)MALDI-FTMS質(zhì)譜。
圖5所示為用40％乙腈洗脫的獲自O(shè)VCAR-3的O-連接寡糖的陽(yáng)離子MALDI-FTMS質(zhì)譜。
圖6所示為具有對(duì)應(yīng)于IHexNAc1NeuGc(m/z 529.122)的組分的含NeuGc的離子種類(lèi)的MALDI-FTMS質(zhì)譜(插入圖)和IRMPD圖譜。
圖7所示為含NeuAc的離子m/z 902.322的IRMPD圖譜。
圖8顯示了4種卵巢癌細(xì)胞系中中性、硫酸化、NeuAc和NeuGc O-連接寡糖的分布。
圖9所示為用20％乙腈洗脫的獲自卵巢癌患者血清的O-連接寡糖的陰離子MALDI-FTMS質(zhì)譜。
圖10所示為用40％乙腈洗脫的獲自卵巢癌患者血清的O-連接寡糖的陽(yáng)離子MALDI-FTMS質(zhì)譜。
圖11顯示了4種卵巢癌細(xì)胞系各自的蛋白質(zhì)進(jìn)行1-D凝膠分離的結(jié)果，其中采用Pro Q Emerald 300(A)或Sypro Ruby(B)染色。
圖12所示為分離自CaOV-3的硫酸化O-連接寡糖的MALDI-FTMS質(zhì)譜(A)和IRMPD圖譜(B)。
圖13所示為用20％乙腈洗脫的獲自正常樣品(A)、組III樣品(B)和Lim 6樣品(C)的O-連接寡糖的陽(yáng)離子MALDI-FTMS質(zhì)譜。
圖14顯示了在正常(A)、組I(B)、組II(C)、組III(D)和Lim 6(E)血清樣品中鑒別的各類(lèi)O-連接寡糖的百分比。
圖15顯示了4種硫酸化O-連接寡糖癌癥標(biāo)記的基本結(jié)構(gòu)。
圖16顯示了4種含NeuAc的O-連接寡糖癌癥標(biāo)記的基本結(jié)構(gòu)。
圖17顯示了4種含NeuGc的O-連接寡糖癌癥標(biāo)記的基本結(jié)構(gòu)。
圖18顯示了3種中性O(shè)-連接寡糖癌癥標(biāo)記的基本結(jié)構(gòu)。
圖19所示為表13所列寡糖標(biāo)記的質(zhì)譜。
圖20所示為表14所列寡糖標(biāo)記的質(zhì)譜。
發(fā)明詳述I.縮寫(xiě)MALDI，矩陣輔助激光解吸電離；FTMS，傅里葉變換質(zhì)譜法；IRMPD，紅外多光子解離(infrared multiphoton dissociation)；Hex，己糖；Hex*，乙酰己糖；HexA，己糖醛酸；HexNAc，N-乙酰氨基己糖；NeuAc，N-乙酰神經(jīng)氨酸；NeuGc，N-乙醇酰神經(jīng)氨酸；Fuc，海藻糖；SO3H，硫酸根。
II.定義除非另有說(shuō)明，本文中所用的以下術(shù)語(yǔ)具有下述含義。
術(shù)語(yǔ)″癌癥″是指各種惡性腫瘤中的任何一種，特征為傾向于侵入周?chē)M織以及轉(zhuǎn)移到新身體部位的間變(anaplastic)細(xì)胞的增殖。不同類(lèi)型癌癥的例子包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、肝癌、胸膜癌、胰腺癌、宮頸癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、肛門(mén)癌、膽管癌、胃腸道良性腫瘤、食管癌、膽囊膀胱癌、直腸癌、盲腸癌、小腸癌、胃癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、皮膚癌、絨毛膜癌；頭頸癌；以及骨肉瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、纖維肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、單核細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病以及急性髓細(xì)胞性白血病。術(shù)語(yǔ)″腺癌″是指在腺性上皮中起源的各種惡性腫瘤中的任何一種，包括但不限于卵巢癌和乳腺癌。
術(shù)語(yǔ)″樣品″是指獲自個(gè)體的任何生物試樣。適用于本發(fā)明的樣品包括但不限于全血、血漿、血清、唾液、尿樣、糞便、淚液以及任何其它體液或組織。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述樣品是血清樣品。該術(shù)語(yǔ)還包括獲自細(xì)胞系的任何試樣，包括但不限于條件培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物，例如膜提取物、細(xì)胞溶質(zhì)提取物、核提取物等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在分析前可對(duì)樣品例如血清和條件培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。
術(shù)語(yǔ)″標(biāo)記″是指在生物樣品中可檢測(cè)并指示疾病、病癥或者對(duì)疾病或病癥的易感性的任何分子。所述標(biāo)記優(yōu)選為聚糖或糖分子(例如單糖、寡糖或多糖)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述標(biāo)記是對(duì)具體類(lèi)型的癌癥具有特異性的獨(dú)特的寡糖種類(lèi)。作為非限制性的例子，所述獨(dú)特的寡糖種類(lèi)可為O-連接寡糖、N-連接寡糖、游離(free)寡糖或它們的組合。
術(shù)語(yǔ)″癌癥標(biāo)記″是指可在個(gè)體中指示癌癥的標(biāo)記。該術(shù)語(yǔ)包括如下的分子由癌細(xì)胞或正常細(xì)胞產(chǎn)生或存在于癌細(xì)胞或正常細(xì)胞上，但與正常細(xì)胞系或未患癌癥個(gè)體的對(duì)照樣品相比，該分子的水平在癌細(xì)胞系或患有癌癥的患者的測(cè)試樣品中受到調(diào)控。更具體而言，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于(1)由癌細(xì)胞特異性表達(dá)或特異性存在于癌細(xì)胞上、但在正常細(xì)胞中不表達(dá)或在正常細(xì)胞上不存在的分子；(2)在癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞中的表達(dá)提高的分子；(3)由正常細(xì)胞特異性表達(dá)或特異性存在于正常細(xì)胞上、但在癌細(xì)胞中不表達(dá)或在癌細(xì)胞上不存在的分子；以及(4)在癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞中的表達(dá)降低的分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述癌癥標(biāo)記是O-連接寡糖。例如，所述O-連接寡糖可為硫酸化寡糖、含NeuAc的寡糖、含NeuGc的寡糖、含HexA的寡糖、含Hex的寡糖、中性寡糖或它們的組合。在其它實(shí)施方式中，所述癌癥標(biāo)記是N-連接寡糖或游離寡糖。
術(shù)語(yǔ)″游離寡糖″是指不與蛋白質(zhì)結(jié)合的任何寡糖種類(lèi)，包括但不限于與脂質(zhì)連接的寡糖。
術(shù)語(yǔ)″m/z″是指用離子的質(zhì)量除以其電荷數(shù)得到的質(zhì)核比。
術(shù)語(yǔ)″個(gè)體″是指任何動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。
術(shù)語(yǔ)″患有癌癥的個(gè)體″是指在獲取測(cè)試樣品時(shí)已表現(xiàn)出一種或多種癌癥相關(guān)癥狀的個(gè)體，或在獲取樣品時(shí)已預(yù)先診斷患有癌癥的個(gè)體。
術(shù)語(yǔ)″未患癌癥的個(gè)體″是指在獲取測(cè)試樣品時(shí)未表現(xiàn)出任何癌癥相關(guān)癥狀的個(gè)體，在獲取對(duì)照樣品時(shí)已表現(xiàn)出癌癥相關(guān)癥狀緩解的個(gè)體，或在獲取對(duì)照樣品時(shí)未表現(xiàn)出先前診斷癌癥的任何復(fù)發(fā)。因此，未患癌癥的個(gè)體與患有癌癥的個(gè)體無(wú)需不同。例如，某一個(gè)體可在不同時(shí)間提供樣品，例如一次在患有癌癥之前取樣(對(duì)照樣品)和一次在患有癌癥時(shí)取樣(測(cè)試樣品)，或從緩解或治療后的個(gè)體中獲得對(duì)照樣品并與較早時(shí)(例如當(dāng)該個(gè)體患有癌癥時(shí))獲自相同個(gè)體的測(cè)試樣品相比較。
術(shù)語(yǔ)″糖苷外切酶″是指選擇性水解兩個(gè)單糖間的連接鍵的酶。優(yōu)選的，所述糖苷外切酶選擇性地水解存在于寡糖(例如，O-連接或N-連接寡糖)中的兩個(gè)單糖間的連接鍵。適宜的糖苷外切酶包括但不限于巖藻糖苷酶，例如α1，2-巖藻糖苷酶、α1-3，4-巖藻糖苷酶和α1，6-巖藻糖苷酶；半乳糖苷酶，例如α1-3，6-半乳糖苷酶、β1，3-半乳糖苷酶、β1-3，6-半乳糖苷酶和β1，4-半乳糖苷酶；己糖胺酶，例如α-N-乙酰基-氨基半乳糖苷酶以及；β1-2，3，4，6-N-乙?；?氨基葡萄糖苷酶己糖酶，例如β-糖苷酶；甘露糖苷酶，例如α1-2，3-甘露糖苷酶、α1，6-甘露糖苷酶和β1，4-甘露糖苷酶；神經(jīng)氨酸苷酶，例如α2-3，6-神經(jīng)氨酸苷酶、β2-3，6，8-神經(jīng)氨酸苷酶、α2-3，6，8，9-神經(jīng)氨酸苷酶和α2，3-神經(jīng)氨酸苷酶；木糖苷酶，例如β1，2-木糖苷酶；或它們的組合。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″陣列″是指固定在固相載體或基材上的不同核酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)或寡糖的陣列，所述固相載體或基材包括例如紙、膜(如尼龍膜)、濾器、基片、針、珠、玻璃(如載玻片)或其它適宜的固相載體。優(yōu)選地，所述陣列包含偶聯(lián)在基材表面不同已知位置的多種不同寡糖種類(lèi)(例如，O-連接寡糖、N-連接寡糖、游離寡糖等)。
術(shù)語(yǔ)″治療有效量″是指能在需要所述治療的對(duì)象中獲得治療效果的抗體或其它治療劑(例如，離子、小有機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、多肽、寡糖等)的量。例如抗體的治療有效量可以是能預(yù)防或緩解一種或多種癌癥相關(guān)癥狀的量。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合于癌癥特異性標(biāo)記(例如，獨(dú)特的寡糖種類(lèi))。
術(shù)語(yǔ)″癌癥的階段″是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并廣泛使用的癌癥階段分期體系，例如由美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer(AJCC))設(shè)計(jì)的分期體系。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解具體癌癥類(lèi)型的分期取決于多種因素，這些因素包括但不限于腫瘤大小、在器官中和向鄰近器官的擴(kuò)散程度、向淋巴結(jié)的擴(kuò)散程度以及向遠(yuǎn)端器官的擴(kuò)散程度(即轉(zhuǎn)移)。用于具體癌癥類(lèi)型的AJCC分期體系通常將癌癥劃分為4個(gè)階段(階段I-IV)，各階段任選地細(xì)分為亞階段(例如，階段IIIA、IIIB和IIIC)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)″早期癌癥″是指階段I癌癥，但也可指階段II癌癥或階段II癌癥的亞階段(例如，階段IIA)。術(shù)語(yǔ)″晚期癌癥″在本文中是指階段III或階段IV癌癥，但也可指階段II癌癥或階段II癌癥的亞階段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解根據(jù)癌癥的具體類(lèi)型，階段II癌癥可劃分為早期癌癥或晚期癌癥。例如，術(shù)語(yǔ)″早期卵巢癌″是指階段I或階段IIA卵巢癌，而術(shù)語(yǔ)″晚期卵巢癌″是指階段IIB-階段IV的卵巢癌。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″給藥(給予)″是指口服給藥、作為栓劑給藥、局部接觸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、病灶內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下給藥，或?qū)⒕忈屟b置(例如小型滲透泵)植入對(duì)象。給藥可通過(guò)任何途徑進(jìn)行，包括經(jīng)胃腸道外和透粘膜(例如，經(jīng)頰、舌下、腭、牙齦、鼻、陰道、直腸粘膜或透皮)。胃腸道外給藥包括例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)給藥。其它遞送模式包括但不限于采用脂質(zhì)體制劑、靜脈灌注、透皮貼片等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道用于給予治療有效量的抗體或其它治療劑以預(yù)防或緩解癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的其它方法。
III.總體概況本發(fā)明提供了用于鑒別癌癥特異性寡糖的方法，以及用于在個(gè)體中確定癌癥株的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)在個(gè)體中是否存在特異性的癌癥標(biāo)記來(lái)診斷癌癥或癌癥的階段的方法，以及通過(guò)給予抗此類(lèi)標(biāo)記的抗體來(lái)治療癌癥的方法。此外，本發(fā)明提供了含O-連接寡糖的癌癥標(biāo)記，以及用于診斷或治療癌癥的試劑盒。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即從細(xì)胞系或血清中釋放的O-連接寡糖是癌癥的指示劑。雖然已嘗試分析腫瘤、癌細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)染的上皮和類(lèi)淋巴母細(xì)胞系(lyphoblastoid cell line)中的MUC1的差別糖基化，但它們有賴(lài)于使用單克隆抗體、凝集素或代謝性放射標(biāo)記的碳水化合物。因此，這些研究嚴(yán)重受限于它們不能區(qū)分正常粘蛋白和癌癥粘蛋白間糖基化的精確差別，這是因?yàn)楂@得用于詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息的材料很有難度。然而，本發(fā)明通過(guò)采用質(zhì)譜技術(shù)例如MALDI-傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)識(shí)別樣品中的寡糖種類(lèi)而克服了這些限制。具體而言，F(xiàn)TMS提供精確質(zhì)量測(cè)定的能力(即，常規(guī)＜10ppm，有內(nèi)校準(zhǔn)時(shí)＜5ppm)對(duì)于獲得基本寡糖組分是很重要的。另外，本發(fā)明的方法有利地采用了從樣品中選擇性地釋放寡糖而無(wú)需進(jìn)行分離步驟。此類(lèi)寡糖尤其可用作在個(gè)體中檢測(cè)癌癥的標(biāo)記。
IV.實(shí)施方式的描述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鑒別癌癥特異性寡糖的方法，所述方法包括(a)從測(cè)試樣品中選擇性地釋放所述寡糖，其中所述測(cè)試樣品是獲自癌細(xì)胞系或患有癌癥的個(gè)體的樣品；(b)采用矩陣輔助激光解吸電離(MALDI)-傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)獲得所述寡糖的質(zhì)譜；以及(c)將所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，通過(guò)所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜中獨(dú)特寡糖的存在來(lái)鑒別所述癌癥特異性寡糖。
術(shù)語(yǔ)″選擇性釋放″是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、用于主要從樣品中釋放O-連接寡糖、N-連接寡糖、游離寡糖、或它們的組合的方法。例如，采用硼氫化鈉(NaBH4)的方法(如Morelle等，Eur.J.Biochemistry，252253-260(1998)中所述)和采用肼的方法(如Patel等，Biochemistry，32679-693(1993)中所述)適于從樣品中選擇性釋放O-連接寡糖。采用PNGase F的方法(如Fan等，J.Biol.Chem.，27227058-27064(1997)；Tarentino等，MethodsEnzyMol.，23044-57(1994)；和Trimble等，J.Biol.Chem.，2661646-1651(1991)中所述)適于從樣品中選擇性釋放N-連接寡糖。從樣品中選擇性釋放游離寡糖的方法在，例如上文所述Morelle等的文獻(xiàn)中有述。
對(duì)于O-連接寡糖，術(shù)語(yǔ)″選擇性釋放″包括從樣品中釋放至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的O-連接寡糖；以及從該樣品中釋放少于約30％，優(yōu)選少于約20％，更優(yōu)選少于約10％，最優(yōu)選少于約5％所有的其它種類(lèi)，例如非-O-連接寡糖(例如，N-連接寡糖)、蛋白質(zhì)、肽和核酸。類(lèi)似地，對(duì)于N-連接寡糖，該術(shù)語(yǔ)包括從樣品中釋放至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的N-連接寡糖；從該樣品中釋放少于約30％，優(yōu)選少于約20％，更優(yōu)選少于約10％，最優(yōu)選少于約5％所有的其它種類(lèi)，例如非-N-連接寡糖(例如，O-連接寡糖)、蛋白質(zhì)、肽和核酸。同樣，對(duì)于游離寡糖，該術(shù)語(yǔ)包括從樣品中釋放至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的游離寡糖；以及從該樣品中釋放少于約30％，優(yōu)選少于約20％，更優(yōu)選少于約10％，最優(yōu)選少于約5％所有的其它種類(lèi)，例如其它寡糖、蛋白質(zhì)、肽和核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可從樣品中選擇性釋放O-連接、N-連接和/或游離寡糖的組合。
術(shù)語(yǔ)″樣品″是指獲自個(gè)體的任何生物試樣。適用于本發(fā)明的樣品包括但不限于全血、血漿、血清、唾液、尿樣、糞便、淚液以及任何其它體液或組織?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法從個(gè)體中獲取樣品。例如，可通過(guò)從個(gè)體抽血來(lái)獲得全血樣品。或者，可從血庫(kù)或醫(yī)師辦公室獲得全血樣品。該術(shù)語(yǔ)還包括獲自細(xì)胞系的任何試樣，包括但不限于條件培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物，例如膜提取物、細(xì)胞溶質(zhì)提取物、核提取物等。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″測(cè)試樣品″是指獲自癌細(xì)胞系或患有癌癥的個(gè)體的樣品。適宜的癌細(xì)胞系包括但不限于卵巢癌細(xì)胞系，例如CaOV-3、OVCAR-3、ES-2、SK-OV-3、SW626、TOV-21G、TOV-112D、OV-90、MDA-H2774和PA-1；乳腺癌細(xì)胞系，例如MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、MDA-MD-453、BT-474、Hs578T、HCC1008、HCC1954、HCC38、HCC1143、HCC1187、HCC1395、HCC1599、HCC1937、HCC2218、Hs574.T、Hs742.T、Hs605.T和Hs606；肺癌細(xì)胞系，例如NCI-H2126、NCI-H1395、NCI-H1437、NCI-H2009、NCI-H1672、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H1184、NCI-H209、NCI-H2107和NCI-H128；皮膚癌細(xì)胞系，例如COLO829、TE354.T、Hs925.T、WM-115和Hs688(A).T；骨癌細(xì)胞系，例如Hs919.T、Hs821.T、Hs820.T、Hs704.T、Hs707(A).T、Hs735.T、Hs860.T、Hs888.T、Hs889.T、Hs890.T和Hs709.T；結(jié)腸癌細(xì)胞系，例如Caco-2、DLD-1、HCT-116、HT-29和SW480；胃癌細(xì)胞系，例如RF-1；以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它癌細(xì)胞系。用于本發(fā)明方法中的癌細(xì)胞系可獲自，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)、國(guó)立癌癥研究所或癌癥中心或?qū)嶒?yàn)室，例如在戴維斯醫(yī)療中心的加利福尼亞州立大學(xué)(the University of California)?！寤加邪┌Y的個(gè)體″是指在獲取測(cè)試樣品時(shí)已表現(xiàn)出一種或多種癌癥相關(guān)癥狀的個(gè)體，或在獲取樣品時(shí)已預(yù)先診斷患有癌癥的個(gè)體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″對(duì)照樣品″是指獲自正常細(xì)胞系或未患癌癥的個(gè)體的樣品。適宜的正常細(xì)胞系包括但不限于卵巢細(xì)胞系，例如NOV-31；乳腺細(xì)胞系例如Hs578Bst；外周血細(xì)胞系，例如NCI-BL2126、NCI-BL1395、NCI-BL1437、NCI-BL2009、NCI-BL2122、NCI-BL2087、NCI-BL1672、NCI-BL2171、NCI-BL2195、NCI-BL1184、NCI-BL209、NCI-BL2107、NCI-BL128、NCI-BL2052、NCI-BL1770、HCC1007BL、HCC1954BL、HCC38BL、HCC1143BL、HCC1187BL、HCC1395BL、HCC1599BL、HCC1937BL、HCC2157BL、HCC2218BL和COLO829BL；肺細(xì)胞系，例如Hs888Lu；皮膚細(xì)胞系，例如Hs574.Sk、Hs742.Sk、Hs605.Sk、Hs606.Sk、TE353.Sk、Hs925.Sk、Hs919.Sk、Hs821.Sk、Hs820.Sk、Hs704.Sk、Hs707(B).Ep、Hs735.Sk、Hs889.Sk、Hs890.Sk、Hs709.Sk、Hs789.Sk和Hs814.Sk；結(jié)腸細(xì)胞系，例如CCD-18Co；以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它正常細(xì)胞系?？蓮淖鳛橥饪迫コ铽@得的主要人體組織中分離和培養(yǎng)原代、未轉(zhuǎn)化細(xì)胞，產(chǎn)生正常上皮細(xì)胞系(參見(jiàn)例如，Syed等，Cancer Res.，616768-6776(2001))?？蓮睦?，ATCC(Manassas，VA)獲得用于本發(fā)明的正常細(xì)胞系?！逦椿及┌Y的個(gè)體″是指在獲取測(cè)試樣品時(shí)未表現(xiàn)出任何癌癥相關(guān)癥狀的個(gè)體，在獲取對(duì)照樣品時(shí)已表現(xiàn)出癌癥相關(guān)癥狀緩解的個(gè)體，或在獲取對(duì)照樣品時(shí)未表現(xiàn)出先前診斷癌癥的任何復(fù)發(fā)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解未患癌癥的個(gè)體與患有癌癥的個(gè)體無(wú)需不同。例如，某一個(gè)體可在不同時(shí)間提供樣品，例如一次在患有癌癥之前取樣(對(duì)照樣品)和一次在患有癌癥時(shí)取樣(測(cè)試樣品)，或從緩解或治療后的個(gè)體中獲得對(duì)照樣品并與較早時(shí)(例如當(dāng)該個(gè)體患有癌癥時(shí))獲自相同個(gè)體的測(cè)試樣品相比較。
在本發(fā)明的方法中，獲自測(cè)試樣品和對(duì)照樣品的寡糖(例如，O-連接、N-連接和/或游離寡糖)的質(zhì)譜是采用質(zhì)譜技術(shù)，例如矩陣輔助激光解吸電離(MALDI)-傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)獲得的。MALDI尤為有利，因其有助于生物分子(例如碳水化合物、核酸和蛋白質(zhì))的解吸附和離子化而不會(huì)使其斷裂。例如，Hillenkamp等，Anal.Chem.，631193A-1203A(1991)；Karas等，Anal.Chem.，602299-2301(1988)；和Stahl等，Anal.BioChem.，223218-226(1994)中所描述的MALDI在生物分子中的應(yīng)用。FTMS是一種分辨率很高的質(zhì)譜技術(shù)，它基于以磁力捕集離子并激發(fā)/檢測(cè)它們的回旋加速頻率。因此，F(xiàn)TMS能提供精確的質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果，即通常為＜10ppm，有內(nèi)校準(zhǔn)時(shí)為＜5ppm。將MALDI-FTMS用于樣品中的寡糖種類(lèi)的鑒別在例如Tseng等，Anal.BioChem.，25018-28(1997)和Tseng等，Anal.Chem.，713747-3754(1999)中有所描述。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″獲得寡糖的質(zhì)譜″是指對(duì)含有從樣品中釋放出的全部O-連接、N-連接和/或游離寡糖種類(lèi)或其中部分的樣品(即測(cè)試樣品或?qū)φ諛悠?獲得寡糖的分布。例如，當(dāng)選擇性釋放出O-連接寡糖，并用諸如固相萃取法的技術(shù)在多孔石墨化碳(PGC)柱進(jìn)行純化時(shí)，根據(jù)所用溶劑的百分比(例如10％、20％、40％)和/或類(lèi)型(例如，乙腈)，僅部分釋放出的O-連接寡糖種類(lèi)可從柱中洗脫出。對(duì)該部分獲得的質(zhì)譜可包含例如少于1％，至少1％，至少5％，至少10％，或至少20％釋放的O-連接寡糖種類(lèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，質(zhì)譜中所存在的釋放的O-連接、N-連接和/或游離寡糖種類(lèi)部分也可取決于該質(zhì)譜是在陽(yáng)離子模式還是陰離子模式中獲得的。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″比較測(cè)試樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜″是指比較或比對(duì)測(cè)試樣品的質(zhì)譜分布與對(duì)照樣品的質(zhì)譜分布，確定這兩種質(zhì)譜分布中的任何相似性和/或差異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解質(zhì)譜分布可為一系列峰、一系列m/z比、一系列基本成分或適于比較獲自測(cè)試樣品的寡糖和對(duì)照樣品的寡糖的任何其它形式?？稍讷@得測(cè)試質(zhì)譜分布的同時(shí)獲得對(duì)照質(zhì)譜分布，或可預(yù)先獲得對(duì)照的質(zhì)譜分布并存儲(chǔ)于例如數(shù)據(jù)庫(kù)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解可用電腦(例如采用數(shù)據(jù)庫(kù))比較兩種質(zhì)譜分布。在某些例子中，采用例如峰匹配技術(shù)來(lái)用計(jì)算機(jī)軟件程序比較和/或解釋兩種質(zhì)譜分布。在某些其它例子中，采用互聯(lián)網(wǎng)應(yīng)用比較解釋這兩種質(zhì)譜分布。
術(shù)語(yǔ)″通過(guò)所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜中獨(dú)特寡糖的存在鑒別癌癥特異性寡糖″是指鑒別與對(duì)照樣品相比在測(cè)試樣品中的水平發(fā)生調(diào)控的O-連接、N-連接和/或游離寡糖。更具體而言，該術(shù)語(yǔ)包括存在于測(cè)試樣品中但不存在于對(duì)照樣品中的任何O-連接、N-連接或游離寡糖種類(lèi)；與對(duì)照樣品相比在測(cè)試樣品中的水平有所提高的任何O-連接、N-連接或游離寡糖；與對(duì)照樣品相比在測(cè)試樣品中的水平有所降低的任何O-連接、N-連接或游離寡糖；以及存在于對(duì)照樣品中但不存在于測(cè)試樣品中的任何O-連接、N-連接或游離寡糖種類(lèi)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括對(duì)所述獨(dú)特的一種或多種寡糖進(jìn)行紅外多光子解離(IRMPD)的步驟。使用IRMPD具有超出其它技術(shù)(例如碰撞誘導(dǎo)的解離(CID))的優(yōu)點(diǎn)，這是因?yàn)镮RMPD不會(huì)限制所觀察產(chǎn)物離子的m/z范圍、無(wú)需匹配共振頻率和可獲得更多序列信息(典型地可到達(dá)最后的殘基)。因此，可在單次試驗(yàn)中對(duì)相當(dāng)大的寡糖進(jìn)行完全測(cè)序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括用糖苷外切酶消化所述獨(dú)特的寡糖的步驟。優(yōu)選地，所述糖苷外切酶選擇性水解存在于所述寡糖中的兩個(gè)單糖間的連接鍵。適用于本發(fā)明的糖苷外切酶包括以下的任何一種上文所述的巖藻糖苷酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、己糖酶、甘露糖苷酶、神經(jīng)氨酸苷酶和木糖苷酶，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它糖苷外切酶。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述獨(dú)特的寡糖是選自下組的O-連接寡糖硫酸化寡糖、含N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖、或它們的組合。
在另一實(shí)施方式中，所述寡糖在上述癌癥中的任一種中具有特異性。優(yōu)選地，所述癌癥是卵巢癌或乳腺癌。在某些例子中，獲自癌細(xì)胞系的測(cè)試樣品和/或獲自正常細(xì)胞系的對(duì)照樣品是條件培養(yǎng)基。在某些其它例子中，獲自患有癌癥的個(gè)體的測(cè)試樣品和/或獲自未患癌癥的個(gè)體的對(duì)照樣品是血清。
在還有另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合于用上述方法鑒別的獨(dú)特寡糖的抗體。″抗體″是指包含能特異性結(jié)合和識(shí)別抗原(例如本發(fā)明的獨(dú)特寡糖)的來(lái)自免疫球蛋白基因的框架區(qū)的多肽或其片段。示例性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。各四聚體由兩對(duì)不同的多肽鏈組成，各對(duì)鏈具有一條″輕″鏈(約25kDa)和一條″重″鏈(約50-70kDa)。輕鏈分為κ或λ輕鏈。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε重鏈，它們分別定義了免疫球蛋白的類(lèi)別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。各鏈的N端定義了主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。各鏈的其余部分定義了在不同抗體中保守且具有低可變性的恒定區(qū)。各輕鏈含有一個(gè)恒定區(qū)(CL)，而各重鏈含有三個(gè)恒定區(qū)(CH1、CH2、CH3)。在抗體莖部中不同類(lèi)型的恒定區(qū)根據(jù)其氨基酸序列產(chǎn)生具有不同特性的不同同種型。
抗體例如以完整免疫球蛋白形式存在，或是用各種肽酶消化產(chǎn)生的良好表征的片段形式，這些片段形式在本文中稱(chēng)為″抗體片段″。因此，例如，用胃蛋白酶消化抗體鉸鏈區(qū)中二硫鍵的下方以產(chǎn)生F(ab)′2即Fab二聚體(片段，抗原結(jié)合)，其本身是通過(guò)二硫鍵與VH-CHI結(jié)合的輕鏈。F(ab)′2在溫和條件下可還原以斷裂鉸鏈區(qū)的二硫鍵，由此將F(ab)′2二聚體轉(zhuǎn)化為Fab′單體。Fab′單體基本上由Fab組成，同時(shí)具有部分鉸鏈區(qū)(參見(jiàn)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》“FundamentalImmunology”，Paul編，第3版，1993)。雖然用完整抗體的消化定義了各種抗體片段，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可通過(guò)化學(xué)從頭合成或使用重組DNA法從頭合成這些片段。因此，如本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體還包括通過(guò)對(duì)完整抗體的修飾產(chǎn)生的抗體片段或采用重組DNA法從頭合成的那些抗體(例如，單鏈Fv)或采用噬菌體展示文庫(kù)鑒別的那些抗體(參見(jiàn)例如，McCafferty等，Nature 348552-554(1990))。
對(duì)于抗體(例如重組、單克隆或多克隆抗體)的制備，可采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)(參見(jiàn)例如，Kohler & Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today，472(1983)；Cole等，《單克隆抗體和癌癥治療》，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”第77-96頁(yè)，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，《免疫學(xué)現(xiàn)有方法》，“Current Protocols in Immunology”(1991)；Harlow & Lane，《抗體，實(shí)驗(yàn)室指南》，“Antibodies，A LaboratoryManual”(1988)；以及Goding，《單克隆抗體原理和實(shí)踐》，“MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice”(第2版1986))?？蓮募?xì)胞中克隆編碼感興趣抗體的重鏈和輕鏈的基因，例如可從雜交瘤中克隆編碼單克隆抗體的基因，并用于產(chǎn)生重組單克隆抗體。可從雜交瘤或漿細(xì)胞中制備編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因文庫(kù)。重鏈和輕鏈基因產(chǎn)物的隨機(jī)組合產(chǎn)生了大量具有不同抗原特異性的抗體(參見(jiàn)例如，Kuby，《免疫學(xué)》，“Immunology”(第3版1997))?？刹杉{用于產(chǎn)生單鏈抗體或重組抗體的技術(shù)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利4,816,567和4,946,778)來(lái)產(chǎn)生抗本發(fā)明寡糖的抗體。另外，可采用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物(例如其它哺乳動(dòng)物)表達(dá)人化或人抗體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等，Biotechnology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology，14826(1996)；和Lonberg & Huszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995))?；蛘撸刹捎檬删w展示技術(shù)鑒別特異性結(jié)合于所選抗原的抗體和異聚Fab片段(參見(jiàn)例如，McCafferty等，Nature，348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology，10779-783(1992))。還可制備雙特異性抗體，即能識(shí)別兩種不同抗原的抗體(參見(jiàn)例如，WO 93/08829；Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)；和Suresh等，《酶學(xué)方法》，“Methods in Enzymology”，121210(1986))?？贵w還可為異源偶連物(heteroconjugate)，例如共價(jià)連接的兩個(gè)抗體或免疫毒素(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利4,676,980；PCT申請(qǐng)WO 91/00360和WO 92/200373；以及EP 03089)。
″嵌合抗體″是具有如下特征的抗體分子，其中(a)使恒定區(qū)或其部分發(fā)生改變、取代或交換，從而使抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))與不同的或改變了類(lèi)型、效應(yīng)物功能和/或種類(lèi)的恒定區(qū)連接，或與賦予該嵌合抗體新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等)連接；或(b)使可變區(qū)或其部分發(fā)生改變、取代、或與具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)進(jìn)行交換。例如，嵌合抗體在可變區(qū)中可包含小鼠蛋白質(zhì)序列，在恒定區(qū)中可包含人蛋白質(zhì)序列?！迦嘶贵w″在可變區(qū)包含比嵌合抗體甚至更少的小鼠蛋白質(zhì)序列。這些小鼠蛋白質(zhì)序列已被然蛋白質(zhì)序列取代。
在某些例子中，所述抗體還包括與其結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記的例子包括但不限于熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、Cy2、Cy3、Cy5、生物素、辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉可檢測(cè)標(biāo)記的加入以及使具體的可檢測(cè)標(biāo)記與抗體偶聯(lián)的適宜方法。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的特異性結(jié)合于獨(dú)特寡糖的抗體。
在某些例子中，抗體的治療有效量可為能預(yù)防或緩解一種或多種癌癥相關(guān)癥狀的量。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合于癌癥特異性或?qū)唧w類(lèi)型的癌癥(例如卵巢癌或乳腺癌)具有特異性的獨(dú)特寡糖。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中確定癌癥株的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜與至少一種已知癌癥株的質(zhì)譜分布進(jìn)行比較，其中，通過(guò)所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜與一種已知癌癥株的質(zhì)譜分布的相似性來(lái)確定所述癌癥株。
術(shù)語(yǔ)″癌癥株″是指相同種類(lèi)的癌癥組中(例如，卵巢癌)具有不同特性(例如，不同質(zhì)譜分布)的成員。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥株是卵巢癌或乳腺癌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種卵巢癌株，包括但不限于CaOV-3、OVCAR-3、ES-2、SK-OV-3、SW626、TOV-21G、TOV-112D、OV-90、MDA-H2774和PA-1。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種乳腺癌株，包括但不限于MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、MDA-MD-453、BT-474、Hs578T、HCC1008、HCC1954、HCC38、HCC1143、HCC1187、HCC1395、HCC1599、HCC1937、HCC2218、Hs574.T、Hs742.T、Hs605.T和Hs606。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)″通過(guò)測(cè)定樣品質(zhì)譜和一種已知癌癥株相似性來(lái)確定癌癥株″是指測(cè)定樣品的質(zhì)譜與已知癌癥株中的一種的質(zhì)譜分布是否具有至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的相同性。優(yōu)選地，樣品的質(zhì)譜最類(lèi)似于已知癌癥株中的一種。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解樣品的質(zhì)譜可與多種已知癌癥株的質(zhì)譜分布相似。在這些例子中，可采用其它因素例如比較質(zhì)譜分布中具體種類(lèi)水平(例如，峰值強(qiáng)度)來(lái)確定個(gè)體中的癌癥株。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括檢測(cè)獲自所述個(gè)體的樣品總是否存在獨(dú)特的寡糖，其中所述獨(dú)特寡糖的存在指示所述個(gè)體患有癌癥。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述獨(dú)特的寡糖選自下組O-連接寡糖、N-連接寡糖、游離寡糖、或它們的組合。在某些例子中，檢測(cè)所述獨(dú)特的寡糖包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)確定所述質(zhì)譜中所述獨(dú)特寡糖的存在。在某些其它例子中，檢測(cè)所述獨(dú)特的寡糖包括使樣品與特異性結(jié)合所述獨(dú)特寡糖的抗體接觸。
在還有另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體中癌癥的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，所述樣品中含NeuGc O-連接寡糖與含NeuAc O-連接寡糖的比例高于所述對(duì)照樣品指示所述個(gè)體患有癌癥。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥是腺癌，例如卵巢癌或乳腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品是血清。在某些例子中，比較樣品的質(zhì)譜和對(duì)照樣品的質(zhì)譜包括計(jì)算樣品質(zhì)譜中含NeuGc O-連接寡糖與含NeuAc O-連接寡糖的比值，并將該計(jì)算所得的比值與對(duì)照樣品中含NeuGc O-連接寡糖與含NeuAc O-連接寡糖的計(jì)算比值進(jìn)行比較。如本文所用，術(shù)語(yǔ)″計(jì)算含NeuGc O-連接寡糖與含NeuAc O-連接寡糖的比值″是指測(cè)定質(zhì)譜分布中存在的含NeuGc-和含NeuAcO-連接寡糖種類(lèi)的數(shù)目，然后用含NeuGc O-連接寡糖種類(lèi)的數(shù)目除以含NeuAcO-連接寡糖種類(lèi)的數(shù)目。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道其它計(jì)算NeuGc/NeuAc比值的方法，包括例如采用算法?？赏瑫r(shí)得到獲自個(gè)體的對(duì)照樣品和樣品的NeuGc/NeuAc比，或者可先獲得對(duì)照的NeuGc/NeuAc比并將其保存在例如數(shù)據(jù)庫(kù)中。實(shí)施例8和圖14說(shuō)明了獲自個(gè)體的對(duì)照(即正常)樣品和一系列樣品(即組I-III，Lim 6)的NeuGc/NeuAc比值的比較。
在還有一方面，本發(fā)明提供了一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，所述樣品中硫酸化O-連接寡糖的百分比低于所述對(duì)照樣品指示所述個(gè)體患有癌癥。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述癌癥是腺癌，例如卵巢癌或乳腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品是血清。在某些例子中，比較樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜包括計(jì)算樣品質(zhì)譜中的硫酸化O-連接寡糖的百分比，將該計(jì)算所得的百分比與由對(duì)照樣品計(jì)算得到的硫酸化O-連接寡糖的百分比進(jìn)行比較。如本文所用，術(shù)語(yǔ)″計(jì)算硫酸化O-連接寡糖的百分比″是指測(cè)定質(zhì)譜分布中硫酸化O-連接寡糖種類(lèi)的數(shù)目和O-連接寡糖種類(lèi)的總數(shù)，然后用硫酸化O-連接寡糖種類(lèi)的數(shù)目除以O(shè)-連接寡糖種類(lèi)的總數(shù)。然后將比值乘以100使硫酸化/總O-連接寡糖的比值轉(zhuǎn)化為百分比。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可采用其它方法計(jì)算O-連接寡糖的百分比，包括例如采用算法。優(yōu)選地，質(zhì)譜分布中存在的O-連接寡糖種類(lèi)總數(shù)中包括硫酸化O-連接寡糖、含NeuGc O-連接寡糖、含NeuAc O-連接寡糖、和/或中性O(shè)-連接寡糖。可同時(shí)得到獲自個(gè)體的對(duì)照樣品和樣品的O-連接寡糖百分比，或者可先獲得對(duì)照的硫酸化O-連接寡糖百分比并將其保存在例如數(shù)據(jù)庫(kù)中。實(shí)施例8和圖14說(shuō)明了獲自個(gè)體的對(duì)照(即正常)樣品和一系列樣品(即組I-III，Lim6)的硫酸化O-連接寡糖百分比的比較。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在選自下組的癌癥標(biāo)記硫酸化寡糖、含N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖或它們的組合，其中，存在所述癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有癌癥。
在某些例子中，所述癌癥是腺癌，例如卵巢癌或乳腺癌。優(yōu)選地，所述樣品是血清。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述癌癥標(biāo)記是O-連接寡糖。在其它實(shí)施方式中，所述癌癥標(biāo)記是N-連接寡糖。在還有其它的實(shí)施方式中，所述癌癥標(biāo)記是游離寡糖。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述硫酸化寡糖是選自下組的組分HexNAc:1Hex:1SO3H；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1 1SO3H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO3H；2HexNAc:3Hex:1SO3H；4HexNAc:1Hex:1SO3H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO3H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO3H；或它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述含NeuAc的寡糖具有選自下組的組成1HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；或它們的組合。在另一實(shí)施方式中，所述含NeuGc的寡糖具有選自下組的組分1HexNAc:1Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；或它們的組合。在還有另一實(shí)施方式中，所述中性寡糖具有選自下組的組分1HexNAc:2Fuc；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；或它們的組合。在另一實(shí)施方式中，所述含Hex的寡糖具有選自下組的組分2Hex；1HexNAc:1Hex；3Hex；1HexNAc:2Hex；3Hex:1HexNAc；1Hex*:2Hex:1HexNAc；4Hex:1HexNAc；3Hex:2HexNAc；1Hex*:2Hex:2HexNAc；4Hex:2HexNAc；1Hex*:3Hex:2HexNAc；5Hex:2HexNAc；4Hex:3HexNAc；5Hex:3HexNAc；1Hex*:4Hex:3HexNAc；2Hex*:3Hex:1HexNAc；或它們的組合。在另一實(shí)施方式中，所述含HexA的寡糖具有選自下組的組分m/z 221+[HexA]1；m/z 221+[HexA]2；m/z 221+[HexA]3；m/z 221+[HexA]4；m/z 221+[HexA]5；m/z 221+[HexA]6；m/z 221+[HexA]7；m/z 361+[HexA]1；m/z 361+[HexA]2；m/z 361+[HexA]3；m/z 361+[HexA]4；m/z 361+[HexA]5；m/z 361+[HexA]6；m/z 551+[HexA]1；m/z 551+[HexA]2；m/z 551+[HexA]3；m/z 551+[HexA]4；m/z 551+[HexA]5；m/z 555+[HexA]1；m/z 555+[HexA]2；m/z 555+[HexA]3；m/z 604+[HexA]1；m/z 604+[HexA]2；m/z 604+[HexA]3；m/z 604+[HexA]4；或它們的組合。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在個(gè)體中診斷癌癥的階段的方法，所述方法包括(a)從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在第一癌癥標(biāo)記，其中所述第一癌癥標(biāo)記選自1HexNAc:1Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO3H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO3H；2HexNAc:3Hex:1SO3H；4HexNAc:1Hex:1SO3H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO3H；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex:1Fuc；4HexNAc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；或它們的組合；以及(c)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在第二癌癥標(biāo)記，其中所述第二癌癥標(biāo)記選自1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1NeuGc:1Fuc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；1HexNAc:1Hex:1SO3H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO3H；1HexNAc:2Fuc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；或它們的組合，其中存在所述第一癌癥標(biāo)記而不存在所述第二癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有早期癌癥，而存在第二癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有晚期癌癥。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述早期癌癥是早期卵巢癌。在某些例子中，所述早期卵巢癌與低CA 125水平相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述晚期癌癥是晚期卵巢癌。在某些例子中，所述晚期卵巢癌與高CA 125水平相關(guān)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)″早期卵巢癌″是指階段I或階段IIA卵巢癌，而術(shù)語(yǔ)″晚期卵巢癌″是指階段IIB-階段IV卵巢癌。實(shí)施例9說(shuō)明了在早期卵巢癌和晚期卵巢癌是否存在上述各癌癥標(biāo)記。
在還有另一方面，本發(fā)明提供了一種癌癥標(biāo)記，其包含具有選自下組的組分的O-連接寡糖1HexNAc:1Hex:1SO3H；1HexNAc:3Hex:1Fuc:1SO3H；2HexNAc:1Hex:2Fuc:1SO3H；2HexNAc:3Hex:1SO3H；4HexNAc:1Hex:1SO3H；2HexNAc:2Hex:2Fuc:1SO3H；5HexNAc:1Hex:1Fuc:1SO3H；1HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:2Hex:1NeuAc；2HexNAc:1NeuAc:1Fuc；2HexNAc:1Hex:1NeuAc；1HexNAc:3Hex:1NeuAc；3HexNAc:1Hex:1NeuAc:3Fuc；1HexNAc:1Hex:1NeuGc:1Fuc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc；2HexNAc:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:1NeuGc；1HexNAc:2Hex:1NeuGc:1Fuc；3HexNAc:4Hex:1NeuGc；1HexNAc:2Fuc；2HexNAc:2Fuc；2HexNAc:1Hex；1Fuc；4HexNAc；1HexNAc:2Hex:2Fuc；4HexNAc:1Hex；1HexNAc:3Hex:2Fuc；1HexNAc:4Hex:1Fuc；3HexNAc:1Hex:2Fuc；2HexNAc:4Hex:1Fuc；6HexNAc；3HexNAc:3Hex:2Fuc；4HexNAc:3Hex:1Fuc；2Hex；1HexNAc:1Hex；3Hex；1HexNAc:2Hex；3Hex:1HexNAc；1Hex*:2Hex:1HexNAc；4Hex:1HexNAc；3Hex:2HexNAc；1Hex*:2Hex:2HexNAc；4Hex:2HexNAc；1Hex*:3Hex:2HexNAc；5Hex:2HexNAc；4Hex:3HexNAc；5Hex:3HexNAc；1Hex*:4Hex:3HexNAc；2Hex*:3Hex1HexNAc；m/z221+[HexA]1；m/z221+[HexA]2；m/z221+[HexA]3；m/z221+[HexA]4；m/z221+[HexA]5；m/z221+[HexA]6；m/z221+[HexA]7；m/z361+[HexA]1；m/z361+[HexA]2；m/z361+[HexA]3；m/z361+[HexA]4；m/z361+[HexA]5；m/z361+[HexA]6；m/z551+[HexA]1；m/z551+[HexA]2；m/z551+[HexA]3；m/z551+[HexA]4；m/z551+[HexA]5；m/z555+[HexA]1；m/z555+[HexA]2；m/z555+[HexA]3；m/z604+[HexA]1；m/z604+[HexA]2；m/z604+[HexA]3；m/z604+[HexA]4；或它們的組合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合于O-連接寡糖的抗體。在某些例子中，所述抗體還包含與其結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記的例子包括但不限于熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、Cy2、Cy3、Cy5、生物素、辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。
在還有一方面，本發(fā)明提供了一種在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的特異性結(jié)合于癌癥標(biāo)記的抗體。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體的治療有效量為能夠預(yù)防或緩解一種或多種癌癥相關(guān)癥狀的量。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種寡糖陣列，該陣列包含固定于固相載體上的多種O-連接寡糖。適宜的固相載體的例子包括但不限于紙、膜、濾器、芯片、針和玻璃。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含(a)含有多種癌癥標(biāo)記的陣列；(b)特異性結(jié)合于所述陣列上的多種癌癥標(biāo)記的多種抗體；以及(c)在獲自所述個(gè)體的樣品中使用所述陣列和所述多種抗體的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)。
在某些例子中，所述多種抗體還可包含與其結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記。可檢測(cè)標(biāo)記的例子如上所述。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含(a)特異性結(jié)合于癌癥標(biāo)記的抗體；以及(b)使用所述抗體的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)。
V.癌癥的糖生物學(xué)糖基化作用對(duì)于生化環(huán)境高度敏感，其已涉及到發(fā)育和疾病(Dennis等，BioEssays，21412-421(1999))。事實(shí)上，癌細(xì)胞產(chǎn)生與正常細(xì)胞明顯不同的寡糖(Hollingsworth等，id；Dall′Olio等，GlyconJ.J，18841-850(2001)；Brockhausen，Biochim.Biophys.Acta，147367-95(1999)；Yogeeswaran，《癌癥標(biāo)記診斷和發(fā)育中的重要性，“Cancer MarkersDiagnostic andDevelopmental Significance”，Humana Press，Clifton，NJ，(1980)；Yamori等，Cancer Res.，472741-2747(1987)；Gorelik等，Cancer Metastasis Rev.，20245-277(2001)》。另外，根據(jù)癌細(xì)胞的類(lèi)型不同，可產(chǎn)生不同比例的特異性糖蛋白。
對(duì)粘蛋白及其寡糖的分析由于其大小和異質(zhì)性而變得復(fù)雜。就其大小和異質(zhì)性而言，CA 125是一種典型的粘蛋白糖蛋白，可將其作為粘蛋白復(fù)雜性以及對(duì)其進(jìn)行分析的難度的有用例證。雖然已將CA 125廣泛用作癌癥標(biāo)記且早在1983年就發(fā)現(xiàn)了CA 125，它的許多O-和N-聚糖結(jié)構(gòu)是在最近才被表征的(Wong等，J.Biol.Chem.，27828619-28634(2003))。CA 125的核心蛋白序列包含超過(guò)10,000個(gè)氨基酸，其分子量約為250萬(wàn)道爾頓(O′Brien等，Tumour Biol.，12154-169(2002))。以該質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)，CA 125的碳水化合物含量估計(jì)至少為25％，其中大部分是O-連接的聚糖。加合的質(zhì)量表明CA125的平均分子量實(shí)際上約為350萬(wàn)道爾頓。
常發(fā)現(xiàn)腺癌中會(huì)產(chǎn)生高水平的粘蛋白。粘蛋白主要有兩類(lèi)分泌型和細(xì)胞表面型。這兩類(lèi)具有許多相同的結(jié)構(gòu)特征。由于糖基化對(duì)于生化環(huán)境的高度敏感，癌細(xì)胞產(chǎn)生與正常細(xì)胞明顯不同的寡糖。因此，來(lái)自癌細(xì)胞的粘蛋白不僅過(guò)表達(dá)，而且還發(fā)生糖基化異常。雖然從分析的角度而言粘蛋白的重度O-糖基化使得它們更難處理，異常糖基化的粘蛋白卻可作為細(xì)胞糖基化機(jī)構(gòu)中分化依賴(lài)性波動(dòng)的敏感指示劑。粘蛋白的過(guò)表達(dá)和粘蛋白的糖基化形式異常通常是繼腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中粘蛋白核心蛋白及其修飾酶的異常表達(dá)之后發(fā)生的。
估計(jì)總蛋白中的50％是糖基化的，使其成為最常見(jiàn)的翻譯后修飾形式。糖基化作用分為兩類(lèi)O-和N-糖基化。N-糖基化是通過(guò)在蛋白質(zhì)的天冬氨酰殘基上加入N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)而起始的。然后通過(guò)起始的GlcNAc將第二個(gè)GlcNAc和三甘露糖基殼二糖基核心結(jié)構(gòu)連接到該蛋白質(zhì)上。
O-糖基化的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性遠(yuǎn)甚于N-糖基化。O-聚糖通常連接于蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基。O-糖基化起始發(fā)生的最常見(jiàn)形式是通過(guò)加入N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。例如，重度O-糖基化蛋白(例如粘蛋白)在重復(fù)的富含Ser-和Thr-肽基序中含有基于GalNAc的聚糖群。然而，與N-聚糖不同，至少已知有八種核心O-聚糖結(jié)構(gòu)(圖1)。核心1和核心2是最常見(jiàn)的。核心3和核心4與特異性組織相關(guān)，而其它核心結(jié)構(gòu)則少量存在或存在于非常特定類(lèi)型的癌細(xì)胞中。核心1和核心2的特征是Gal β1-3連接于起始的GalNAc。核心2是將GlcNAc通過(guò)β1-6連接進(jìn)一步加到起始的GalNAc而形成的。
在正常細(xì)胞中，O-聚糖結(jié)構(gòu)上的骨架區(qū)是如下形成的加入重復(fù)二糖元件(例如Galβ1-4GlcNAc或Galβ1-3GlcNAc)以產(chǎn)生具有多達(dá)20個(gè)單糖殘基的聚乳糖胺型(polylactosamine-type)結(jié)構(gòu)。然后用其它類(lèi)型的單糖殘基截短這些重復(fù)單元，所述的單糖殘基包括但不限于海藻糖和唾液酸，(如N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)；圖2)。糖基化事件序列在許多競(jìng)爭(zhēng)性糖基轉(zhuǎn)移酶的存在下發(fā)生，并產(chǎn)生寡糖間的精確連接。因?yàn)樯贁?shù)糖基化轉(zhuǎn)移酶的缺失或過(guò)表達(dá)會(huì)極大地改變所得寡糖的結(jié)構(gòu)，所以糖基化對(duì)于生化環(huán)境高度敏感。
在癌癥中，結(jié)合的O-聚糖結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞相比發(fā)生驚人的改變。例如，?？捎^察到截短的O-聚糖(Van den Steen等，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，33151-208(1998))。對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究揭示在大多數(shù)癌細(xì)胞中，MUCI上不存在基于核心2的聚乳糖胺，這是由UDP-GIcNAc/核心1β6-N-十六烷基葡萄胺基轉(zhuǎn)移酶(C2GnT)的活性降低和/或缺乏造成的，該酶負(fù)責(zé)通過(guò)將β GlcNAc加到起始GalNAc殘基的6位以形成核心。(Hanisch等，Eur.J BioChem.，236318-327(1996)；Lloyd等，J.Biol.Chem.，27133325-33334(1996)；Brockhausen等，Eur.J.BioChem.，233607-617(1995))。由此形成了前體結(jié)構(gòu)(例如GalNAc-Ser/Thr和Gal β1-3GalNAc-Ser/Thr)，并成為唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物。唾液酸的加入在正常細(xì)胞中是一種重要的功能。已克隆的不同唾液酸轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量大致達(dá)到了20種，這是對(duì)該反應(yīng)重要性的一種證明(HarduiN-Lepers等，Biochemie，83727-737(2001))。唾液酸作為生物合成終止物防止了聚糖鏈的進(jìn)一步延伸。例如，α3-和α6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的過(guò)表達(dá)造成產(chǎn)生具有短聚糖鏈和高度唾液酸化的粘蛋白。將此類(lèi)短鏈寡糖作為臨床重要的腫瘤抗原已引起了很大的興趣，其中包括眾所周知的唾液酸-Tn(sialyl-Tn，STn)抗原(Sia α2，6-GalNAc-O-Ser/Thr)(Dall′Olio等，GlyconJ.J，18841-850(2001)；Yonezawa等，Am.J.Clin.Pathol.，98167-174(1992)；Itzkowitz等，Cancer Res.，49197-204(1989)；Thor等，Cancer Res.，463118-3124(1986)；Werther等，Br.J.Cancer，69613-616(1994))。包括乳腺癌和卵巢癌在內(nèi)的大多數(shù)腺癌表達(dá)STn。相反，在正常組織中極少存在STn。其它短鏈寡糖包括唾液酸-路易斯酸x(Si-Lex，NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc)和唾液酸-路易斯酸a(Si-Lea，NeuAcα2-3Galβ1-3[Fucα1 -4]GlcNAc)，它們被用于檢測(cè)胃腸道和胰腺癌(Fernandez-Rodriguez等，GlyconJ.J.，18925-930(2001))。
癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)糖基化的另一變化是加入在人體中不常見(jiàn)的唾液酸類(lèi)型，即N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)(圖2)。NeuGc富含于其它哺乳動(dòng)物(例如大型猿類(lèi))中，但在人體中僅以痕量存在(Varki，Biochimie，83615-622(2001)；Malykh等，Biochimie，83623-634(2001))。事實(shí)上，人體中NeuGc的量通常少于唾液酸總量的1％。確信NeuGc不是在人類(lèi)中起源的，而是通過(guò)代謝加入的。雖然已報(bào)道了在獲自腫瘤組織和癌癥患者的細(xì)胞中NeuGc表達(dá)上調(diào)，癌組織中提高水平NeuGc的存在仍然是有爭(zhēng)議的(Tangvoranuntakul等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)，10012045-12050(2003))。證實(shí)NeuGc存在的問(wèn)題在于分析的方法，大部分研究?jī)H采用抗體分析監(jiān)測(cè)NeuGc水平。然而，已采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)，從經(jīng)唾液酸酶處理的獲自子宮粘膜癌患者腹水的粘蛋白中檢測(cè)到了NeuGc殘基(Devine等，Cancer Res.，515826-5836(1991))，并通過(guò)氣相色譜(GC)-MS從分離自乳腺管癌(ductal mammary carcinoma)的粘蛋白中檢測(cè)到了NeuGc殘基(Hanisch等，Eur.J.BioChem.，236318-327(1996))。
正常細(xì)胞和癌細(xì)胞間硫酸化寡糖數(shù)量的差異代表了癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)糖基化的另一變化。硫酸化寡糖通常為糖蛋白(例如粘蛋白)加入凈負(fù)電荷。寡糖上的硫酸根掩蔽了下方的抗原，并保護(hù)粘蛋白免遭細(xì)菌糖苷酶的降解。硫酸化寡糖還涉及到細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)因子遞呈、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及炎癥(Delcommenne等，《糖生物學(xué)》，“Glycobiology”，12613-622(2002))。在寡糖的生物合成中，硫酸化作用能阻斷通道、使分枝轉(zhuǎn)向并延長(zhǎng)反應(yīng)(Brockhausen，BioChem.Soc.Trans.，31318-325(2003))。已報(bào)道癌性結(jié)腸粘膜中粘蛋白的硫酸根含量降低(Yamori等，Cancer Res.，472741-2747(1987)；Raouf等，Clin.Sci，83623-626(1992))，在乳腺癌細(xì)胞中也是如此(Brockhausen等，Eur.J.BioChem.，233607-617(1995))。也已分離出特異性粘蛋白降解硫酸酶，表明這些酶的機(jī)能亢進(jìn)導(dǎo)致粘蛋白的低硫酸化(Corfield等，GlyconJ.J.，13809-822(1996))。
VI.寡糖的質(zhì)譜可由9種人體中常見(jiàn)單糖組裝而成且具有連接鍵、分枝和端基異構(gòu)性變化的超過(guò)1500萬(wàn)種四糖中，寡糖的復(fù)雜性是顯而易見(jiàn)的。另外，許多常見(jiàn)單糖是具有相同質(zhì)量的立體異構(gòu)體。已開(kāi)發(fā)了運(yùn)用核磁共振(NMR)和質(zhì)譜對(duì)寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)闡明的多種策略。NMR是可提供寡糖完整結(jié)構(gòu)的僅有的一種光譜法；然而，靈敏度的限制妨礙了將NMR用于幾乎全部最豐富種類(lèi)的寡糖(Plancke等，Eur.J.BioChem.，231434-439(1995)；Strecker等，《糖生物學(xué)》，“Glycobiology”，5137-146(1995)；Dell等，Carbohydr.Res.，11541-52(1983))。該分析也是復(fù)雜的，且需要漫長(zhǎng)的測(cè)試和解讀NMR譜。另外，由于寡糖樣品常是高度異質(zhì)并含有豐度可相差多個(gè)量級(jí)的多種成分，通常需要進(jìn)行嚴(yán)格的分離以便用NMR進(jìn)行清楚的說(shuō)明。
結(jié)構(gòu)異質(zhì)性、復(fù)雜性和樣品的限制使得寡糖分析極適于用質(zhì)譜法(MS)進(jìn)行。例如，已采用質(zhì)譜法從粘蛋白中鑒別除了O-連接寡糖，例如MUC2(Alving等，J.Mass Spectrom.，34395-407(1999))和MUC4(Alving等，J.MassSpectrom.，331124-1133(1998))。也已采用高速原子轟擊(FAB)-MS和氣相色譜(GC)-MS鑒別了與乳腺癌相關(guān)的O-連接寡糖MUC1(Hanisch等，Eur.J.BioChem.，236318-327(1996))。另外，通過(guò)質(zhì)譜表征了與CA 125相關(guān)的N-和O-聚糖(MUC16)(Wong等，J.Biol.Chem.，27828619-28634(2003))。
矩陣輔助激光解吸電離(MALDI)(Karas等，Anal.Chem.，602299-2301(1988))和電噴射離子化(ESI)(Fenn等，Science，24664-71(1989)；Yamashita等，J.Phys.Chem.，884451-4459(1984))的應(yīng)用顯著提高了寡糖質(zhì)譜的靈敏度(Spengler等，Anal.Chem.，621731-1737(1990)；Stahl等，Anal.Chem.，631463-1466(1991)；Powell等，Rapid Commun.Mass Spectrom.，101027-1032(1996)；Harvey等，Org.Mass Spectrom.，29753-766(1994)；Cancilla等，Anal.Chem.，70663-672(1998))。碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)提供了大量的結(jié)構(gòu)信息。例如，堿金屬配位種類(lèi)(alkali metal-coordinated species)的CID提供了關(guān)于分枝和連接鍵的信息(Dell等，Carbohydr.Res.，11541-52(1983)；Aubagnac等，Org.MassSpectrom.，18361-364(1983)；Barofsky等，Int.J.MassSpectrom.Ion Phys.，53319-322(1983)；Burlingame等，Anal.Chem.，56417R-467R(1984)；Burlingame等，Anal.Chem.，58165R-211R(1986)；Carroll等，Anal.Chem.，651582-1587(1993)；Dell等，Mass Spectrom.Rev.，3357-394(1984)；Domon等，Glycoconjugate J.，5397-409(1988)；Angel等，Carbohydrate Research，22117-35(1991)；Dell等，Int.J.MassSpectrom.IonPhys。，46415-420(1983)；Dell等，Carbohydr.Res.，12095-111(1983)；Forsberg等，J.Biol.Chem.，2573555-3563(1982)；Konig等，J.Am.Soc.MassSpectrom.，91125-1134(1998))。甚至可通過(guò)將寡糖與過(guò)渡金屬配位，然后進(jìn)行ESI和CID來(lái)獲得立體化學(xué)信息(Konig等，同前)。然而，采用CID的結(jié)構(gòu)測(cè)定需要進(jìn)行多輪串聯(lián)MS，以獲得完整的寡糖序列。帶有吡喃糖還原端的寡糖的CID還可產(chǎn)生海藻糖(一種常見(jiàn)的端末殘基)的無(wú)差別缺失，因此掩蔽了其在鏈中的位置(Cancilla等，J.Am.Chem.Soc.，1186736-6745(1996)；Penn等，Anal.Chem.，682331-2339(1996))。另外，CID中還遇到通過(guò)分子內(nèi)重排造成的內(nèi)部糖殘基缺失的困難(Brull等，J.Am。Soc.Mass Spectrom.，843-49(1997))。
本發(fā)明通過(guò)采用IRMPD測(cè)定寡糖結(jié)構(gòu)克服了這些缺陷。采用IRMPD有其優(yōu)點(diǎn)，這是因?yàn)榭色@得直到最末殘基的代表性寡糖片段。由此，可在單次試驗(yàn)中完成對(duì)甚至較大的寡糖的完全測(cè)序。在進(jìn)行IRMPD分析之前，采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(例如MALDI-傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS))來(lái)鑒別樣品中的寡糖種類(lèi)(參見(jiàn)Tseng等，Anal.BioChem.，25018-28(1997)；Tseng等，Anal.Chem.，713747-3754(1999))。具體而言，F(xiàn)TMS提供了精確的質(zhì)量測(cè)定(即，常規(guī)＜10ppm，有內(nèi)校準(zhǔn)時(shí)＜5ppm)的能力對(duì)于獲得基本的寡糖組成是很重要的。例如，在m/z 2201.819具有準(zhǔn)分子離子的寡糖在±0.1質(zhì)量單位的公差中具有三種可能的組分。僅具有0.01質(zhì)量單位的公差的是所得的校正組合物2個(gè)海藻糖(Fuc)、4個(gè)己糖(Hex)和6個(gè)N-乙酰氨基己糖(HexNAc)。根據(jù)本發(fā)明的方法使用MALDI-FTMS可從多種可能的組成中提供正確的組成。用MALDI產(chǎn)生的離子進(jìn)行多階段的串聯(lián)MS的能力是本發(fā)明質(zhì)譜方法的另一重要特征。
VII.實(shí)施例提供以下實(shí)施例是為了說(shuō)明，而不是為了限制所要求的發(fā)明。
實(shí)施例1.對(duì)卵巢癌細(xì)胞系上清液的分析本實(shí)施例舉例說(shuō)明了獲自4種卵巢癌細(xì)胞系上清液中的O-連接寡糖的提取和質(zhì)譜分析。
圖3所示為釋放和分離O-連接寡糖的過(guò)程。其相對(duì)較快且無(wú)需HPLC分離。事實(shí)上，可在短于12小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成從提取O-連接寡糖到質(zhì)譜分析的整個(gè)過(guò)程。用固相萃取法對(duì)寡糖成分進(jìn)行預(yù)濃縮，然后不經(jīng)任何其它純化，用質(zhì)譜法分析整個(gè)混合物。該過(guò)程僅需使用1.0μl的細(xì)胞上清液(相當(dāng)于22μg的凍干原料)來(lái)獲得全面的O-連接寡糖分布。
對(duì)上清液進(jìn)行透析以去除大部分鹽類(lèi)和小分子。所余的均為大的蛋白質(zhì)，包括所有糖基化的蛋白質(zhì)。在優(yōu)化條件下，用硼氫化鈉(NaBH4)釋放大部分O-連接寡糖(Morelle等，Eur.J.Biochemistry，252253-260(1998))。同樣地，通過(guò)選擇僅適于O-連接寡糖的釋放條件(例如溫度和時(shí)間)使N-連接寡糖的釋放最小化。其實(shí)，仔細(xì)檢查根據(jù)上述方法制備的樣品的質(zhì)譜會(huì)發(fā)現(xiàn)不存在N-連接寡糖，該N-連接寡糖可很容易地由其較大的尺寸和特殊核心的存在鑒別出。用多孔石墨化碳(PGC)固相萃取裝置進(jìn)行寡糖成分的濃縮。這些柱體易于結(jié)合中性和陰離子性寡糖。鹽類(lèi)很容易通過(guò)，而保留了肽和蛋白質(zhì)。通過(guò)采用適當(dāng)?shù)南疵撊軇┙M合，可從陰離子性成分中單獨(dú)分離出中性寡糖。
檢測(cè)了對(duì)數(shù)期和死亡期(log and dead phase)的卵巢癌細(xì)胞系(表1)。在指定的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10％胎牛血清、100單位/ml的青霉素/鏈霉素和1％谷氨酰胺。在McCoy氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)ES-2和SKOV-3細(xì)胞，在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)OVCAR-3和CaOV-3細(xì)胞。從處于細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(非融合)或死亡期(融合)的細(xì)胞去除條件培養(yǎng)基，并冷凍到-70℃。使CM解凍，無(wú)菌過(guò)濾(0.2μm的濾器)，用Vivacell 70或Vivaspin 20濃縮器(VivaScience)進(jìn)行濃縮?；蛘?，用蒸餾水對(duì)濾過(guò)的CM進(jìn)行透析，然后冷凍干燥。然后按照?qǐng)D3所示的過(guò)程對(duì)所得溶液進(jìn)行處理。為了使分析時(shí)間最短，未嘗試對(duì)寡糖成分進(jìn)行分離。用納米純水透析細(xì)胞培養(yǎng)上清液(10k MW截留)以去除鹽類(lèi)和小分子。所得溶液僅含包括粘蛋白在內(nèi)的大蛋白質(zhì)。然后冷凍干燥該溶液，用NaBH4和NaOH在42℃下處理6小時(shí)。在這些條件下，僅釋放出O-連接寡糖。使樣品通過(guò)帶有PGC的固相萃取柱以釋放硼酸鹽和鈉離子，并分離寡糖成分。用3種乙腈和水比例的洗脫液釋放寡糖。用遞增的乙腈水溶液百分比(即10％、20％和40％)獲得三個(gè)部分。作為對(duì)照，根據(jù)圖3所示的過(guò)程對(duì)空白培養(yǎng)基和純胎牛血清(FBS)進(jìn)行處理。從兩種對(duì)照樣品中得到了少于測(cè)試樣品中寡糖數(shù)量?jī)蓚€(gè)數(shù)量級(jí)的少量寡糖(＜10)。另外，未在測(cè)試樣品中觀察到對(duì)照樣品中的任何一種寡糖。
表1.卵巢癌細(xì)胞系
各乙腈部分含有不同的寡糖分布。例如，10％乙腈部分含有所有4種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)物中的大部分陰離子型唾液酸化的小O-連接寡糖。圖4顯示了獲自用10％乙腈溶液從PGC柱體釋放的OVCAR-3的CM的樣品的陽(yáng)離子(圖4A)質(zhì)譜和陰離子(圖4B)質(zhì)譜。兩種譜圖均顯示了小的陰離子型O-連接寡糖。陽(yáng)離子圖譜顯示更多的化學(xué)噪音，而陰離子圖譜則更清晰地顯示了這些陰離子。觀察到兩類(lèi)唾液酸化的O-連接寡糖(1)含N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的O-連接寡糖；和(2)含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)的O-連接寡糖。另外，還存在多種顯著的O-連接寡糖，包括具有組分1 Hex:1 NeuGc(m/z488.169)和1 HexNAc:1NeuGc(m/z529.122)的兩種二糖。由于小的陰離子型O-連接寡糖的存在指示了蛋白質(zhì)糖基化的異常，可將這些寡糖用作檢測(cè)腺癌(例如卵巢癌)的標(biāo)記。
40％乙腈部分含有明顯更多更大的寡糖。圖5所示為獲自用40％乙腈溶液以PGC柱體釋放的OVCAR-3的CM的樣品的陽(yáng)離子質(zhì)譜。在40％乙腈部分中檢測(cè)到的幾乎全部信號(hào)與寡糖對(duì)應(yīng)。該圖譜顯示了中性、硫酸化和唾液酸化(即NeuAc和NeuGc)O-連接寡糖。在m/z2200附近觀察到最大的寡糖，其對(duì)應(yīng)于10-12聚體，明顯小于正常細(xì)胞中觀察到的20聚體。雖然樣品中的寡糖幾乎全部存在于10％和40％乙腈部分中，20％部分仍含有寡糖。
傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)的高質(zhì)量精度通常足以鑒別寡糖峰，即便是在復(fù)雜的質(zhì)譜中。為證實(shí)組成和獲得序列信息，分離乙腈部分的某些離子，進(jìn)行串聯(lián)MS。為獲得片段(fragmentation)，采用了紅外多光子解離(IRMPD)而不是碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)。IRMPD具有多種優(yōu)點(diǎn)(1)無(wú)需碰撞氣體，從而提高了重現(xiàn)率和每圖譜中的掃描數(shù)；和(2)片段保留在降解束(degradative beam)，在單次串聯(lián)MS(MS2)試驗(yàn)中?？色@得直至最末殘基的完整序列。標(biāo)準(zhǔn)CID試驗(yàn)常需以MS3，甚至MS4來(lái)獲得序列中的最末殘基。
采用IRMPD評(píng)估了多種小的陰離子型寡糖種類(lèi)。例如，圖6顯示了分離并進(jìn)行IRMPD的含NeuGc的具有對(duì)應(yīng)于1 HexNAc:1 NeuGc(m/z529.122)組分離子種類(lèi)的質(zhì)譜。采用IRMPD在陰離子模式中對(duì)離子m/z529.122進(jìn)行分析得出譜圖，其中觀察失去CO2，這與羧酸的存在是一致的。HexNAc-ol的缺失表明還原端對(duì)應(yīng)于HexNAc殘基，而所余的質(zhì)量m/z325對(duì)應(yīng)于NeuGc。由此，IRMPD分析揭示了1 HexNAc:1 NeuGc(m/z529.122)離子型種類(lèi)結(jié)構(gòu)是NeuGcα2-6GalNAc?？刹捎锰擒胀馇忻傅南瘉?lái)驗(yàn)證該結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)例如，Xie等，J.Am.Soc.Mass Spetrom.，12877-884(2001))。同樣地，用本發(fā)明的方法很容易檢測(cè)小的O-連接寡糖和含NeuGc的寡糖并對(duì)其精確鑒定。
還可觀察到含NeuAc的寡糖。例如，圖7所示為分離并進(jìn)行IRMPD的含NeuAc離子m/z902.322的質(zhì)譜。該離子豐度不強(qiáng)；然而，該質(zhì)量對(duì)應(yīng)于具有唾液酸-Lex的抗原的四糖。采用IRMPD在陽(yáng)離子模式中進(jìn)行離子分析得到圖譜，其中觀察到缺失NeuAc(m/z610)，然后是Hex(m/z447)，然后是HexNAc(m/z244)殘基缺失。醛糖醇形式的還原端是HexNAc，例如GalNAc。由此，IRMPD分析揭示了m/z902.322離子種類(lèi)結(jié)構(gòu)是GlcNacβ1-6(NeuAcα2-3Galβ1-3)GalNAc?？刹捎锰擒胀馇忻傅南瘉?lái)驗(yàn)證該結(jié)構(gòu)。
對(duì)于衍生自O(shè)VCAR-3細(xì)胞的O-連接寡糖的總結(jié)示于表2中。從其它3種細(xì)胞系中獲得類(lèi)似的O-連接寡糖質(zhì)譜和組成。圖8顯示了4種卵巢癌細(xì)胞系的中性、硫酸化、NeuAc和NeuGc O-連接寡糖的分布。例如，從OVCAR-3細(xì)胞的CM中觀察到至少57種不同的質(zhì)量。
表2.采用MALDI-FTMS在OVCAR-3細(xì)胞中鑒定到的寡糖組分
在陽(yáng)離子和陰離子模式中通過(guò)精確質(zhì)量分析測(cè)定組成。
R.I.＝相對(duì)強(qiáng)度。S＝強(qiáng)；M＝中等；W＝弱。
可從對(duì)這4種癌細(xì)胞系的分析中得出多個(gè)結(jié)論(1)所得寡糖是小的，且對(duì)應(yīng)于獲自糖蛋白(如粘蛋白)的O-連接種類(lèi)；(2)表示出了已知存在于癌細(xì)胞中的寡糖；和(3)在這4種細(xì)胞系中有許多共有的寡糖，但也有各細(xì)胞系特異性的獨(dú)特寡糖。
實(shí)施例2.癌癥患者的血清分析本實(shí)施例舉例說(shuō)明了對(duì)獲自卵巢癌患者血清的O-連接寡糖的提取和質(zhì)譜分析。
以圖3所示的過(guò)程檢測(cè)獲自患者的具有極高CA 125水平(11621單位/ml)的血清。用標(biāo)準(zhǔn)的臨床步驟從全血中分離血清。以用于CA 125的AXSYM測(cè)試法(Abbott)對(duì)血清CA 125進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試后，用納米純水對(duì)血清(1.5ml)進(jìn)行充分透析并冷凍干燥，得到20mg粉末。用NaBH4和NaOH處理部分(2mg)，并如上所述地加工，用質(zhì)譜分析細(xì)胞上清液。
圖9所示為用20％乙腈從PGC柱洗脫的部分的陰離子質(zhì)譜。圖10所示為用40％乙腈從PGC柱洗脫的部分的陽(yáng)離子質(zhì)譜。雖然兩種質(zhì)譜圖中均含有陰離子型寡糖，在20％乙腈洗脫的部分中觀察到小的陰離子型寡糖，而在40％乙腈洗脫的部分中觀察到較大的陰離子型寡糖。小的陰離子型寡糖尤其適于用作診斷腺癌(例如卵巢癌)的標(biāo)記，而較大的陰離子型寡糖尤其適于用作區(qū)分不同腺癌(例如卵巢癌和乳腺癌)的標(biāo)記。
衍生自血清樣品的O-連接寡糖的總結(jié)示于表3中。根據(jù)精確的質(zhì)量，證實(shí)質(zhì)譜中的各峰代表了一種寡糖。另外，用串聯(lián)MS驗(yàn)證了約10個(gè)峰。如表3中所示，在有高CA 125水平的患者的全面O-連接寡糖分布中，存在5種含NeuGc的寡糖和8種含NeuAc的寡糖。在該寡糖組中鑒別到了小的唾液酸化寡糖，其具有例如如下的組成1NeuAc:1HexNAc、1NeuGc:1Hex、1NeuGc:1HexNAc和1NeuGc:1Hex:2HexNAc。由于小的陰離子型寡糖的存在指示了蛋白質(zhì)糖基化中的異常，這些小的唾液酸化寡糖可用作腺癌(例如卵巢癌)檢測(cè)中的標(biāo)記。
表3.采用MALDI-FTMS在癌癥患者血清中鑒定到的寡糖組分
在陽(yáng)離子和陰離子模式中通過(guò)精確質(zhì)量分析測(cè)定組成。
R.I.＝相對(duì)強(qiáng)度。S＝強(qiáng)；M＝中等；W＝弱。
為證實(shí)用MALDI-FTMS鑒別的離子分配并獲得結(jié)構(gòu)信息，分離某些離子，用IRMPD進(jìn)行進(jìn)一步分析。例如，分離圖譜的離子m/z529，對(duì)其進(jìn)行IRMPD分析。該離子的圖譜與獲自卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3的同質(zhì)量離子相同(參見(jiàn)圖6)。由此證實(shí)了卵巢癌患者血清中NeuGc的存在?？捎锰擒胀馇忻傅南瘉?lái)驗(yàn)證該離子種類(lèi)的結(jié)構(gòu)。同樣地，用本發(fā)明的方法可很容易地檢測(cè)血清樣品中的小的O-連接寡糖，并能很容易的檢測(cè)和精確鑒別血清樣品中的含NeuGc的寡糖。
實(shí)施例3.卵巢癌細(xì)胞系中寡糖標(biāo)記的鑒別本實(shí)施例舉例說(shuō)明了表1所示卵巢癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的寡糖的測(cè)定和比較。
將分離自各卵巢癌細(xì)胞系的寡糖分類(lèi)為中性、唾液酸化(例如，NeuAc和NeuGc)或硫酸化寡糖。另外，測(cè)定了常見(jiàn)寡糖和在各細(xì)胞系中獨(dú)特的寡糖。也可對(duì)各寡糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行說(shuō)明(參見(jiàn)下文的實(shí)施例4)。然后將所鑒別的寡糖與獲自患有癌癥的個(gè)體或未患有癌癥的個(gè)體的血清中那些寡糖進(jìn)行比較。另外，可建立在不同營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)基條件下的4種癌細(xì)胞系中鑒別出的寡糖的數(shù)據(jù)庫(kù)。作為對(duì)比，可對(duì)獲自正常組織(例如乳腺、卵巢、肝、結(jié)腸和肺)的人體細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。從正常組織中鑒別的寡糖與從癌細(xì)胞系中鑒別的寡糖的比較可用于說(shuō)明癌細(xì)胞系特異性的寡糖標(biāo)記。
還可測(cè)定各癌細(xì)胞系的含NeuGc的寡糖與含NeuAc的寡糖的比值，并與在正常組織中測(cè)得的比值進(jìn)行比較。在某些例子中，與正常組織相比，癌細(xì)胞系中的比值較高。另外，可對(duì)癌細(xì)胞系和正常組織中的硫酸化寡糖的量進(jìn)行比較。在某些例子中，與正常組織相比，癌細(xì)胞系中存在的硫酸化寡糖的百分比較低。
為證實(shí)已釋放并分離出粘蛋白的O-連接寡糖，可對(duì)獲自癌細(xì)胞系或人血清的細(xì)胞上清液或條件培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)進(jìn)行1-D凝膠分離。圖11顯示了用ProQ Emerald 300(Molecular Probes)(圖11A)或Sypro Ruby(Molecular Probes)(圖11B)染色的由4種卵巢癌細(xì)胞系中各自分離的蛋白質(zhì)的1-D凝膠。更具體而言，濃縮獲自卵巢癌細(xì)胞系ES-2(第2、6、11泳道)、SKOV-3(第3、7、12泳道)、CaOV-3(第4、8、13泳道)以及OVCAR-3(第5、9、14泳道)的條件培養(yǎng)基(CM)，用Cibracron Blue瓊脂糖(Sigma)進(jìn)行白蛋白去除，然后用SDS-PAGE(7.5％)進(jìn)行拆分。泳道1分子量標(biāo)記；泳道2-5用樣品Cibracron Blue處理后的樣品；泳道6-9溶于尿素/CHAPS緩沖液中的蛋白樣品；泳道10-13結(jié)合于Cibracronblue瓊脂糖并從中用SDS-PAGE樣品緩沖液洗脫出的蛋白質(zhì)。這些凝膠說(shuō)明了獲自條件培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)混合物的復(fù)雜性。白蛋白是最為豐富的種類(lèi)，且在大部分檢測(cè)方法中通常是飽和的。然而，在本實(shí)例中，已去除了大部分白蛋白。另外，碳水化合物染色指示了從其它蛋白質(zhì)中清楚地分離出粘蛋白糖蛋白(圖11A)。可收集凝膠上的糖蛋白并釋放寡糖以證實(shí)獲自條件培養(yǎng)基的寡糖代表了粘蛋白寡糖。
為確定含NeuGc的寡糖是產(chǎn)生于內(nèi)源性來(lái)源(例如細(xì)胞本身)還是外緣性來(lái)源(例如，條件培養(yǎng)基)，將癌細(xì)胞系培養(yǎng)在無(wú)胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中以去除含NeuGc的寡糖的內(nèi)源性來(lái)源。或者，可在已將細(xì)胞清洗到不含任何FBS后，將癌細(xì)胞培養(yǎng)在不含血清的培養(yǎng)基中?？稍跓o(wú)FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代細(xì)胞，在各代中監(jiān)測(cè)含NeuGc的寡糖相對(duì)于其它寡糖(例如含NeuAc的寡糖)的量。如果每代含NeuGc的寡糖的量遞減，則這些寡糖有可能是外源性來(lái)源的。也可對(duì)人血清樣品進(jìn)行此類(lèi)研究。
表4顯示了從培養(yǎng)于FBS培養(yǎng)基或不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中的ES2細(xì)胞的40％乙腈洗脫物中分離的寡糖種類(lèi)。結(jié)果表明含NeuGc的寡糖在兩種樣品中都存在。由于培養(yǎng)于不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中的細(xì)胞獲自血清營(yíng)養(yǎng)樣品中，可檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)樣品本身是否存在殘留的含NeuGc的寡糖。
表4.培養(yǎng)于含F(xiàn)BS或不含F(xiàn)BS血清中的ES-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中存在的寡糖種類(lèi)
還可測(cè)定各癌細(xì)胞系中的硫酸化寡糖數(shù)目。例如，OVCAR-3癌細(xì)胞系含有至少11種硫酸化寡糖，其中許多的豐度很高。圖5顯示了硫酸化寡糖種類(lèi)中的數(shù)種，例如m/z712.166、874.219、1077.298和1443.430。在4種測(cè)試的卵巢癌細(xì)胞系中均觀察到硫酸化寡糖。
實(shí)施例4.寡糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定本實(shí)施例舉例說(shuō)明了從卵巢癌細(xì)胞系或患者血清中鑒別的O-連接寡糖的基本和細(xì)微結(jié)構(gòu)的測(cè)定。
O-連接寡糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定對(duì)于鑒別適于檢測(cè)或診斷癌癥(例如腺癌)的標(biāo)記十分重要。同樣地，本發(fā)明提供了測(cè)定O-連接寡糖結(jié)構(gòu)的方法采用串聯(lián)MS獲得基本結(jié)構(gòu)，然后采用選擇性糖苷外切酶消化來(lái)確證這些結(jié)構(gòu)。
糖苷外切酶(例如糖苷酶陣列形式)常用于闡明N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)。然而，與推定結(jié)構(gòu)數(shù)目已知的N-連接寡糖不同，O-連接寡糖具有顯著更多的結(jié)構(gòu)組合。由此，使用糖苷酶陣列測(cè)定O-連接寡糖的結(jié)構(gòu)既昂貴又費(fèi)時(shí)。本發(fā)明利用獲自串聯(lián)MS試驗(yàn)(例如，碰撞介導(dǎo)的解離(CID)或IRMPD)的基本結(jié)構(gòu)，通過(guò)靶向性地使用糖苷外切酶消化，克服了該缺陷。因此，O-連接寡糖完全結(jié)構(gòu)的闡明過(guò)程包括了如下步驟。(1)獲得確切的質(zhì)量以確定殘基的大體組成(例如，N-乙酰己糖(HexNAc)、己糖(Hex)、海藻糖(Fuc)、N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)或N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc))；(2)采用CID或IRMPD測(cè)定基本結(jié)構(gòu)；(3)在基本結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行糖苷外切酶消化以確定殘基的身份、連接鍵和連接鍵端部異構(gòu)特性。
優(yōu)選地，采用IRMPD測(cè)定O-連接寡糖的結(jié)構(gòu)。使用IRMPD是很有利的，這是因?yàn)樗鼰o(wú)需碰撞氣體，由此提高了重現(xiàn)率和每譜圖的掃描數(shù)。此外，片段保留在降解束中，常可獲得直至最末殘基的完整序列。由此，可在單次試驗(yàn)中進(jìn)行甚至較大的寡糖的完整測(cè)序。例如，圖12顯示了分離自CaOV-3的含硫酸酯的寡糖的IRMPD譜圖。基于m/z1077.298的確切質(zhì)量(陽(yáng)離子模式，理論質(zhì)量1077.290)，將該離子鑒別為含3個(gè)HexNAc殘基、2個(gè)Hex殘基和一個(gè)硫酸根(圖12A)。然后采用標(biāo)準(zhǔn)FTMS技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)分子離子的分離。用11瓦特的激光能量照射該分離的離子0.75秒對(duì)其進(jìn)行碎裂(圖12B)。如圖12B所示，形成了多種產(chǎn)物離子，包括對(duì)應(yīng)于硫酸化醛糖醇HexNAc(即GalNAc)殘基的m/z347。圖12B還顯示了一旦碎裂，該準(zhǔn)分子離子在缺失HexNAc殘基和Hex殘基之間變化。此外，m/z388的離子被鑒別為HexNAc-Hex片段?；谶@些結(jié)構(gòu)和已知的癌癥糖生物學(xué)，隨后確定了寡糖的結(jié)構(gòu)(圖12B)。
可采用糖苷外切酶消化來(lái)證實(shí)寡糖的結(jié)構(gòu)。例如，可用Gal(β1-4)特異性的糖苷外切酶來(lái)確定末端的半乳糖是否能被切除。然后可用另一種糖苷外切酶N-乙?；?氨基葡萄糖苷酶來(lái)確定GlcNAc殘基的位置并證實(shí)其身份。也可對(duì)糖苷外切酶產(chǎn)物進(jìn)行IRMPD來(lái)確證該殘基的位置。
實(shí)施例5.寡糖標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)施例舉例說(shuō)明了采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在控制假陽(yáng)性的同時(shí)鑒別寡糖標(biāo)記，以及在寡糖分布的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)對(duì)癌癥進(jìn)行分類(lèi)和預(yù)測(cè)癌癥。還對(duì)卵巢細(xì)胞系、人血清(例如正常、卵巢癌和乳腺癌血清)的寡糖測(cè)定中的變異進(jìn)行了定量。
寡糖分布的統(tǒng)計(jì)分類(lèi)或預(yù)測(cè)分析與基因組和蛋白組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析類(lèi)似。同樣地，基于獲自卵巢癌細(xì)胞系和人血清的寡糖標(biāo)記分布，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類(lèi)/預(yù)測(cè)分析以區(qū)分正常和卵巢癌樣品。例如，為了預(yù)測(cè)具有不同CA 125水平(例如提高)的卵巢癌樣品，使用了以下方法統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)方法學(xué)(statistical learningmethodologies)，例如結(jié)合了判別式分析的維數(shù)縮減(dimensionreduction)(Nguyen等，Bioinforrnatics，1839-50(2002)；Nguyen等，Bioinformatics，181216-1226(2002))、支撐矢量機(jī)(support vector machine)(Furey等，Bionformatics，16906-914(2000)；Vapnik，《統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論》，“StatisticalLearning Theory”，Wiley-InterscienceNew York(1998))以及罰分判斷分析(penalized discriminant analysis)(Hastie等，《統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)元素?cái)?shù)據(jù)挖掘、推斷和預(yù)測(cè)》，“The elements of statistical learningData mining，inference，andprediction”，SpringerNew York，New York(2001))。在一系列訓(xùn)練樣品的基礎(chǔ)上建立預(yù)測(cè)模。從由未用于模型建立中的樣品組成的獨(dú)立數(shù)據(jù)組獲得在寡糖分布的基礎(chǔ)上對(duì)卵巢癌預(yù)測(cè)的模型驗(yàn)證和錯(cuò)誤率(Ambroise等，Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，996562-6566(2002)；Hand，《分類(lèi)規(guī)則的建立和評(píng)估》，“Construction and Assessment of Classification Rules”，John WileyChichester，England(1997))。
除了將一系列寡糖標(biāo)記(例如約50-70)用于癌癥預(yù)測(cè)和分類(lèi)分析中，可在獲自各樣品的完整寡糖質(zhì)譜的基礎(chǔ)上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。然后可用統(tǒng)計(jì)模型識(shí)別法鑒別癌癥樣品獨(dú)特的分布。例如，由于分子種類(lèi)多樣，可采用維度縮減技術(shù)，例如部分最小平方(partial least squares)(Nguyen等，Bioinformatics，1839-50(2002)；Nguyen等，Bioinformatics，181216-1226(2002))。還可將該技術(shù)用于鑒別特異性的寡糖標(biāo)記或寡糖標(biāo)記的組合，它們可預(yù)測(cè)癌癥的具體類(lèi)型。更具體而言，可將統(tǒng)計(jì)分類(lèi)和預(yù)測(cè)分析用于區(qū)分卵巢癌血清和乳腺癌血清。
還可用統(tǒng)計(jì)分析比較不同組樣品中寡糖表達(dá)水平，例如比較非疾病血清和卵巢癌血清，或具有不同CA125水平的卵巢癌血清。例如，可使用已開(kāi)發(fā)用于基因組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(Efron等，J.Am.Stat.AsSoc.，901151-1160(2001))。由于要比較的寡糖標(biāo)記的數(shù)目較大，可控制假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率(Nguyen等，Bioinformatics，1839-50(2002)；Nguyen等，Bioinformatics，181216-1226(2002)；Benjamini等，J.Royal Stat.Soc.B，57289-300(1995))。具有假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率的此類(lèi)比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可基于獲自大量重復(fù)的數(shù)據(jù)。除了重復(fù)抽樣以外，可通過(guò)使用相同血清樣品(即獲自固定個(gè)體)進(jìn)行多重試驗(yàn)，然后允許對(duì)測(cè)試過(guò)程中的變異進(jìn)行定量來(lái)獲得技術(shù)重復(fù)數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，技術(shù)變異性相對(duì)于取樣變異性是較低的。
實(shí)施例6.寡糖標(biāo)記的定量測(cè)定本實(shí)施例舉例說(shuō)明了采用質(zhì)譜法對(duì)人血清中的寡糖標(biāo)記進(jìn)行定量的方法。
在一種方法中，同時(shí)追蹤釋放自人血清的多種寡糖種類(lèi)，包括作為內(nèi)標(biāo)的獲自癌細(xì)胞系的寡糖。用NaBD4從細(xì)胞系中釋放寡糖，使得單個(gè)氘摻入醛糖醇產(chǎn)物中。定標(biāo)寡糖比血清寡糖高一個(gè)質(zhì)量單位，且不干擾分析。當(dāng)定標(biāo)物含有所有類(lèi)型的O-連接寡糖，例如中性、唾液酸化(NeuAc和NeuGc)以及硫酸化寡糖時(shí)，由于定標(biāo)物和被分析物受到同樣的抑制而使得抑制作用最小化?？捎糜糜诟黝?lèi)寡糖的已知標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定氘化標(biāo)準(zhǔn)寡糖的濃度。然后將獲自癌細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)寡糖溶液加入釋放自測(cè)試血清樣品的寡糖中。
在另一方法中，將市售內(nèi)標(biāo)，例如小的中性、唾液酸化(NeuAc和NeuGc)和/或硫酸化寡糖加入釋放自測(cè)試血清樣品的寡糖中。
在還有另一方法中，將天然存在的內(nèi)標(biāo)(例如存在于僅有的健康個(gè)體的血清中的寡糖)加入釋放自測(cè)試血清樣品的寡糖中。然后可監(jiān)測(cè)存在于僅有的健康個(gè)體中的寡糖與在測(cè)試血清樣品中表達(dá)的那些寡糖的比例，并將其用作疾病的指示。例如，可監(jiān)測(cè)獲自測(cè)試血清樣品的含NeuGc的寡糖與獲自?xún)H有的健康個(gè)體血清的含NeuAc的寡糖的比例，并將其用作疾病的指示。
實(shí)施例7.乳腺癌細(xì)胞的寡糖標(biāo)記的鑒別本實(shí)施例舉例說(shuō)明了用于乳腺癌特異性寡糖標(biāo)記鑒定的方法。
乳腺癌和卵巢癌具有許多共同的生物學(xué)特征，例如這兩種類(lèi)型的癌癥均涉及分泌粘蛋白的上皮細(xì)胞。另外，這兩種類(lèi)型的癌癥均產(chǎn)生小的陰離子型寡糖。由此，卵巢癌中鑒別的某些或全部寡糖標(biāo)記可用作乳腺癌的指示物。可檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的獨(dú)特寡糖以及乳腺癌和卵巢癌共有的寡糖。適于檢測(cè)的乳腺癌細(xì)胞系包括但不限于MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、MDA-MD-453和BT-474細(xì)胞系(獲自ATCC)。在37℃、5％CO2的條件下，使這些細(xì)胞系在含有10％FBS、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素/鏈霉素的DMEM或ATCC推薦的培養(yǎng)基中增殖。也可在無(wú)血清培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞系多次以去除任何剩余的肽牛血清(FBS)后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中使細(xì)胞系生長(zhǎng)2-7天?？蓮募?xì)胞去除條件培養(yǎng)基(CM)，無(wú)菌過(guò)濾(0.22μ)，并冷凍。處理樣品，如上所述地用堿性NaBH4通過(guò)β消除釋放O-連接寡糖。然后采用質(zhì)譜法分析所得寡糖。
MCF7細(xì)胞系是從胸膜腔積液腺癌中最初分離出的。BT-474是從實(shí)體侵潤(rùn)性乳腺管癌中分離出的。MDA-MB-453細(xì)胞系衍生自患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的癌癥患者的滲液。MDA-MB-361細(xì)胞系分離自獲自乳腺癌患者的腦轉(zhuǎn)移灶(腺癌)。MDA-MB-468細(xì)胞系分離自患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的女性癌癥患者的胸膜腔積液。MDA-MB-231細(xì)胞系獲自乳腺胸膜腔積液腺癌?？蓪CF-10F和MCF-10A細(xì)胞系用作正常對(duì)照。這些細(xì)胞系獲自患有纖維囊性疾病的患者的乳房腺體(乳腺)。這些是上皮唾液粘蛋白陽(yáng)性的非致瘤上皮細(xì)胞系?；蛘?，可將衍生自正常乳腺的人細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(購(gòu)自BoWhittaker Inc)用作正常對(duì)照?？设b別獲自這些乳腺癌細(xì)胞系的寡糖標(biāo)記，測(cè)定乳腺癌和卵巢癌特異性的寡糖標(biāo)記。同樣地，可用一系列不同的寡糖標(biāo)記來(lái)區(qū)分乳腺癌和卵巢癌。
實(shí)施例8.對(duì)獲自人血清的寡糖的鑒別本實(shí)施例舉例說(shuō)明了獲自正常個(gè)體和具有低CA 125水平(組I)、高CA 125水平(組II和III)、極高CA 125水平(Lim 6)的個(gè)體的血清的寡糖的鑒別。
圖13顯示了用20％乙腈從PGC柱洗脫的獲自正常樣品(A)、組III樣品(B)和Lim 6樣品(C)的O-連接寡糖的陽(yáng)離子模式部分的質(zhì)譜。用NaBH4/NaOH處理釋放O-連接寡糖，并可將其分類(lèi)為中性、唾液酸化(NeuAc)、NeuGc或硫酸化寡糖。在各樣品的分析中加入內(nèi)標(biāo)(m/z1040)。
圖14顯示了在正常(A)、組I(B)、組II(C)、組III(D)和Lim 6(E)血清樣品中鑒別的各類(lèi)O-連接寡糖的百分比。圖14A和圖14B的比較揭示了組I樣品中含NeuGc的寡糖與含NeuAc的寡糖的比值提高。然而，組I樣品中硫酸化寡糖百分比下降。組I樣品獲自低CA 125水平(指示早期卵巢癌)的個(gè)體。圖14A與圖14C和14D的比較也揭示了組II和組III樣品中類(lèi)似的NeuGc/NeuAc寡糖比提高和硫酸化寡糖百分比的下降。組II和組III樣品獲自高CA 125水平(指示晚期卵巢癌)的個(gè)體。另外，圖14A與圖14E的比較揭示了Lim 6樣品中類(lèi)似的NeuGc/NeuAc寡糖比提高和硫酸化寡糖百分比的下降。Lim 6樣品獲自極高CA 125水平的個(gè)體。
實(shí)施例9.卵巢癌特異性寡糖標(biāo)記的鑒別本實(shí)施例舉例說(shuō)明了低CA 125水平(組I)、高CA 125水平(組II和III)或極高CA 125水平(Lim 6)個(gè)體中特異性的寡糖標(biāo)記的鑒別。
表5顯示了對(duì)組I、組II/III和Lim 6特異性的硫酸化O-連接寡糖標(biāo)記的m/z比。此類(lèi)標(biāo)記在正常個(gè)體中不存在。例如，組I樣品(即伴隨早期卵巢癌的低CA 125水平)的指示是存在m/z比為981、1006、1038、1119和1468的硫酸化寡糖標(biāo)記而不存在m/z比為510和1168的硫酸化寡糖標(biāo)記。然而，組II/III樣品(即伴隨晚期卵巢癌的高CA 125水平)的指示是所有上述硫酸化寡糖標(biāo)記的存在。Lim 6樣品(即極高CA 125水平)的指示是僅m/z比為1006的硫酸化寡糖標(biāo)記的存在。表6顯示了表5所述各硫酸化寡糖標(biāo)記的寡糖組成、分子量和實(shí)測(cè)質(zhì)量。圖15顯示了用串聯(lián)Ms測(cè)定的這些硫酸化寡糖標(biāo)記中的4種寡糖標(biāo)記基本結(jié)構(gòu)。同樣地，可將硫酸化O-連接寡糖標(biāo)記的模式用于測(cè)定個(gè)體的CA125水平和卵巢癌的階段。
表5.卵巢癌特異性的硫酸化O-連接寡糖標(biāo)記
″+″表示該標(biāo)記存在。″-″表示該標(biāo)記不存在。″正常(A)″表示由未患卵巢癌的4名婦女組成的組?！逭?B)″代表一名男性。
表6.卵巢癌特異的硫酸化O-連接寡糖標(biāo)記的組成寡糖組成分子量實(shí)測(cè)質(zhì)量
表7顯示了組I、組II/III和Lim 6特異性的含NeuAc的O-連接寡糖標(biāo)記的m/z。這些標(biāo)記在正常個(gè)體中不存在。例如，組I樣品(即伴隨早期卵巢癌的低CA 125水平)的指示是存在m/z比為721、908和1045的含NeuAc的寡糖標(biāo)記，而不存在m/z比為883、925和1566的含NeuAc的寡糖標(biāo)記。然而，組II/III樣品(即伴隨晚期卵巢癌的高CA 125水平)的指示是所有上述含NeuAc的寡糖標(biāo)記的存在。Lim 6樣品(即極高CA 125水平)的指示是僅m/z比為721、1045的含NeuAc的寡糖標(biāo)記的存在。表8顯示了表7所述各含NeuAc的寡糖標(biāo)記的寡糖組成、分子量和實(shí)測(cè)質(zhì)量。圖16顯示了用串聯(lián)Ms測(cè)定的這些含NeuAc的寡糖標(biāo)記中的4種寡糖標(biāo)記基本結(jié)構(gòu)。同樣地，可將含NeuAc的寡糖標(biāo)記模式用于測(cè)定個(gè)體的CA 125水平和卵巢癌的階段。
表7.卵巢癌特異性的含NeuAc的O-連接寡糖標(biāo)記
″+″表示該標(biāo)記存在。″-″表示該標(biāo)記不存在?！逭?A)″表示由未患卵巢癌的4名婦女組成的組。″正常(B)″代表一名男性。
表8.卵巢癌特異的含NeuAc的O-連接寡糖標(biāo)記的組成寡糖組成 分子量實(shí)測(cè)質(zhì)量
表9顯示了組I、組II/III和Lim 6特異性的含NeuGc的O-連接寡糖標(biāo)記的m/z。這些標(biāo)記在正常個(gè)體中不存在。例如，組I樣品(即伴隨早期卵巢癌的低CA 125水平)的指示是存在m/z比為899、981和1045的含NeuGc的寡糖標(biāo)記，而不存在m/z比為883、925和1628的含NeuGc的寡糖標(biāo)記。然而，組II/III樣品(即伴隨晚期卵巢癌的高CA 125水平)的指示是所有上述含NeuGc的寡糖標(biāo)記的存在。Lim 6樣品(即極高CA 125水平)的指示是僅m/z比為899、1045的含NeuGc的寡糖標(biāo)記的存在。表10顯示了表9所述各含NeuGc的寡糖標(biāo)記的寡糖組成、分子量和實(shí)測(cè)質(zhì)量。圖17顯示了用串聯(lián)Ms測(cè)定的這些含NeuGc的寡糖標(biāo)記中的4種寡糖標(biāo)記的基本結(jié)構(gòu)。同樣地，可將含NeuGc的O-連接寡糖標(biāo)記模式用于測(cè)定個(gè)體的CA 125水平和卵巢癌的階段。
表9.卵巢癌特異性的含NeuGc的O-連接寡糖標(biāo)記
″+″表示該標(biāo)記存在?！?″表示該標(biāo)記不存在?！逭?A)″表示由未患卵巢癌的4名婦女組成的組?！逭?B)″代表一名男性。
表10.卵巢癌特異的含NeuGc的O-連接寡糖標(biāo)記的組成寡糖組成 分子量 實(shí)測(cè)質(zhì)量
表11顯示了組I、組II/III和Lim 6特異性的中性O(shè)-連接寡糖標(biāo)記的m/z。這些標(biāo)記在正常個(gè)體中不存在。例如，組I樣品(即伴隨早期卵巢癌的低CA 125水平)的指示是存在m/z比為741、756、855、1018、1024、1040、1107和1243的中性寡糖標(biāo)記，而不存在m/z比為538、862、1262、1431和1487的中性寡糖標(biāo)記。然而，組II/III樣品(即伴隨晚期卵巢癌的高CA 125水平)的指示是所有上述中性寡糖標(biāo)記的存在。Lim 6樣品(即極高CA 125水平)的指示是僅m/z比為855、1040和1107的中性寡糖標(biāo)記的存在。表12顯示了表11所述各中性寡糖標(biāo)記的寡糖組成、分子量和實(shí)測(cè)質(zhì)量。圖18顯示了用串聯(lián)Ms測(cè)定的這些中性寡糖標(biāo)記中的3種寡糖標(biāo)記的基本結(jié)構(gòu)。同樣地，可將中性O(shè)-連接寡糖標(biāo)記模式用于測(cè)定個(gè)體的CA 125水平和卵巢癌的階段。
表11.卵巢癌特異性的中性O(shè)-連接寡糖標(biāo)記
″+″表示該標(biāo)記存在?！?″表示該標(biāo)記不存在?！逭?A)″表示由未患卵巢癌的4名婦女組成的組。″正常(B)″代表一名男性。
表12.卵巢癌特異的中性O(shè)-連接寡糖標(biāo)記的組成寡糖組成 分子量 實(shí)測(cè)質(zhì)量
實(shí)施例10.其它卵巢癌寡糖標(biāo)記的鑒別本實(shí)施例舉例說(shuō)明了患有卵巢癌的個(gè)體的其它特異性寡糖標(biāo)記的鑒別。
根據(jù)本發(fā)明的方法從人血清中獲得寡糖的MALDI-FTMS質(zhì)譜。表13顯示了所鑒別的含己糖(Hex)的O-連接寡糖標(biāo)記的實(shí)測(cè)質(zhì)量(m/z)和寡糖組成。圖19顯示了與Na+配位的這些寡糖的質(zhì)譜。
表13.卵巢癌特異性含Hex的O-連接寡糖標(biāo)記的組成實(shí)測(cè)質(zhì)量 寡糖組成
所有實(shí)測(cè)離子對(duì)應(yīng)于[M-H2O+Na]?！錒ex″＝己糖；″HexNAc″＝N-乙酰氨基己糖；″Hex*″＝乙酰己糖(即乙?；揎椀募禾?。
表14顯示了所鑒別的含己糖醛酸(HexA)的O-連接寡糖標(biāo)記的實(shí)測(cè)質(zhì)量(m/z)和寡糖組成。圖20顯示了這些寡糖的質(zhì)譜，其中用實(shí)心圓圈標(biāo)記的系列對(duì)應(yīng)于表14中的m/z616.9696、814.9582、1012.9677、1210.9767和1408.9649。這些寡糖與Na+配位。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可用鈉置換己糖醛酸中的氫原子以產(chǎn)生距離22個(gè)質(zhì)量單位的伴峰。
表14.卵巢癌特異性含HexA的O-連接寡糖標(biāo)記的組成系列號(hào) 實(shí)測(cè)質(zhì)量 寡糖組成
鄰近峰間的質(zhì)量差異精確等于帶有一個(gè)鈉的一個(gè)己糖醛酸(HexA)基團(tuán)(Δm＝198)。
將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)納入本文作為參考，就猶如明確而獨(dú)立地指出各單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被納入作為參考。雖然出于理解清晰的目的，已通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例的方式對(duì)上文中的發(fā)明進(jìn)行了描述，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的教導(dǎo)指明之下很顯然可對(duì)其進(jìn)行某些改變和改良而不脫離所附權(quán)利要求書(shū)的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種鑒別癌癥特異性寡糖的方法，所述方法包括(a)從測(cè)試樣品中選擇性釋放所述寡糖，其中所述測(cè)試樣品是獲自癌細(xì)胞系或患有癌癥的個(gè)體的樣品；(b)采用矩陣輔助激光解吸電離(MALDI)-傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)，從所述測(cè)試樣品中獲得所述寡糖的質(zhì)譜；以及(c)比較所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜和對(duì)照樣品的質(zhì)譜，其中通過(guò)所述測(cè)試樣品的質(zhì)譜中獨(dú)特的寡糖的存在鑒別所述癌癥特異性寡糖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述獨(dú)特的寡糖選自O(shè)-連接寡糖、N-連接寡糖、游離寡糖、或它們的組合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括對(duì)所述獨(dú)特的寡糖進(jìn)行紅外多光子解離(IRMPD)的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其還包括用糖苷外切酶消化所述獨(dú)特的寡糖的步驟。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌癥是腺癌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測(cè)試樣品是條件培養(yǎng)基或血清。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照樣品是獲自正常細(xì)胞系或未患癌癥的個(gè)體的樣品。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照樣品是條件培養(yǎng)基或血清。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述獨(dú)特的寡糖是選自下組的O-連接寡糖硫酸化寡糖、含N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖、或它們的組合。
11.一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合于用權(quán)利要求1所述方法鑒別的獨(dú)特的寡糖。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體，其還包含與其連接的可檢測(cè)標(biāo)記。
13.一種在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求11所述的抗體。
14.一種在個(gè)體中確定癌癥株的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述樣品的質(zhì)譜與至少一種已知癌癥株的質(zhì)譜分布進(jìn)行比較，其中，通過(guò)所述樣品的質(zhì)譜與一種已知癌癥株的質(zhì)譜分布的相似性來(lái)確定所述癌癥株。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌癥株是卵巢癌株或乳腺癌株。
16.一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括檢測(cè)獲自所述個(gè)體的樣品中是否存在獨(dú)特的寡糖，其中所述獨(dú)特寡糖的存在指示所述個(gè)體患有癌癥。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述獨(dú)特的寡糖選自O(shè)-連接寡糖、N-連接寡糖、游離寡糖、或它們的組合。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)包括(a)采用MALDI-FTMS，獲得所述樣品的寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)確定所述質(zhì)譜中所述獨(dú)特的寡糖的存在。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)包括使所述樣品與特異性結(jié)合所述獨(dú)特寡糖的抗體接觸。
20.一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)將所述樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，所述樣品中含NeuGc的O-連接寡糖與含NeuAc的O-連接寡糖的比值高于所述對(duì)照樣品指示所述個(gè)體患有癌癥。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌癥是腺癌。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照樣品是獲自正常細(xì)胞系或未患癌癥的個(gè)體的樣品。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清。
25.一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)采用MALDI-FTMS，從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(a)將所述樣品的質(zhì)譜與對(duì)照樣品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，其中，所述樣品中硫酸化O-連接寡糖的百分比低于所述對(duì)照樣品指示所述個(gè)體患有癌癥。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述癌癥是腺癌。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照樣品是獲自正常細(xì)胞系或未患癌癥的個(gè)體的樣品。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清。
30.一種在個(gè)體中診斷癌癥的方法，所述方法包括(a)從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)確定在所述質(zhì)譜中是否存在選自下組的癌癥標(biāo)記硫酸化寡糖、含N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的寡糖、含N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的寡糖、中性寡糖、含己糖(Hex)的寡糖、含己糖醛酸(HexA)的寡糖、或它們的組合，其中，存在所述癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有癌癥。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述癌癥是腺癌。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述腺癌是卵巢癌或乳腺癌。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述硫酸化寡糖具有選自下組的組成1 HexNAc1 Hex1 SO3H；1 HexNAc3 Hex1 Fuc1 SO3H；2 HexNAc1Hex2 Fuc1 SO3H；2 HexNAc3Hex1 SO3H；4 HexNAc1 Hex1 SO3H；2HexNAc2 Hex2 Fuc1 SO3H；5 HexNAc1 Hex1 Fuc1 SO3H；或它們的組合。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述含NeuAc的寡糖具有選自下組的組成1 HexNAc1 Hex1 NeuAc；1 HexNAc2 Hex1 NeuAc；2HexNAc1 NeuAc1 Fuc；2 HexNAc1 Hex1 NeuAc；1 HexNAc3 Hex1NeuAc；3 HexNAc1 Hex1 NeuAc3 Fuc；或它們的組合。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述含NeuGc的寡糖具有選自下組的組成1 HexNAc1 Hex1 NeuGc1 Fuc；1 HexNAc2 Hex1 NeuGc；2 HexNAc1 NeuGc1 Fuc；3 HexNAc1 NeuGc；1 HexNAc2 Hex1 NeuGc1Fuc；3 HexNAc4 Hex1 NeuGc；或它們的組合。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述中性寡糖具有選自下組的組成1 HexNAc2 Fuc；2 HexNAc2 Fuc；2 HexNAc1 Hex1 Fuc；4 HexNAc；1 HexNAc2 Hex2 Fuc；4 HexNAc1 Hex；1 HexNAc3 Hex2 Fuc；1 HexNAc4 Hex1 Fuc；3 HexNAc1 Hex2 Fuc；2 HexNAc4 Hex1 Fuc；6 HexNAc；3HexNAc3 Hex2 Fuc；4 HexNAc3 Hex1 Fuc；或它們的組合。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述含Hex的寡糖具有選自下組的組成2 Hex；1 HexNAc1 Hex；3 Hex；1 HexNAc2 Hex；3 Hex1HexNAc；1 Hex*U2Hex1 HexNAc；4 Hex1 HexNAc；3 Hex2 HexNAc；1 Hex*2Hex2 HexNAc；4 Hex2 HexNAc；1 Hex*3 Hex2 HexNAc；5 Hex2 HexNAc；4 Hex3 HexNAc；5 Hex3 HexNAc；1 Hex*4 Hex3 HexNAc；2 Hex*3 Hex1 HexNAc；或它們的組合。
39.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述含HexA的寡糖具有選自下組的組成m/z221+[HexA]1；m/z221+[HexA]2；m/z221+[HexA]3；m/z221+[HexA]4；m/z221+[HexA]5；m/z221+[HexA]6；m/z221+[HexA]7；m/z361+[HexA]1；m/z361+[HexA]2；m/z361+[HexA]3；m/z361+[HexA]4；m/z361+[HexA]5；m/z361+[HexA]6；m/z551+[HexA]1；m/z551+[HexA]2；m/z551+[HexA]3；m/z551+[HexA]4；m/z551+[HexA]5；m/z555+[HexA]1；m/z555+[HexA]2；m/z555+[HexA]3；m/z604+[HexA]1；m/z604+[HexA]2；m/z604+[HexA]3；m/z604+[HexA]4；或它們的組合。
40.一種在個(gè)體中診斷癌癥的階段的方法，所述方法包括(a)從獲自所述個(gè)體的樣品中獲得寡糖的質(zhì)譜，其中已從所述樣品中選擇性地釋放出所述寡糖；以及(b)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在第一癌癥標(biāo)記，其中所述第一癌癥標(biāo)記選自1 HexNAc1 Hex1 NeuAc；2HexNAc1 NeuAc1 Fuc；1HexNAc3Hex1 NeuAc；1 HexNAc2 Hex1NeuGc；3 HexNAc1NeuGc；1 HexNAc2 Hex1 NeuGc1Fuc；1 HexNAc3 Hex1 Fuc1SO3H；2 HexNAc1 Hex2 Fuc1 SO3H；2 HexNAc3Hex；1 SO3H；4HexNAc1 Hex1 SO3H；5 HexNAc1 Hex1 Fuc1 SO3H；2HexNAc2 Fuc；2 HexNAc1 Hex1 Fuc；4 HexNAc；4 HexNAc1Hex；1 HexNAc3 Hex2 Fuc；1 HexNAc4 Hex1 Fuc；3 HexNAc1Hex2 Fuc；2 HexNAc4 Hex1 Fuc；或它們的組合；以及(c)測(cè)定在所述質(zhì)譜中是否存在第二癌癥標(biāo)記，其中所述第二癌癥標(biāo)記選自下組1 HexNAc2 Hex1 NeuAc；2 HexNAc1 Hex1NeuAc；3 HexNAc1 Hex1 NeuAc3 Fuc；1 HexNAc1 Hex1NeuGc1 Fuc； 2 HexNAc1 NeuGc1 Fuc；3 HexNAc4 Hex1NeuGc；1 HexNAc1 Hex1 SO3H；2 HexNAc2 Hex2 Fuc1 SO3H；1 HexNAc2 Fuc；1 HexNAc2 Hex2 Fuc；6 HexNAc；3 HexNAc3Hex2 Fuc；4 HexNAc3 Hex1 Fuc；或它們的組合，其中，存在所述第一癌癥標(biāo)記而不存在所述第二癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有早期癌癥，存在第二癌癥標(biāo)記指示所述個(gè)體患有晚期癌癥。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述早期癌癥是早期卵巢癌。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述早期卵巢癌與低CA 125水平相關(guān)。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述晚期癌癥是晚期卵巢癌。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述晚期卵巢癌與高CA 125水平相關(guān)。
45.一種癌癥標(biāo)記，其含有具有選自以下組成的O-連接寡糖1 HexNAc1Hex1 SO3H；1 HexNAc3 Hex1 Fuc1 SO3H；2 HexNAc1 Hex2 Fuc1 SO3H；2HexNAc3 Hex1 SO3H；4 HexNAc1 Hex1 SO3H；2 HexNAc2 Hex2 Fuc1SO3H；5 HexNAc1 Hex1 Fuc1 SO3H；1 HexNAc1 Hex1 NeuAc；1 HexNAc2Hex1 NeuAc；2 HexNAc1 NeuAc1 Fuc；2 HexNAc1 Hex1 NeuAc；1 HexNAc3Hex1 NeuAc；3 HexNAc1 Hex1 NeuAc3 Fuc；1 HexNAc1 Hex1 NeuGc1 Fuc；1 HexNAc2 Hex1 NeuGc；2 HexNAc1 NeuGc1 Fuc；3 HexNAc1 NeuGc；1HexNAc2 Hex1 NeuGc1 Fuc；3 HexNAc4 Hex1 NeuGc；1 HexNAc2 Fuc；2HexNAc2 Fuc；2 HexNAc1 Hex1 Fuc；4 HexNAc；1 HexNAc2 Hex2 Fuc；4HexNAc1 Hex； 1 HexNAc3 Hex2 Fuc；1 HexNAc4 Hex1 Fuc；3 HexNAc1Hex2 Fuc；2 HexNAc4 Hex1 Fuc；6 HexNAc；3 HexNAc3 Hex2 Fuc；4HexNAc3 Hex1 Fuc；2 Hex；1 HexNAc1 Hex；3 Hex；1 HexNAc2 Hex；3Hex1HexNAc；1 Hex*2 Hex1 HexNAc；4Hex1 HexNAc；3 Hex2 HexNAc；1 Hex*2Hex2 HexNAc；4 Hex2 HexNAc；1 Hex*3 Hex2 HexNAc；5 Hex2 HexNAc；4 Hex3 HexNAc；5 Hex3 HexNAc；1 Hex*4 Hex3 HexNAc；2 Hex*3 Hex1HexNAc；m/z 221+[HexA]1；m/z 221+[HexA]2；m/z 221+[HexA]3；m/z221+[HexA]4；m/z221+[HexA]5；m/z221+[HexA]6；m/z221+HexA]7；m/z361+[HexA]1；m/z361+[HexA]2；m/z361+[HexA]3；m/z361+[HexA]4；m/z361+[HexA]5；m/z361+[HexA]6；m/z551+[HexA]1；m/z551+[HexA]2；m/z551+[HexA]3；m/z551+[HexA]4；m/z551+[HexA]5；m/z555+[HexA]1；m/z555+[HexA]2；m/z555+[HexA]3；m/z604+[HexA]1；m/z604+[HexA]2；m/z604+[HexA]3；m/z604+[HexA]4；或它們的組合。
46.一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合權(quán)利要求45所述O-連接寡糖。
47.如權(quán)利要求46所述的抗體，其還包含與其結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記。
48.如權(quán)利要求47所述的抗體，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自下組熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、Cy2、Cy3、Cy5、生物素、辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶。
49.一種在需要癌癥治療的個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求46所述的抗體。
50.一種寡糖陣列，所述陣列包含固定于固相載體上的多種O-連接寡糖。
51.如權(quán)利要求50所述的陣列，其特征在于，所述固相載體選自紙、膜、濾器、芯片、針或玻璃。
52.一種在個(gè)體中診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含(a)權(quán)利要求50所述的陣列；(b)與所述陣列上所述多種O-連接寡糖特異性結(jié)合的多種抗體；以及(c)對(duì)獲自所述個(gè)體的樣品使用所述陣列和所述多種抗體的指導(dǎo)說(shuō)明書(shū)。
53.如權(quán)利要求52所述的試劑盒，其特征在于，所述多種抗體具有與其結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在個(gè)體中鑒別癌癥特異性寡糖的方法，以及用于在個(gè)體中確定癌癥株的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)在個(gè)體中是否存在特異性的癌癥標(biāo)記來(lái)診斷癌癥或癌癥的階段的方法，以及通過(guò)給予抗此類(lèi)標(biāo)記的抗體治療癌癥的方法。此外，本發(fā)明提供了含O－連接寡糖的癌癥標(biāo)記，以及用于診斷或治療癌癥的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK1973047SQ200580020529
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月22日
發(fā)明者C·B·萊布拉, H·J·安, K·S·蘭, S·米亞默托 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)